汪國(guó)慶 林萃 呂曉萍 譚功軍 周玉球

遺傳代謝病是由于基因突變引起參與體內(nèi)代謝的酶、運(yùn)載蛋白、膜或受體缺陷, 導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂, 造成中間、旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏, 引發(fā)一系列臨床癥狀的一組疾?。?］。目前, 串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)發(fā)展成為早期發(fā)現(xiàn)和篩查遺傳代謝病的最重要的平臺(tái)之一, 越來(lái)越多的國(guó)家和地區(qū)采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒遺傳代謝病篩查。本研究旨在通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)珠海地區(qū)20364 例新生兒干血斑樣本中11 種氨基酸和31 種肉堿含量進(jìn)行檢測(cè), 并按納入標(biāo)準(zhǔn)篩選其中18542 例新生兒篩查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 建立珠海地區(qū)正常新生兒群體串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查42 項(xiàng)指標(biāo)的參考區(qū)間, 以期為本地區(qū)新生兒遺傳代謝病篩查提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 資料來(lái)源于2021 年1 月～2022 年12 月在珠海地區(qū)各分娩機(jī)構(gòu)出生的20364 例新生兒串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：足月、正常出生體重、出生后3～7 d 采血的健康新生兒。共篩選出18542 例新生兒, 其中男9814 例, 女8728 例。本研究通過(guò)珠海市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(2020112501), 所有篩查對(duì)象監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集出生72 h 后并充分哺乳的新生兒足跟血, 滴于S&S903 專(zhuān)用濾紙上制成血片, 按要求填寫(xiě)各項(xiàng)資料, 將血片懸空平置自然晾干, 裝入防潮避光袋密封保存于冰箱(2～8℃), 5 個(gè)工作日內(nèi)遞送至珠海市婦幼保健院進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 儀器和試劑 美國(guó)AB SCIEX API3200MD 串聯(lián)質(zhì)譜儀、PerkinElmer Puncher 9 全自動(dòng)打孔儀、杭州奧盛MB100-2A 恒溫孵育振蕩器, 試劑采用PerkinElmer公司生產(chǎn)的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒, S&S903 新生兒篩查專(zhuān)用濾紙由杭州杰毅麥特公司生產(chǎn)(浙杭械備20210259)。

1.2.3 檢測(cè)方法 嚴(yán)格按照PerkinElmer 非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用Puncher 9 打孔器取直徑 3 mm 的待測(cè)樣品和質(zhì)控品血斑置于 96 孔萃取板中；每孔加入100 μl 含有氨基酸、肉堿內(nèi)標(biāo)的工作液(以氨基酸、肉堿內(nèi)標(biāo)原液和萃取液按1∶108 比例配制)；用粘性膜覆蓋96 孔萃取板后上恒溫孵育振蕩器, 以45℃、650 r/min 的條件萃取45 min；取出萃取板恢復(fù)至室溫后, 轉(zhuǎn)移75 μl 萃取液至96 孔V 型板中, 用鋁箔紙覆蓋后上串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。

1.2.4 質(zhì)量控制 每塊96 孔檢測(cè)板均加入試劑盒自帶的兩個(gè)不同水平質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制, 保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；參加國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)量評(píng)價(jià), 成績(jī)均為合格。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 11 種氨基酸 包括丙氨酸(alanine, Ala)、精氨酸(arginine, Arg)、瓜氨酸(citrulline, Cit)、甘氨酸(glycine,Gly)、亮氨酸(leucine, Leu)、甲硫氨酸(methionine, Met)、鳥(niǎo)氨酸(ornithine, Orn)、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)、脯 氨 酸(proline, Pro)、酪 氨 酸(tyrosine, Tyr)、纈 氨 酸(valine, Val)。

