李家興,周麗瑩,苑 峰,劉亞玲,欒雅琳,晁躍輝*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院,北京 100083; 2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院,北京 100081;3.內(nèi)蒙古草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

HB1基因?qū)儆谕串愋院?Homeobox,HB)蛋白家族,它含有典型的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu),由同源異型域(Homeodomain,HD)與亮氨酸拉鏈(Leucine Zipper,LZ)結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成。它們之間形成的穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)及兩者之間的相互作用共同決定了該類蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的功能,如DNA結(jié)合特異性、信號傳導(dǎo)、生物和非生物脅迫的調(diào)控誘導(dǎo)等[1-2]。Sessa等[3]通過HD-Zip蛋白與DNA結(jié)合的方法,從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中分離了第一個(gè)HD-Zip I亞族轉(zhuǎn)錄因子AtHB1,發(fā)現(xiàn)其主要參與植物葉片發(fā)育及植物對脅迫的應(yīng)答。隨后,HB1基因在向日葵(Helianthusannuus)[4]、棉花(Gossypiumspp)[5]、玉米(Zeamays)[6]、大麥(Hordeumvulgare)[7]、黃花苜蓿(Medicagofalcata)[8]等多種植物中相繼被發(fā)現(xiàn)并開展了相關(guān)的研究。向日葵在低溫的條件下誘導(dǎo)并積累HaHB1蛋白質(zhì),通過提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性來抵御低溫脅迫[4]。在干旱、鹽脅迫條件下,棉花通過提高GhHB1基因的表達(dá),參與ABA生物合成,提高了植物ABA含量,進(jìn)而增強(qiáng)了植物對干旱和高鹽的抵抗能力[5]。HB1轉(zhuǎn)錄因子可以抑制轉(zhuǎn)基因蒺藜苜蓿的發(fā)育,通過減少根系表面暴露進(jìn)而提高植物耐鹽性[9]。而紫花苜蓿研究發(fā)現(xiàn),紫花苜蓿MsHB7基因能夠通過降低ABA響應(yīng)基因(MsABI1和MsSnRK2.6)和抗氧化酶編碼基因(MspxdC和MsCatalase4)的表達(dá),進(jìn)而降低紫花苜蓿耐鹽性[10]。

作為一種優(yōu)質(zhì)的豆科牧草植物,紫花苜蓿營養(yǎng)價(jià)值豐富,粗蛋白含量高,含有多種維生素和微量元素等,適合作為飼料喂養(yǎng)家畜,增加畜產(chǎn)品產(chǎn)量[11-12]?，F(xiàn)在土地季節(jié)性干旱、土壤中鹽堿含量過高等問題嚴(yán)重限制了紫花苜蓿的種植,影響了紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)[13-14]。因此,深入探索并發(fā)掘抗逆響應(yīng)基因、通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高抗逆能力的紫花苜蓿新品系,已成為紫花苜蓿分子育種的一個(gè)重要途徑。植物激素脫落酸是植物響應(yīng)脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要成員,對植物生長發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)起到調(diào)節(jié)作用,如抑制生長和抵抗逆境等方面[15]。楊躍霞等[16]研究證明了外源ABA可以增強(qiáng)紫花苜蓿耐鹽性。同時(shí),李波等[17]研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫的條件下,通過外施ABA可以降低紫花苜蓿幼苗的ROS積累,提高抗氧化酶活性。魏天嬌等[18]發(fā)現(xiàn)ABA積累能夠誘導(dǎo)鹽脅迫相關(guān)基因的表達(dá),從而提高紫花苜蓿對鹽堿脅迫的耐受性。王英哲等[19]研究發(fā)現(xiàn),通過外施ABA可以提高紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的可溶性糖和游離脯氨酸的含量,提高紫花苜蓿的耐寒性。因此,通過噴施外源ABA在紫花苜蓿抗旱、抗鹽和抗寒等生理過程中起著重要作用。

本文成功克隆紫花苜蓿MsHB1基因,進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,原核表達(dá)及基因表達(dá)特征分析。探討紫花苜蓿MsHB1基因時(shí)空差異、激素誘導(dǎo)或鹽脅迫下表達(dá)特征,為后續(xù)研究MsHB1基因的功能提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、試劑及儀器

