田麗梅,陳 菲,林炎麗,倪奎奎,楊富裕,2*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100193; 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

燕麥(AvenasativaL.)是全球重要的糧飼兼用作物之一[1],我國(guó)每年對(duì)燕麥草等優(yōu)質(zhì)飼草的需求為1.2億噸[2]。燕麥易于栽培,具有耐貧瘠、耐鹽堿、抗旱耐寒、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的特點(diǎn),在中國(guó)北部、西北部和西南部廣泛種植[3-4]。青貯飼料相較于干草飼料具有營(yíng)養(yǎng)流失少、易于長(zhǎng)期保存、適口性好、消化率較高等特點(diǎn)[5-6]。青貯飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值參數(shù)高效和準(zhǔn)確地測(cè)定是控制反芻動(dòng)物精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)的關(guān)鍵[7],傳統(tǒng)的青貯飼料品質(zhì)檢測(cè)會(huì)破壞樣品,檢測(cè)費(fèi)時(shí)、費(fèi)用昂貴,需要配置良好的設(shè)備和經(jīng)過培訓(xùn)的操作人員,不能即時(shí)獲知指標(biāo)數(shù)據(jù),對(duì)生產(chǎn)指導(dǎo)顯現(xiàn)出嚴(yán)重的滯后性[8-9]。因此,急需尋求高效、簡(jiǎn)便的現(xiàn)代分析技術(shù)來適應(yīng)生產(chǎn)快速檢測(cè)要求。

現(xiàn)代近紅外光譜(Near infrared spectroscopy,NIRS) 分析技術(shù)起源于上世紀(jì)50年代末期,目前已廣泛地用于農(nóng)業(yè)、食品、石化和制藥等領(lǐng)域[10]。Norris最早應(yīng)用近紅外光譜測(cè)定飼料中水分和蛋白質(zhì)含量[11],目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于飼料領(lǐng)域現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、精準(zhǔn)配料、批量檢測(cè)及在線分析等[12]。近紅外光譜能獲取絕大部分有機(jī)物組成性質(zhì)以及分子結(jié)構(gòu)的有效信息,在近紅外光譜范圍內(nèi),測(cè)量的主要是含氫基團(tuán)XH (X=C,N,O,S等) 振動(dòng)的倍頻及合頻吸收[13],青貯飼料的主要成分在近紅外區(qū)域都有該成分特有的吸收特性。在測(cè)定樣品時(shí)無前處理、無污染,可以快速、準(zhǔn)確地評(píng)估飼料的化學(xué)成分和相關(guān)的飼用價(jià)值屬性[14]。

青貯飼料與反芻動(dòng)物生長(zhǎng)性能及牧場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益關(guān)系密切,其原料來源廣泛,品質(zhì)會(huì)受牧草品種、收獲時(shí)的成熟階段、氣候條件、收獲技術(shù)、添加劑的類型和青貯的方法等影響[15-16]。因此,探索能夠滿足實(shí)際生產(chǎn)需要精準(zhǔn)度,且能適用于不同地域、不同品質(zhì)、飼草品種等未知場(chǎng)景的飼草青貯品質(zhì)近紅外光譜預(yù)測(cè)模型,具有重要的意義。本研究選取燕麥飼草青貯樣品,掃描干燥樣品和新鮮樣品近紅外光譜,討論燕麥飼草青貯樣品狀態(tài)對(duì)建模的影響,建立燕麥飼草青貯品質(zhì)評(píng)估近紅外模型,旨在為飼草生產(chǎn)提供一種高效分析品質(zhì)的方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