1.3.2 31 種肉堿 包括游離肉堿(free carnitine, C0)、乙酰肉堿(acetylcarnitine, C2)、丙酰肉堿(propionylcarnitine,C3)、丙二酰肉堿+3- 羥基丁酰肉堿(malonylcarn itine+3-hydroxy butyrylcarnitine, C3DC+C4OH)、丁酰肉堿(butyrylcarnitine, C4)、甲基丙二酰肉堿+3-羥基異戊酰肉堿(methylmalonylcarnitine+3-hydroxyisovalerylcarnitine,C4DC+C5OH)、異戊酰肉堿(isovalerylcarnitine, C5)、異戊烯酰肉堿(isopentenylcarnitine, C5:1)、戊二酰肉堿+3-羥基己酰肉堿(glutarylcarnitine+3-hydroxyhexanoyl carnitine, C5DC+C6OH)、己 酰 肉 堿(hexanoylcarnitine,C6)、己二酰肉堿( adipylcarnitine, C6DC)、辛酰肉堿(capryloylcarnitine, C8)、辛 烯 酰 肉 堿(octanoylcarnitine,C8:1)、癸酰肉堿(decanoylcarnitine, C10)、癸烯酰肉堿(decenoylcarnitine, C10:1)、癸二烯酰肉堿(decadienoylcarnitine, C10:2)、月桂酰肉堿(dodecanoylcarnitine,C12)、月 桂 烯 酰 肉 堿(dodecenoylcarnitine, C12:1)、肉豆蔻酰肉堿(tetradecanoylcarnitine, C14)、肉豆蔻烯酰肉堿(tetradecenoylcarnitine, C14:1)、肉豆蔻二烯酰肉堿(tetradecad ienoylcarnitine, C14:2)、3-羥基肉豆蔻烯酰 肉 堿(3-hydroxyl-tetradecanoylcarnitine, C14OH)、棕櫚 酰 肉 堿(hexadecan oylcarnitine, C16)、棕 櫚 烯 酰 肉堿(hexadecenoylcarnitine, C16:1)、3-羥基棕櫚酰肉堿(3-hydroxypalmitoylcarnitine, C16OH)、3- 羥 基 棕 櫚 烯酰 肉 堿(3-hydroxypalmitoleylcarnitine, C16:1OH)、十 八碳酰肉堿(octadecanoylcarnitine, C18)、十八碳烯酰肉堿(octadecenoylcarnitine, C18:1)、十八碳二烯酰肉堿(octadecadienoylcarnitine, C18:2)、3-羥基十八碳酰肉堿(3-hydroxystearoylcarnitine, C18OH)、3-羥基十八碳烯酰肉堿(3-hydroxyoleylcarnitine, C18:1OH)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示；采用Kolmogorov-Smirnovs(K-S)檢驗(yàn)正態(tài)分布, 百分位數(shù)法(P0.5～P99.5)建立參考區(qū)間, 摘要獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)比較珠海地區(qū)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)的差異,Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較珠海地區(qū)參考區(qū)間與上海新華醫(yī)院的差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒遺傳代謝病篩查結(jié)果 20364 例新生兒初篩陽(yáng)性687 例, 召回621 例, 確診遺傳代謝病7 例, 其中原發(fā)性肉堿缺乏癥2 例, citrin 蛋白缺乏癥、高甲硫氨酸血癥、甲基丙二酸血癥、中鏈?；o酶A 脫氫酶缺乏癥和極長(zhǎng)鏈?；o酶A 脫氫酶缺乏癥各1 例。氨基酸代謝病、有機(jī)酸代謝病、脂肪酸氧化障礙的發(fā) 病 率 分 別 為0.010%(1/10182)、0.005%(1/20364) 和0.020%(1/5091), 總發(fā)病率為0.034%(1/2909)。見(jiàn)表1。

表1 20364 例新生兒遺傳代謝病篩查結(jié)果(n, %)

2.2 11 種氨基酸和31 種肉堿參考區(qū)間的建立18542 例正常新生兒干血斑樣本中11 種氨基酸和31 種肉堿含量的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)K-S 檢驗(yàn)正態(tài)性, 結(jié)果均呈偏態(tài)分布, 故以百分位數(shù)法(P0.5～P99.5)統(tǒng)計(jì)出11 種氨基酸和31 種肉堿的參考區(qū)間。見(jiàn)表2。