本試驗(yàn)的紫花苜蓿品種為保定苜蓿,保存于北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院實(shí)驗(yàn)室;基質(zhì)為草炭、蛭石、珍珠巖,體積比為3∶3∶1,光周期為14 h/10 h(日/夜),溫度為24℃,濕度為64%。大腸桿菌BL21、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購于天根生化科技(北京)有限公司;克隆載體pMD19-T、原核表達(dá)載體pCold-Sumo2、植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、PrimeSTAR MAX及限制性內(nèi)切酶購于TaKaRa公司;DL5000 DNA Marker購于湖南艾科瑞生物工程有限公司;彩色預(yù)染蛋白Marker(10～170 kD)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司?？贵wAnti-strep tag Ⅱ mouse monoclonal antibody和HRP-conjugated goat Anti-mouse IgG購于生工生物工程(上海)股份有限公司;植物激素ABA、6-BA、GA3和IAA購于Sigma公司。水平電泳儀(Wide Mini-Sub Cell GT Cell)、凝膠電泳成像系統(tǒng)(ChemiDocTMXRS+System)和超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(ChemiDocTMImaging System)均購于Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1MsHB1基因克隆 收集成熟期紫花苜蓿葉片,置于研缽中,加入液氮充分研磨,使用植物總RNA提取試劑盒提取紫花苜蓿總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到第一鏈cDNA。以紫花苜蓿cDNA為模板,MsHB1-F和MsHB1-R為引物,利用PrimeSTAR MAX進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因,程序?yàn)?8℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后,連接至克隆載體pMD19-T。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定,將含有正確條帶的單克隆菌落送至北京睿博興科生物公司測序,對測序結(jié)果進(jìn)行比對和分析,將測序正確的克隆載體命名為pMD-HB1。

1.2.2引物設(shè)計(jì) 基于公布的紫花苜蓿基因組數(shù)據(jù)[20],通過軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。其中,MsHB1-F和MsHB1-R用于MsHB1基因克隆,pCold-HB1-F和pCold-HB1-R用于原核表達(dá)載體構(gòu)建,MsHB1-RT-F和MsHB1-RT-R用于MsHB1基因熒光定量檢測,MsActin-F和MsActin-R用于內(nèi)參基因Actin熒光定量檢測。

1.2.3MsHB1生物信息學(xué)分析 通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對MsHB1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析預(yù)測,通過SOPMA(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)和Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)分別對MsHB1蛋白進(jìn)行二級、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,根據(jù)ExPASy數(shù)據(jù)庫(http://expasy.org/)進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析。采用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測,利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過TMHMM-2.0網(wǎng)址(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測,在Cell-PLoc網(wǎng)站上(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.4MsHB1原核表達(dá)載體構(gòu)建 使用質(zhì)粒小提試劑盒提取pMD-HB1質(zhì)粒,以質(zhì)粒為模板,pCold-HB1-F和pCold-HB1-R為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,程序?yàn)?8℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,將純化后的PCR產(chǎn)物連接至限制性內(nèi)切酶NcoI處理后的原核表達(dá)載體pCold-Sumo2。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,涂在含有氨芐青霉抗性的LB固體培養(yǎng)基上。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定,將含有正確條帶的單克隆菌落送至生物公司測序,將測序正確的質(zhì)粒命名為pCold-HB1。

