張婷婷,劉依蕙,葉燁,侯彩蘭,王詩(shī)鑌,黃春霞,賈福軍△

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)、廣東省精神衛(wèi)生中心心理科(廣東廣州 510180); 2廣東三九腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東廣州 510510)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題,乙型肝炎的慢性感染被認(rèn)為是最重要的傳染病之一,可導(dǎo)致嚴(yán)重的后果[1]。全球有超過2.4億人感染HBV,其中15%～40%的HBV感染者未經(jīng)治療可進(jìn)展為肝硬化,可能導(dǎo)致肝功能衰竭和肝癌[2]。抑郁癥(major depressive disorder,MDD)患病率高、自殺風(fēng)險(xiǎn)高和識(shí)別率低[3],被認(rèn)為是HBV相關(guān)肝病患者中最常見的精神疾病之一,并且對(duì)疾病進(jìn)展有不良影響[4]。miRNA是由約22個(gè)核苷酸形成的小的非編碼RNA(ncRNA)分子。它們與靶信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合,導(dǎo)致翻譯抑制,進(jìn)而抑制靶mRNA表達(dá)[5]。有研究認(rèn)為miRNA參與基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,并深度參與精神疾病的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),包括抑郁癥和精神分裂癥[6-7]。因此miRNAs在基礎(chǔ)和臨床神經(jīng)學(xué)中屬于有前景的分子,miRNAs不僅提供了新的診斷標(biāo)記物,也成為新治療方法的極具吸引力的潛在的治療靶點(diǎn)[8-9]。據(jù)報(bào)道[10-11]miRNA-22(miR22)是一種高度保守的非編碼RNA,其通過與靶基因的mRNA結(jié)合,調(diào)控基因的表達(dá),與細(xì)胞生存、減輕氧化應(yīng)激損傷或促進(jìn)細(xì)胞周期停滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān),已被發(fā)現(xiàn)在多種生物學(xué)過程中起著重要的調(diào)控作用。如抑郁癥患者突觸功能的改變與miRNA的異常表達(dá)密切相關(guān),包括miR22-3p等[12-13],有研究[14]顯示miR22等在精神疾病的發(fā)病機(jī)制以及抗精神病藥和情緒穩(wěn)定劑的作用機(jī)制中起重要作用。Zhu等[15]研究顯示建議將miR22和miR26a組合作為最穩(wěn)定的參考基因集,用于在HBV患者和健康人群中進(jìn)行循環(huán)miRNA評(píng)估。因此,miR22可能與乙型肝炎共病抑郁有關(guān),以往抑郁癥多有精神專科醫(yī)師排查診治,能有表觀遺傳基因檢測(cè)進(jìn)一步提高診治精準(zhǔn)性。本研究通過檢測(cè)人類血清中miR22的表達(dá)量,討論抑郁癥發(fā)病機(jī)制與miR22之間的可能關(guān)系,尤其是HBV攜帶者患抑郁癥的機(jī)制以及臨床檢測(cè)的意義,以期待提高乙型肝炎患者患抑郁癥早期診治及防范。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中所有研究對(duì)象為2020年11月至 2022年12月期間,在廣東省精神衛(wèi)生中心和廣東三九腦科醫(yī)院門診或住院患者和志愿者中招募。共收集了120例受試者,其中慢性HBV攜帶者共病抑郁癥患者(共病組)25例,抑郁癥患者(抑郁組)35例,慢性HBV攜帶患者(攜帶組)30例以及健康對(duì)照受試者(健康組)30例,并收集了120份血清樣本。研究經(jīng)過廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)通過(CDREC2018408)。知情同意書由受試者本人或監(jiān)護(hù)人簽署。所有受試者均由精神科中級(jí)及以上職稱醫(yī)師面診問診、量表評(píng)估和標(biāo)本收集。所有研究者均接受的相關(guān)培訓(xùn),順利完成晤談。

1.2 疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)和入組標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 抑郁癥診斷符合國(guó)際疾病分類法(International Classification of Diseases,ICD-10)抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn);HBV攜帶者診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》2015更新版的慢性HBV攜帶者診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 入組標(biāo)準(zhǔn) 所有受試者均符合以下:(1)年齡18～60 歲;(2)排除近1個(gè)月應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑及干擾素、核苷(酸)類似物等抗病毒藥物或治療;(3)非妊娠、哺乳期受試者;(4)愿意參加研究。各組需要同時(shí)符合以下入組標(biāo)準(zhǔn)。