2.3 11 種氨基酸和31 種肉堿檢測(cè)結(jié)果與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)測(cè)定結(jié)果比較 18542 例新生兒11 種氨基酸檢測(cè)結(jié)果與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果比較, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)； 18542 例新生兒31 種肉堿中除C5:1、C6、C8、C10:2、C14:2、C16OH、C16:1OH、C18OH、C18:1OH 等指標(biāo)外, 其余肉堿檢測(cè)結(jié)果與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果比較, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見(jiàn)表3。

表3 18542 例正常新生兒干血斑樣本中11 種氨基酸和31 種肉堿測(cè)定結(jié)果與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)測(cè)定結(jié)果比較( ±s, μmol/L)

指標(biāo) 本實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)# t P Ala 263.75±61.39a 374.53±114.18 -54.519 ＜0.001 Arg 5.61±4.51a 18.40±9.34 -77.317 ＜0.001 Cit 12.67±3.47a 16.67±5.62 -39.684 ＜0.001 Gly 452.91±112.89a 617.47±221.99 -41.763 ＜0.001 Leu 181.89±35.34a 167.96±42.98 17.640 ＜0.001 Met 21.04±4.63a 26.68±7.08 -44.244 ＜0.001 Orn 87.49±23.19a 153.36±68.70 -54.699 ＜0.001 Phe 48.36±9.49a 56.07±12.02 -35.059 ＜0.001 Pro 168.21±38.07a 234.25±63.72 -57.904 ＜0.001 Tyr 103.71±39.72a 118.60±44.97 -17.873 ＜0.001 Val 123.16±26.61a 165.41±42.51 -55.366 ＜0.001 C0 19.39±6.65a 21.92±7.05 -19.207 ＜0.001 C2 22.32±7.26a 19.74±7.15 18.903* ＜0.001

續(xù)表3

表3 18542 例正常新生兒干血斑樣本中11 種氨基酸和31 種肉堿測(cè)定結(jié)果與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)測(cè)定結(jié)果比較( ±s, μmol/L)

注：與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)比較, aP＜0.001；#：來(lái)源于試劑說(shuō)明書(shū)；*：方差齊性檢驗(yàn)中P＞0.05, 顯示方差齊, 選擇未校正t 值,其余結(jié)果方差不齊, 選擇校正t 值

指標(biāo) 本實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)# t P C3 1.76±0.67a 1.91±0.78 -10.415 ＜0.001 C3DC+C4OH 0.14±0.07a 0.10±0.05 39.663 ＜0.001 C4 0.20±0.07a 0.22±0.07 -15.163* ＜0.001 C4DC+C5OH 0.18±0.05a 0.20±0.06 -18.116 ＜0.001 C5 0.10±0.03a 0.13±0.06 -28.190 ＜0.001 C5:1 0.01±0.002 0.01±0.004 0 1 C5DC+C6OH 0.11±0.04a 0.12±0.05 -10.917 ＜0.001 C6 0.04±0.02 0.04±0.02 0* 1 C6DC 0.12±0.05a 0.09±0.04 38.205 ＜0.001 C8 0.06±0.02 0.06±0.02 0* 1 C8:1 0.08±0.03a 0.14±0.06 -56.38 ＜0.001 C10 0.09±0.04a 0.07±0.03 33.459 ＜0.001 C10:1 0.06±0.02a 0.05±0.02 26.536* ＜0.001 C10:2 0.01±0.003 0.01±0.01 0 1 C12 0.10±0.06a 0.08±0.04 24.326 ＜0.001 C12:1 0.06±0.05a 0.04±0.03 31.395 ＜0.001 C14 0.19±0.07a 0.18±0.06 8.612 ＜0.001 C14:1 0.10±0.06a 0.07±0.04 36.49 ＜0.001 C14:2 0.02±0.01 0.02±0.01 0* 1 C14OH 0.02±0.01a 0.01±0.01 53.071* ＜0.001 C16 3.51±1.24a 2.80±1.08 34.075 ＜0.001 C16:1 0.20±0.09a 0.16±0.08 26.016 ＜0.001 C16OH 0.02±0.01 0.02±0.01 0* 1 C16:1OH 0.04±0.01 0.04±0.02 0 1 C18 0.92±0.31a 0.77±0.26 29.682 ＜0.001 C18:1 1.40±0.39a 1.35±0.42 6.385 ＜0.001 C18:2 0.20±0.10a 0.27±0.13 -29.506 ＜0.001 C18OH 0.01±0.01 0.01±0.01 0* 1 C18:1OH 0.02±0.01 0.02±0.01 0* 1