1.2.5MsHB1蛋白原核表達(dá) 挑取含有pCold-HB1單克隆菌落,搖菌培養(yǎng)至OD600= 0.6,分別加入終濃度為0.1,0.2,0.5 mmol·L-1的IPTG,14℃低溫誘導(dǎo)14 h。將大腸桿菌樣品,使用離心機(jī)5 000 r·min-1離心10 min,棄掉上清,加入5 mL的1×PBS(pH=7.4)充分重懸菌液。吸取100 μL重懸菌液,混入20 μL的8 mol·L-1尿素溶液,99℃加熱10 min后,將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后,使用考馬斯亮藍(lán)染色。為分離可溶性蛋白和非可溶性蛋白,利用細(xì)胞破碎儀,設(shè)置功率60%,破碎15 min,使用離心機(jī)12 000 rpm分離出上清和沉淀。將收集的上清與沉淀樣品,經(jīng)SDS-PAGE電泳后,使用考馬斯亮藍(lán)染色,分析蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。對SDS-PAGE電泳后的樣品,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,以Anti-strep tag Ⅱ mouse monoclonal antibody單克隆抗體為一抗,HRP-conjugated goat Anti-mouse IgG為二抗,進(jìn)行WB分析,使用超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行拍照觀察。

1.2.6MsHB1表達(dá)分析 為分析不同組織及發(fā)育階段的MsHB1基因表達(dá)水平,選取長勢一致的紫花苜蓿植株,選取根、莖、葉三個(gè)組織部位,成熟和衰老葉片;100 mmol·L-1的NaCl溶液處理紫花苜蓿樣品,用于分析MsHB1基因鹽脅迫響應(yīng);為了分析不同激素對MsHB1表達(dá)的影響,對紫花苜蓿植株分別噴施50 μmol·L-1ABA、10 μmol·L-16-BA、50 μmol·L-1GA3、10 μmol·L-1IAA,并在0,0.5,1,2,4,6,8,12,24 h這9個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣。將收集的樣品液氮速凍處理后放至-80℃冰箱儲存。使用植物總RNA提取試劑盒對樣品進(jìn)行總RNA提取,并反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。以MsHB1-RT-F和MsHB1-RT-R為引物,MsActin為內(nèi)參基因,進(jìn)行熒光定量PCR檢測。所有樣品均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),根據(jù)2-△△Ct法[21]使用EXCEL 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)初步處理并作圖,使用SPSS (26.0)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsHB1基因克隆

以紫花苜蓿cDNA為模板,MsHB1-F和MsHB1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,在750～1 000 bp位置存在一條單一、清晰DNA條帶(圖1)。將上述產(chǎn)物,送至生物公司測序,測序結(jié)果顯示:該DNA含有完整的紫花苜蓿MsHB1基因編碼區(qū)。將該DNA序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列后顯示:紫花苜蓿MsHB1與蒺藜苜蓿MtHB1蛋白質(zhì)的氨基酸序列有高達(dá)99%的相似,僅有一個(gè)氨基酸的差異(圖2)。

圖1 紫花苜蓿MsHB1基因的克隆Fig.1 Cloning of MsHB1 gene from alfalfa注:M,MB5000 DNA Marker;1,MsHB1基因Note:M,MB5000 DNA Marker;1,MsHB1 gene

圖2 蒺藜苜蓿與紫花苜蓿HB1的氨基酸序列對比Fig.2 Comparison of amino acid sequences of HB1 between Medicago truncatla and alfalfa

2.2 生物信息學(xué)分析

MsHB1基因編碼區(qū)為864 bp,共編碼288個(gè)氨基酸(圖3A),MsHB1蛋白的分子式為C1442H2244N398O471S12,分子量為47.654 KDa,理論等電點(diǎn)為4.77。根據(jù)保守域結(jié)構(gòu)分析可知HB1屬于HD-ZIP家族,在65位到120位氨基酸之間含有Homebox的保守結(jié)構(gòu)域(圖3B)。MsHB1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析顯示:其蛋白含有39.93%的α-螺旋和4.86%的β-轉(zhuǎn)角(圖3C);蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)分析顯示:其蛋白質(zhì)主要由自由螺旋和環(huán)構(gòu)成(圖3D)。蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測顯示,MsHB1蛋白無信號肽,亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示,MsHB1定位于細(xì)胞核。MsHB1蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為69.35,推測其為不穩(wěn)定蛋白,平均親水指數(shù)為-0.755,推測其為親水性蛋白。利用MEGA7.0 軟件系統(tǒng)繪制不同植物的HB1蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果顯示紫花苜蓿HB1蛋白與蒺藜苜蓿同源蛋白親緣關(guān)系最近(圖4),其次是紅三葉(Trifoliumpratense)。