2020-2021年于四川成都、內(nèi)蒙古呼和浩特、河北張家口、甘肅張掖、江蘇揚(yáng)州、貴州遵義、山東濟(jì)南地區(qū)(表1)采集乳熟期的全株燕麥飼草,通過不同晾曬時(shí)間、發(fā)酵溫度、添加劑種類和青貯時(shí)間的處理,制作青貯樣本。對(duì)照組為刈割后直接青貯并常溫儲(chǔ)藏。不同的晾曬處理為分別為自然晾曬2 h,4 h,6 h。不同的溫度處理設(shè)4個(gè)水平,為5℃,15℃,25℃,30℃,置于恒溫培養(yǎng)箱保存。添加劑處理設(shè)3個(gè)水平,分別為植物乳桿菌、纖維素酶、植物乳桿菌+纖維素酶。全株燕麥刈割后立即用鍘刀將材料切割至2～3 cm,充分混勻,每300 g原料裝入聚乙烯袋青貯袋(28 cm×35 cm),真空密封,青貯30天、60天和90天,3個(gè)重復(fù),共273個(gè)樣品。

表1 取樣地點(diǎn)信息Table 1 Information of the sampling site

1.2 化學(xué)參考值測(cè)定

開袋后,均勻混合青貯樣品。通過四分法取青貯樣品20 g,加入180 mL無菌鹽水,放置于4℃條件下浸提24 h。用濾紙過濾,得到浸提液,取部分浸提液于4℃,10 000 r·min-1,離心5 min。上清液通過0.22 μm微孔濾膜過濾用于有機(jī)酸(乳酸,乙酸,丁酸)和氨態(tài)氮含量分析。氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸比色法測(cè)定[17],有機(jī)酸含量通過高效液相色譜測(cè)定[18](色譜柱:KC-811column,Shimadzu,日本。檢測(cè)器:SPD-M10AVP。流動(dòng)相:3 mmol·L-1高氯酸,流速1 mL·min-1。柱溫50℃,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,進(jìn)樣量5 μL)。

取燕麥青貯樣品約250 g,放置于65℃烘箱中烘干至恒重后,測(cè)定干物質(zhì)含量,然后使用粉碎機(jī)粉碎并過1 mm篩,粉碎樣品用來測(cè)定可溶性碳水化合物、粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。采用蒽酮硫酸法測(cè)定可溶性碳水化合物含量[19];粗蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定[20];中性和酸性洗滌纖維含量采用范氏法進(jìn)行測(cè)定[20]。

1.3 光譜采集

光譜的采集與化學(xué)參考值的測(cè)定同時(shí)進(jìn)行,新鮮樣品的光譜在青貯開袋時(shí)進(jìn)行采集,250 g樣品經(jīng)烘干粉碎過篩后,掃描獲得干燥樣品光譜。實(shí)驗(yàn)儀器為意大利Grainit.S.L公司生產(chǎn)的GraiNit AuroraNir (DA)型便攜式近紅外光譜儀:光譜范圍為950～1 650 nm,每2 s掃描2次,每個(gè)樣品重復(fù)裝樣掃描4次,自動(dòng)記錄平均光譜為試驗(yàn)光譜。環(huán)境條件為:溫度10～30℃,濕度30～70%,掃描樣品均在儀器配套的樣品采集盒內(nèi)進(jìn)行。

1.4 近紅外光譜校準(zhǔn)模型的開發(fā)和驗(yàn)證

近紅外光譜分析過程利用UCAL軟件(美國(guó)Unity科學(xué))進(jìn)行光譜預(yù)處理及回歸分析等處理。光譜預(yù)處理選取標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換+去趨勢(shì),多元色散校正+去趨勢(shì),一階導(dǎo)數(shù)+去趨勢(shì),標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換+多元色散校正+去趨勢(shì)+一階導(dǎo)數(shù)四種方式進(jìn)行數(shù)學(xué)處理,以交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差(Standard error of cross-validation,SECV)為考察指標(biāo),比較分析四種方法的定量分析結(jié)果,確定最小SECV所對(duì)應(yīng)的方法為最優(yōu)光譜預(yù)處理方法。在進(jìn)行PLS回歸之前,對(duì)所有光譜數(shù)據(jù)集執(zhí)行主成分分析(Principal component analysis,PCA),以識(shí)別和去除光譜異常值,異常樣品的判斷以標(biāo)準(zhǔn)馬氏距離(GD值)為考察指標(biāo),當(dāng)GD值>3時(shí)判定該樣品異常并予以剔除,然后將樣品按照4∶1比例隨機(jī)分為校正集和驗(yàn)證集,校正集用于開發(fā)回歸模型,驗(yàn)證集用于評(píng)估已建立模型的性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜特征