2.4 珠海地區(qū)新生兒與上海新華醫(yī)院新生兒串聯(lián)質(zhì)譜參考區(qū)間比較 珠海地區(qū)新生兒各指標(biāo)參考區(qū)間上、下限與上海新華醫(yī)院新生兒各指標(biāo)參考區(qū)間［2］上、下限差值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn), 結(jié)果均呈偏態(tài)分布, 因此采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)與上海新華醫(yī)院參考區(qū)間進(jìn)行比較。珠海地區(qū)新生兒Ala、Gly、Leu、Orn、Phe、Tyr、Val、C0、C6DC 參考區(qū)間下限與新華醫(yī)院新生兒比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 珠海地區(qū)新生兒與上海新華醫(yī)院新生兒串聯(lián)質(zhì)譜參考區(qū)間比較(μmol/L)

3 討論

自1990 年串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)首次應(yīng)用于新生兒遺傳代謝病篩查以來(lái), 因其快速、高靈敏度、高通量等特點(diǎn), 在新生兒遺傳代謝病篩查領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用, 并取得了較好的效果［3］。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以在一次分析中篩查超過(guò)50 余種遺傳代謝病, 包括氨基酸代謝病、有機(jī)酸代謝病和脂肪酸氧化障礙等疾病［4］。雖然串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查單一病種檢出率較低, 但其總體檢出率相對(duì)較高, 且不同國(guó)家和地區(qū)存在差異［5,6］。本研究結(jié)果顯示, 珠海地區(qū)氨基酸代謝病的發(fā)病率為0.010%(1/10182), 有機(jī)酸代謝病的發(fā)病率為0.005%(1/20364), 脂肪酸氧化障礙的發(fā)病率為0.020%(1/5091)；總發(fā)病率為0.034%(1/2909), 與蘇州市的發(fā)病率0.034%(1/2910)［7］相近, 略低于廣州市發(fā)病率的0.041%(1/2451)［6］, 但稍高于全國(guó)平均水平的0.032%(1/3153)［8］。在疾病構(gòu)成比方面, 本組資料確診的脂肪酸氧化障礙占比最高, 達(dá)57.1% (4/7), 其次為氨基酸代謝異常, 占28.6%(2/7), 有機(jī)酸代謝異常最少,占14.3%(1/7)。構(gòu)成比與廣州［6］和揚(yáng)州［9］相近, 但與上海［10］和吉林［11］等地有所不同。