圖3 紫花苜蓿MsHB1序列及結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Sequence and structure analysis of MsHB1 from alfalfa注:(A)MsHB1基因DNA序列和氨基酸序列;(B)MsHB1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測;(C)MsHB1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;(D)MsHB1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Note:(A) DNA and protein sequences of MsHB1 gene;(B) Prediction of conservation domain of MsHB1;(C) Secondary structure prediction of MsHB1 protein;(D) Tertiary structure prediction of MsHB1 protein

圖4 MsHB1蛋白進(jìn)化樹分析Fig.4 Evolutionary tree analysis of MsHB1 proteins

2.3 MsHB1

將含有pCold-HB1質(zhì)粒的大腸桿菌BL21,涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上。挑取固體培養(yǎng)基上生長大小一致的單克隆菌落,引物為pCold-2f和pCold-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測所選大腸桿菌均能擴(kuò)增出目標(biāo)大小的DNA條帶(圖5)。經(jīng)生物公司測序顯示:該載體含有正確序列的MsHB1基因,無堿基突變、無移碼突變,表明MsHB1原核表達(dá)載體構(gòu)建成功,可以用于后續(xù)的試驗(yàn)。

圖5 pCold-HB1鑒定Fig.5 Identification of pCold-HB1注:M,MB5000 DNA Marker;1～3,pCold-HB1質(zhì)粒Note:M,MB5000 DNA Marker;1～3,pCold-HB1 plasmid

經(jīng)誘導(dǎo)后,提取大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物,經(jīng)SDS-PAGE電泳后,進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,發(fā)現(xiàn)使用三種不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后,大腸桿菌能夠表達(dá)一個(gè)約45KDa的蛋白,而未經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌不能表達(dá)該蛋白(圖6)。該結(jié)果初步顯示了紫花苜蓿MsHB1表達(dá)成功。

圖6 MsHB1蛋白誘導(dǎo)前后的SDS-PAGE檢測Fig.6 SDS-PAGE detection of MsHB1 protein before and after induction注:M,彩色預(yù)染Marker(10～170kD);1,未誘導(dǎo)蛋白;2,0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)蛋白;3,0.2 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)蛋白;4,0.5 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)蛋白;方框,目標(biāo)蛋白Note:M,colour pre-stained Marker (10～170kD);1,uninduced protein;2,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced protein;3,0.2 mmol·L-1 IPTG-induced protein;4,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced protein;Box,target protein

為分析表達(dá)的蛋白質(zhì)的可溶性,分別將誘導(dǎo)后的菌液樣品利用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎,分離上清和沉淀。經(jīng)SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色后,發(fā)現(xiàn)三種不同濃度的IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌中均存在淀有明顯的條帶對比,其沉淀中含有存在的目標(biāo)蛋白大約在45 KDa左右,0.1 mmol·L-1IT-PG與0.2 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1濃度相比,其對MsHB1的誘導(dǎo)能力更強(qiáng)(圖7,8)。

圖7 MsHB1蛋白誘導(dǎo)后沉淀SDS-PAGE檢測Fig.7 SDS-PAGE detection of precipitation for MsHB1 protein after induction注:M,彩色預(yù)染Marker(10～170kD);1,0.5 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)沉淀蛋白;2,0.2 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)沉淀蛋白;3,0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)沉淀蛋白;4,未誘導(dǎo)沉淀蛋白;方框,目標(biāo)蛋白Note:M,colour pre-stained Marker (10～170kD);1,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;2,0.2 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;3,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;4,uninduced precipitated protein;Box,target protein

圖8 MsHB1蛋白誘導(dǎo)后上清SDS-PAGE檢測Fig.8 SDS-PAGE of supernatant after induction of MsHB1 protein圖8:M,彩色預(yù)染Marker(10～170kD);1,未誘導(dǎo)上清蛋白;2,0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)上清蛋白;3,0.2 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)上清蛋白;4,0.5 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)上清蛋白;方框,目標(biāo)蛋白Fig.8:M,colour pre-stained Marker (10-170kD);1,uninduced supernatant protein;2,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced supernatant protein;3,0.2 mmol·L-1IPTG-induced supernatant protein;4,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced supernatant protein;Box,target protein