共病組:(1)診斷抑郁癥,且首次發(fā)作;(2)符合診斷慢性HBV攜帶者,既往未治療;(3)既往無慢性HBV攜帶者外的其他心身疾病。

抑郁組:(1)診斷抑郁癥,首次發(fā)作;(2)既往無心身疾病。

攜帶組:(1)診斷慢性HBV攜帶者,既往未治療。(2)既往無慢性HBV攜帶者外的其他心身疾病。

健康組:既往無心身疾病。

1.3 試劑及儀器 miRNA 提取試劑(Magen); HiPure Liquid RNA Mini Kit(Magen廠家);HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA 試劑盒(Vazyme廠家)。熒光 PCR 儀:Bio-Rad廠家,CFX96 型號(hào)。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集與處理 (1)使用無抗凝管采5 mL外周靜脈血樣,采血后輕輕將全血滴入潔凈的離心管;(2)4℃下靜置3～4 h,可見血塊析出(也可放置4℃冰箱過夜);(3)使用 5 000 r/min,離心10 min,可見淡黃色血清,取出上清后可再3 000 r/min離心10 min,以最大程度保證血清質(zhì)量;(4)將血清分裝,在醫(yī)院-40℃保存4 h內(nèi)轉(zhuǎn)送,或直接轉(zhuǎn)送至實(shí)驗(yàn)室凍存于-80 ℃。

1.4.2 熒光定量PCR檢測(cè)(探針法)進(jìn)行miRNA-22檢測(cè)

1.4.2.1 miRNA提取 樣本解凍后振蕩混勻,使用Magen廠家生產(chǎn)的HiPure Liquid RNA Mini Kit提取總RNA(里面包含miRNA)。

1.4.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA 使用用Vazyme廠家生產(chǎn)的HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA 試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,具體如下:(1)去除基因組 DNA:配制好反應(yīng)液(5X gDNA wiper Mix 2 μL;Total RNA 10 pg 1 μg、RNase free dH2O up to 10 μL)進(jìn)行基因組 DNA去除反應(yīng),反應(yīng)條件:42℃ 2 min;4℃ ∞;(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:反應(yīng)液:上一步的反應(yīng)液 10 μL,Hiscript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL,Gene Specific Primer 0.2 pmol,10X RT Mix 2 μL、RNase Free dH2O up to 20 μL;配置反應(yīng)液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);(3)采用RT 反應(yīng)程序:37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃ END,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)做熒光 PCR;(4)反轉(zhuǎn)錄引物序列見表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄引物序列信息

1.4.2.3 熒光定量 PCR 上機(jī)檢測(cè) 以cDNA為模板,使用KAPA生產(chǎn)的KAPA Probe Fast qPCR Master進(jìn)行qPCR檢測(cè)。qPCR 反應(yīng)體系如下(單位μL,共 20 μL體系):ddH2O 6.7 μL,KAPA Probe Fast qPCR Master Mix(2×)10 μL,10P Primer F 1.0 μL,Universal R 1.0 μL,cDNA 1.0 μL,Probe 0.3 μL;反應(yīng)程序:模板 cDNA 預(yù)變性:95℃ 3 min;熒光 PCR:95℃ 3 s,55℃ 30 s,讀熒光數(shù)值,40 循環(huán);30℃ 30 s;miRNA-22的引物和Typrobe共同探針序列見表2。