由圖1燕麥飼草青貯新鮮和干燥樣品的近紅外光譜可知,燕麥飼草青貯新鮮、干燥樣品近紅外光譜具有相同的吸光度帶,且表現(xiàn)出相似趨勢(shì),在950～1 650 nm范圍內(nèi)具有較強(qiáng)吸收峰,但吸收程度不同,燕麥飼草青貯新鮮樣品比干燥樣品光譜波動(dòng)變化更大,兩者都在1 150～1 200 nm,1 400～1 500 nm處有較強(qiáng)的吸收峰,1 350～1 400 nm處有較弱的吸收峰;新鮮樣品光譜圖中 960～1 000 nm有較強(qiáng)的吸收峰,而干燥樣品光譜圖中沒有出現(xiàn)吸收峰。

圖1 青貯燕麥飼草近紅外光譜Fig.1 The Near-infrared spectrum of oat silage注:(a) 新鮮樣品;(b) 烘干樣品Note:(a) Fresh sample;(b) Died sample

2.2 化學(xué)成分參考值的描述性統(tǒng)計(jì)

表2顯示了用于近紅外建模的燕麥飼草青貯校正集和驗(yàn)證集含水量、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗蛋白、可溶性碳水化合物、粗脂肪、氨態(tài)氮、乳酸、乙酸和丁酸含量平均值、最大值、最小值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)的描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果。校正集和驗(yàn)證集樣品的化學(xué)成分含量描述性統(tǒng)計(jì)量基本一致,驗(yàn)證集的范圍在校正集記錄的范圍內(nèi),且所有成分濃度范圍較廣,為構(gòu)建預(yù)測(cè)模型提供了足夠的范圍。

表2 燕麥青貯飼料校正集和驗(yàn)證集樣品營(yíng)養(yǎng)成分含量范圍(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 The range in nutrient content of oat silage samples in the calibration and validation sets (DM basis)

2.3 燕麥飼草青貯校正模型

表3 燕麥飼草青貯校正模型(新鮮樣品)Table 3 Calibration models of forage oat silage (Fresh sample)

表4 燕麥飼草青貯校正模型(干燥樣品)Table 4 Calibration models of forage oat silage (Dried sample)

2.4 模型預(yù)測(cè)性能評(píng)價(jià)

圖2 燕麥飼草青貯發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分近紅外預(yù)測(cè)值和參比值散點(diǎn)圖(新鮮樣品)Fig.2 Analyzed value vs. predicted value of fermentation quality and nutrient content (Fresh sanple)

表5 燕麥飼草青貯營(yíng)養(yǎng)成分的預(yù)測(cè)結(jié)果(新鮮樣品)Table 5 Prediction results of nutrient content of oat silage (Fresh sample)

圖3 燕麥飼草青貯發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分近紅外預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值散點(diǎn)圖(干燥樣品)Fig.3 Analyzed value vs. Predicted value of fermentation quality and nutrient content (Dried sample)

表6 燕麥飼草青貯營(yíng)養(yǎng)成分的預(yù)測(cè)結(jié)果(干燥樣品)Table 6 Prediction results of nutrient content of oat silage (Dried sample)

3 討論

4 結(jié)論

本研究建立了燕麥飼草青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的近紅外光譜快速檢測(cè)模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干燥樣品比新鮮樣品的近紅外快速檢測(cè)模型具有更高的預(yù)測(cè)精度;青貯發(fā)酵品質(zhì)的預(yù)測(cè)精度未達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)要求,需要進(jìn)一步研究升級(jí)模型,提高其實(shí)際應(yīng)用能力。本研究為便攜式近紅外光譜儀現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)燕麥青貯品質(zhì)提供了理論支撐。