選IPTG表達(dá)量含量高的0.1 mmol·L-1IPTG沉淀誘導(dǎo)蛋白進(jìn)行Western Blot雜交檢測,0.1 mmol·L-1濃度下誘導(dǎo)的蛋白有條帶顯示(圖9),與SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果大小一致,0.1 mmol·L-1IPTG濃度下原核蛋白成功表達(dá)。

圖9 MsHB1蛋白原核表達(dá)的Western Blot檢測Fig.9 Western Blot detection of prokaryotic expression of MsHB1 protein注:1～2,0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)沉淀蛋白樣品;3,未誘導(dǎo)蛋白對照Note:1～2,0.1 mmol·L-1 IPTG induced precipitated protein samples;3,uninduced protein control

2.4 MsHB1不同組織及發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析

為分析MsHB1基因在紫花苜蓿根、莖、葉中的表達(dá)差異,對MsHB1進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測,MsHB1基因在根、莖、葉中均有表達(dá),而MsHB1基因在葉中表達(dá)水平略高,莖中表達(dá)水平最低(圖10)。

圖10 MsHB1基因不同組織的表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of MsHB1 gene in different tissues注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Notes:Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level.The same as below

收集不同發(fā)育時(shí)期紫花苜蓿葉片,進(jìn)行MsHB1熒光定量RT-PCR檢測,結(jié)果顯示:MsHB1在不同的葉片發(fā)育時(shí)期也存在差異,其中幼嫩葉片中的表達(dá)量最高,成熟和衰老葉片中的表達(dá)量低(圖11)。

圖11 MsHB1基因葉片不同發(fā)育階段的表達(dá)分析Fig.11 Expression analysis of MsHB1 gene in leaves at different developmental stages

2.5 MsHB1基因?qū)}脅迫及外施激素響應(yīng)

對不同鹽脅迫的樣品,進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析,結(jié)果顯示:經(jīng)過NaCl處理后,與未處理相比,紫花苜蓿中HB1基因的表達(dá)水平提升,其中,在6 h達(dá)到高峰,隨后逐漸下降,但經(jīng)24 h處理后,表達(dá)水平依為對照水平的1.85倍。因此,MsHB1基因參與NaCl脅迫應(yīng)答(圖12)。

圖12 紫花苜蓿MsHB1基因的鹽脅迫表達(dá)Fig.12 Expression of the MsHB1 gene in alfalfa under salt stress

對植物噴施不同激素,分別在不同時(shí)間點(diǎn)采樣,進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析,外源ABA使MsHB1基因的表達(dá)水平呈先上升趨勢,在6 h達(dá)到頂峰,之后基因表達(dá)量緩慢下降,與對照相比,MsHB1仍呈現(xiàn)較高水平,經(jīng)ABA處理24 h基因表達(dá)水平為對照的2.11倍(圖13A);外施GA3后4 h內(nèi),MsHB1基因表達(dá)變化并不顯著,但在6 h后開始呈現(xiàn)上升的趨勢,在12 h時(shí)短暫下降,與對照樣品相比仍具有一定的上升趨勢,在24 h后到達(dá)頂峰,是對照樣品的8倍(圖13 B);外源6-BA使MsHB1基因呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,但MsHB1表達(dá)水平變化并不太大,在4 h達(dá)到頂峰,僅為對照樣品的1.38倍,但在24 h表達(dá)水平最低,為對照樣品的0.34倍(圖13C);外源施加IAA使MsHB1短時(shí)間內(nèi)快速下降,隨后緩慢上升(圖13D)。