表2 miRNA-22引物和Typrobe共同探針序列信息

1.4.2.4 miR22的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算 以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法與參照樣本比較計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔,取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)于數(shù)值型變量,采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,對(duì)于分類型變量,采用頻數(shù)和百分比表示。若數(shù)值型變量服從正態(tài)分布,則采用方差分析比較組間差異,若不服從正態(tài)分布,則采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。當(dāng)組間存在差異時(shí),進(jìn)行兩兩比較,并采用Bonferroni法對(duì)P值進(jìn)行校正。對(duì)兩個(gè)數(shù)值型變量 進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí),若滿足正態(tài)分布,則采用Pearson法,否則采用Spearman法。以2個(gè)基因數(shù)據(jù)為因變量,以人口學(xué)特征、臨床特征和心理特征為自變量,分別構(gòu)建單因素線性回歸模型。若單因素線性回歸模型顯示某自變量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則納入多因素線性回歸模型。應(yīng)用方差膨脹因子(VIF)評(píng)估多因素線性回歸模型的多重共線性,當(dāng)VIF<5,表示無共線性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。分析采用R 4.0.2軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 基本人口學(xué)特征 共納入研究對(duì)象120例,其中共病組25例,抑郁組35例,攜帶組30例,健康組30例。年齡為(37.56±12.22)歲,其中抑郁組的平均年齡分別低于共病組、攜帶組和健康組(P<0.001),其余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。120例中女性與男性組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.20)。擁有高中及以上學(xué)歷與初中及以下學(xué)歷組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.16)。組間比較發(fā)現(xiàn)抑郁組的未婚率分別高于共病組、攜帶組和健康組,其余組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 共病組、抑郁組、攜帶組和健康組的社會(huì)人口學(xué)特征比較 例(%)

2.2 miR22表達(dá)量

2.2.1 miR22-3p表達(dá)量 miR22-3p表達(dá)量平均值為4.31±11.67,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),其中共病組(15.18±22.67)遠(yuǎn)高于抑郁組(1.77±1.45)、攜帶組(1.70±1.11)和健康組(0.82±0.50)。抑郁組與攜帶組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但均高于健康組(P<0.05)。見表4、圖1。

注:NS表示無意義,*表示P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表4 各組miR-22表達(dá)量及組間比較

2.2.2 miR22-5p表達(dá)量 miR22-5p表達(dá)量平均值為3.20±10.72,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),其中共病組(11.85±21.60)遠(yuǎn)高于抑郁組(1.07±1.49)、攜帶組(1.15±0.83)和健康組(0.53±0.35),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。抑郁組與攜帶組、健康組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但攜帶組高于健康組(P=0.002)。見表4、圖2。

注:NS表示無意義,*表示P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 miR22-3p基因的影響因素分析 以miR22-3p基因表達(dá)量為因變量,構(gòu)建單因素和多因素線性回歸模型。單因素回歸模型結(jié)果顯示僅臨床診斷類型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,無需進(jìn)行多因素模型校正。相對(duì)于健康組(0.82±0.5),共病組miR22-3p基因的表達(dá)量(15.18±22.67)更多(β=14.35,95%CI:8.85～19.85,P<0.001),健康組與攜帶組、抑郁組miR22-3p基因的表達(dá)量差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表5。

表5 miR22-3p基因的單因素和多因素線性回歸模型結(jié)果

表6 miR22-5p基因的單因素和多因素線性回歸模型結(jié)果

2.4 miR22-5p基因的影響因素分析 以miR22-5p基因表達(dá)量為因變量,構(gòu)建單因素和多因素線性回歸模型。單因素回歸模型結(jié)果顯示僅臨床診斷類型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,故無需進(jìn)行多因素回歸分析。相對(duì)于健康組(0.53±0.35),共病組miR22-5p基因的表達(dá)量(11.85±21.60)更多(β=11.33,95%CI:6.09～16.56,P<0.001)。健康組與攜帶組(1.15±0.83)、抑郁組(1.07±1.49)miR22-5p基因的表達(dá)量與抑郁組差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

通過對(duì)受試者血清中miR22的表達(dá)進(jìn)行定量PCR檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)miR22在慢性HBV攜帶者共病抑郁癥患者中表達(dá)水平顯著高于其他3組(P<0.01)。抑郁組與攜帶組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中miR22-3p抑郁組與攜帶組表達(dá)量均高于健康組(P<0.05),miR22-5p攜帶組高于健康組(P<0.05)。有文獻(xiàn)報(bào)道在急性缺血性卒中、腦干和腦深部微出血病患中,血漿 miR22表達(dá)量較高的患者更可能發(fā)生卒中抑郁(PSD)[16];另有研究[17]表明通過蘋果酚類提取物可以減輕 miR22-3p/SIRT1 軸的氧化應(yīng)激及炎癥和細(xì)胞凋亡從而改善小鼠鉛誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙以及抑郁和焦慮樣行為;另miR22-3p已被證明參與MDD背景下突觸可塑性的調(diào)節(jié)[18]。以上結(jié)果提示miR22在抑郁癥中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR22在抑郁及乙肝共病中表達(dá)差異,提示miR22在抑郁及抑郁共病中發(fā)揮作用,但具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