串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查是指通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)新生兒群體中的氨基酸和肉堿等代謝物指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè), 在新生兒尚未出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)做出早期診斷和早期治療, 避免患兒重要器官出現(xiàn)不可逆損害, 以保障兒童正常的身體和智力發(fā)育。而準(zhǔn)確評(píng)估新生兒群體中氨基酸和肉堿等代謝物指標(biāo)是否異常有賴(lài)于可靠的參考區(qū)間, 目前對(duì)于遺傳代謝病篩查指標(biāo)的切值建立尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn), 同一指標(biāo)在不同實(shí)驗(yàn)室或不同方法之間存在較大的差異［12］。何法霖等［13］對(duì)我國(guó)28 個(gè)省市141 家開(kāi)展串聯(lián)質(zhì)譜新生兒遺傳代謝病篩查實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查結(jié)果顯示, 大部分實(shí)驗(yàn)室的切值選擇了試劑廠家說(shuō)明書(shū), 只有14%的實(shí)驗(yàn)室自己確定, 使用非衍生法進(jìn)行篩查的實(shí)驗(yàn)室的切值主要來(lái)源于試劑廠家說(shuō)明書(shū)。不合理的切值設(shè)置易導(dǎo)致過(guò)多的假陽(yáng)性和假陰性,降低陽(yáng)性預(yù)測(cè)值, 因此制定適合本地區(qū)的切值尤為重要。本研究按納入標(biāo)準(zhǔn)篩選出18542 例新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果, 參照“新生兒遺傳代謝病篩查指標(biāo)切值建立方法專(zhuān)家共識(shí)”［12］, 采用百分位數(shù)法(P0.5～P99.5)建立了珠海地區(qū)正常新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查11 種氨基酸和31 種肉堿的參考區(qū)間。同時(shí)為探討試劑廠家參考區(qū)間在珠海地區(qū)的適用性, 本研究將18542 例新生兒的檢測(cè)結(jié)果與試劑說(shuō)明書(shū)中的中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較, 結(jié)果顯示, 18542 例新生兒11 種氨基酸檢測(cè)結(jié)果與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果比較, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)； 18542 例新生兒31 種肉堿中除C5:1、C6、C8、C10:2、C14:2、C16OH、C16:1OH、C18OH、C18:1OH 等指標(biāo)外, 其余肉堿的檢測(cè)結(jié)果與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果比較, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。上述結(jié)果與李銘等［14］的報(bào)道略有不同。此外本研究將所建立的參考區(qū)間與全國(guó)普遍使用的上海新華醫(yī)院新生兒的參考區(qū)間進(jìn)行了比較, 結(jié)果表明, 珠海地區(qū) 新 生 兒Ala、Gly、Leu、Orn、Phe、Tyr、Val、C0、C6DC 參考區(qū)間下限與新華醫(yī)院新生兒比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本地區(qū)與中國(guó)臨床機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果及上海新華醫(yī)院參考區(qū)間存在差異的主要原因可能與地區(qū)差別、飲食習(xí)慣差異及珠海外來(lái)人口較多、人員結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜等因素有關(guān), 因此各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)厝巳簷z測(cè)結(jié)果建立自己的參考區(qū)間。

本次研究中共篩查20364 例新生兒, 初篩陽(yáng)性687 例, 召回621 例, 確診遺傳代謝病7 例, 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為1.13%(7/621), 明顯低于國(guó)內(nèi)的報(bào)道(廣州4.5%、常州3.38%)［7,15］, 原因可能與實(shí)驗(yàn)室所采用的參考區(qū)間不合理有關(guān)。本研究依據(jù)18542 例新生兒的檢測(cè)結(jié)果建立了參考區(qū)間, 并對(duì)資料中初篩陽(yáng)性數(shù)及確診數(shù)均為最多的“原發(fā)性肉堿缺乏癥”篩查指標(biāo)C0 的參考區(qū)間進(jìn)行了初步驗(yàn)證。依據(jù)實(shí)驗(yàn)室所使用的C0 參考區(qū)間(9～55 μmol/L), “原發(fā)性肉堿缺乏癥”的初篩陽(yáng)性數(shù)為245 例, 召回227 例, 確診2 例, 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.88%；若采用本研究所建立的參考區(qū)間, “原發(fā)性肉堿缺乏癥”的初篩陽(yáng)性數(shù)下降至104 例, 召回98 例,確診2 例, 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值上升至2.04%, 可見(jiàn)本地區(qū)參考區(qū)間的建立對(duì)降低篩查假陽(yáng)性率、提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。許多研究結(jié)果表明, 胎齡、出生體重對(duì)新生兒串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查結(jié)果均存在影響［16-18］。鑒于本研究中早產(chǎn)兒及低出生體重兒的數(shù)量有限, 課題組基于18542 例新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù),先行建立了該地區(qū)正常新生兒串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查42 個(gè)指標(biāo)的參考區(qū)間, 今后隨著篩查量的增加, 在優(yōu)化和調(diào)整本地區(qū)正常新生兒遺傳代謝病篩查指標(biāo)參考區(qū)間的同時(shí), 逐步建立本地區(qū)早產(chǎn)兒及低出生體重兒的參考區(qū)間, 以降低篩查的假陽(yáng)性率和假陰性率、提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及篩查效率, 為本地區(qū)新生兒遺傳代謝病篩查的實(shí)驗(yàn)診斷提供可靠的依據(jù)。

綜上所述, 珠海地區(qū)新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查11 種氨基酸和31 種肉堿參考區(qū)間的建立, 為本地區(qū)新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查的結(jié)果解讀提供了理論依據(jù)。