3 討論

植物在生長發(fā)育過程中可能會受到各種不利環(huán)境因素的影響,如干旱、低溫、高鹽等非生物因子脅迫。植物抗逆過程如其他生理過程一樣,當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí),植物能夠采取相應(yīng)的策略來應(yīng)對脅迫,在長期適應(yīng)環(huán)境中也演化出了相應(yīng)的一套復(fù)雜的防御網(wǎng)絡(luò)機(jī)制[22-23]。脫落酸在整合各種脅迫信號和調(diào)控下游脅迫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用,在生物和非生物脅迫過程中扮演著關(guān)鍵角色[24]。Lechner等[25]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中I類HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子ATHB6是ABA反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子,能夠通過與MATH-BTB蛋白直接結(jié)合,進(jìn)而引發(fā)蛋白泛素化過程。此外,Valde′s等[26]發(fā)現(xiàn)擬南芥中另外兩個(gè)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因ATHB7和ATHB12的轉(zhuǎn)錄調(diào)控依賴于2C型蛋白磷酸酶(PP2C)的活性,而PP2CS在ABA信號傳導(dǎo)過程中起著重要的調(diào)控作用,同時(shí),AtHB7和AtHB12蛋白的結(jié)合可以抑制編碼ABA受體基因的轉(zhuǎn)錄。為深入發(fā)掘HB1基因的功能及ABA調(diào)控HB1轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制提供基礎(chǔ),本試驗(yàn)成功構(gòu)建MsHB1- pCold-Sumo2載體,其與pET載體骨架相似,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá),通過Western Blot驗(yàn)證MsHB1蛋白表達(dá)成功,約為45 KDa左右。本研究與紫花苜蓿MsIPT和MsDREB1原核表達(dá)結(jié)果一致[27-28],為后續(xù)蛋白純化以及納米抗體的制作提供了抗原。

HD-ZIP的I類轉(zhuǎn)錄因子能夠參與逆境為脅迫或響應(yīng)激素誘導(dǎo),尤其響應(yīng)ABA信號,該家族的基因隨著ABA含量的變化而表達(dá)水平會發(fā)生變化[29-30]。通過生物信息學(xué)對MsHB1蛋白進(jìn)行分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知,紫花苜蓿MsHB1蛋白與蒺藜苜蓿同源蛋白親緣關(guān)系最近,其次是紅三葉。通過MsHB1表達(dá)分析可知,MsHB1在根莖葉中均有表達(dá),推測MsHB1基因在根、莖、葉中均能發(fā)揮作用,且參與了植物的生長發(fā)育。蒺藜苜蓿HDZip-I亞族轉(zhuǎn)錄因子HB1在主根和側(cè)根分生組織中表達(dá),通過參與根部分生組織中ABA和輔酶信號的復(fù)雜相互作用,進(jìn)而調(diào)控側(cè)根的生長[9],擬南芥AthHB1主要調(diào)控葉片的生長與發(fā)育[31],番茄LeHB1則參與調(diào)控花發(fā)育及果實(shí)成熟調(diào)控[32]。因此,進(jìn)一步說明在不同物種中的HB1的表達(dá)部位以及功能可能存在一定的差異性。在鹽脅迫和ABA的處理下,MsHB1表達(dá)量明顯提高,推測MsHB1可能參與鹽脅迫和ABA信號傳導(dǎo)進(jìn)程。這與HB1基因在棉花[5]、水稻[29]的表達(dá)模式下十分相似。此外,MsHB1可能參與其他激素途徑,如外源GA3,6-BA,IAA均能引起紫花苜蓿的MsHB1基因表達(dá)改變。本研究為此后關(guān)于MsHB1基因表達(dá)功能的研究提供了依據(jù),關(guān)于MsHB1深入的生物功能以及調(diào)控機(jī)制,需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

本研究克隆了紫花苜蓿MsHB1基因,MsHB1的開放閱讀框867 bp,編碼了288個(gè)氨基酸,利用原核體系成功表達(dá)出MsHB1蛋白;MsHB1基因在紫花苜蓿根莖葉中均有表達(dá),但莖的基因表達(dá)量低于根和葉的表達(dá)量;MsHB1參與ABA和NaCl的應(yīng)答過程,GA3的能夠提高M(jìn)sHB1表達(dá)水平,而6-BA、IAA則會降低MsHB1表達(dá),表明紫花苜蓿MsHB1基因參與多種激素信號傳導(dǎo)途徑。