首先,本研究結(jié)果表明miR22可能在慢性HBV攜帶者共病抑郁癥中發(fā)揮重要作用,miR22也可能參與抑郁癥形成的機(jī)制。這也與既往研究發(fā)現(xiàn)相符合。抑郁障礙的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,miR22通過調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路,如神經(jīng)發(fā)育、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)遞質(zhì)的合成等,參與了抑郁癥的發(fā)病過程可能;如miR22可能在抑郁癥的發(fā)病中起到了調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的作用,miR22可以通過抑制多巴胺和5-羥色胺的合成和釋放來影響神經(jīng)遞質(zhì)的水平[19-20],這可能導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的不平衡,從而引發(fā)抑郁癥的發(fā)病。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),miR22通過調(diào)控多個(gè)靶基因,如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)等[17,21-23],影響神經(jīng)元的生存和功能,從而參與了抑郁癥的發(fā)病過程。再有,miR22可能參與了抑郁癥患者中神經(jīng)發(fā)育和突觸可塑性的調(diào)節(jié)。研究顯示miR22通過抑制神經(jīng)元的分化和突觸的形成,從而影響腦神經(jīng)的發(fā)育和功能。老年性癡呆大鼠海馬中miR22表達(dá)可抑制神經(jīng)元凋亡,從而改善學(xué)習(xí)和記憶功能障礙[23]。本研究未發(fā)現(xiàn)抑郁癥組miR22基因表達(dá)改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,miR22-5p在抑郁癥組中表達(dá)量低,一是考慮樣本量較少,二是可能有其他分子作用于miR22-5p,具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。進(jìn)一步的研究可以探究miR22與抑郁癥的關(guān)聯(lián)機(jī)制,以及其在疾病發(fā)展過程中的作用。

其次,既往已有研究表明,miR22的表達(dá)水平可以作為HBV感染相關(guān)肝病的治療預(yù)測(cè)指標(biāo),其表達(dá)水平與HBV感染相關(guān)肝病的臨床治療效果密切相關(guān)[24-26]。也有研究發(fā)現(xiàn),通過調(diào)節(jié)miR22的表達(dá)水平,可以改善抑郁癥動(dòng)物模型中的行為表現(xiàn)[17],miR22可作為一種潛在的治療靶點(diǎn)[27-28],本研究結(jié)果提示HBV攜帶共病抑郁癥患者血清中的miR22表達(dá)量顯著異常,提示臨床未來有望將檢測(cè)miR22用于評(píng)估兩種疾病共病患者的治療和預(yù)測(cè)疾病的進(jìn)展,以期待提高對(duì)HBV感染和抑郁癥患者的早期診治及防范。

最后,本研究存在一定局限性,抑郁組比其他組有更低的平均年齡和更多的未婚狀態(tài),在其他3組沒有發(fā)現(xiàn)這樣的差異。既往有研究顯示就診于精神專科醫(yī)院的抑郁癥患者年齡和首次發(fā)作年齡均低于綜合醫(yī)院就診的患者[29](P<0.05),本研究受試者來源的兩家機(jī)構(gòu)收治患者均屬為?？圃簠^(qū),且進(jìn)行中未進(jìn)行年齡匹配,未來研究可能對(duì)年齡及結(jié)婚與否因素再匹配擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究miR22在慢性HBV攜帶者共病抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和治療效果以及炎癥反應(yīng)調(diào)控中的作用機(jī)制提供了重要線索。未來的研究可以進(jìn)一步探究miR22的生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用前景,以期為慢性HBV攜帶者共病抑郁癥的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

利益相關(guān)聲明:本研究所有作者均無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:張婷婷負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、撰寫論文、實(shí)施研究和數(shù)據(jù)收集;劉依蕙、葉燁、王詩(shī)鑌、黃春霞參與實(shí)施研究、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、文獻(xiàn)資料整理和數(shù)據(jù)收集;侯彩蘭、賈福軍負(fù)責(zé)方案指導(dǎo)及論文審校。