劉少斐,許冰冰

(1.北京四中國際課程佳蓮校區(qū),北京 102202;2.北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所膝關節(jié)外科,北京 100083)

關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞、軟骨前體細胞、Ⅱ型膠原纖維和蛋白聚糖等組成,是關節(jié)腔內覆蓋在滑膜上直接接觸關節(jié)骨端的一種透明軟骨[1]。關節(jié)軟骨本身缺乏血管、淋巴和神經,自身修復能力有限,外界創(chuàng)傷、關節(jié)損傷或是其他疾病導致的軟骨損傷一般無法自行痊愈,因此,需要對損傷的軟骨進行及時治療。常見的治療方法根據(jù)軟骨的退變程度可分為三類:姑息治療、修復治療和再生治療[2-4]。

近年來,干細胞治療為軟骨損傷的修復提供了一種具有前景的治療策略,治療的關鍵就是要保證軟骨細胞的正常分化或誘導分化[5]。干細胞是指具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞,在一定條件下,它們可以在體內分化成多種成體細胞[6]。干細胞治療主要是指將干細胞輸送到身體的特定部位,以期修復病灶或受損的組織。近年來,許多臨床實驗證明,利用干細胞的自我更新和軟骨分化能力,可以有效的治療軟骨損傷[7-8]。骨髓間充質干細胞( bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作為傳統(tǒng)干細胞的一種,由于其取材簡單、增殖能力強、引起免疫應答能力弱、分泌生長因子(如血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子等)以及自我更新能力強等特點,能夠通過體外培養(yǎng)、擴增獲得足夠數(shù)量的細胞,從而廣泛的應用在軟骨修復治療中[7-8]。

因此,本文就近年來對骨髓間充質干細胞提取方法、表面鑒定、多向分化能力及其在軟骨修復中的應用進行闡述,并對其未來的應用進行展望。

1 骨髓間充質干細胞的提取

骨髓間充質干細胞是一種長梭形的非造血細胞,主要來源于中胚層,在特定的分化條件下,可以分化成不同的組織(如骨骼、軟骨、脂肪等)[9-10]。骨髓間充質干細胞主要取自骨髓,根據(jù)骨髓間充質干細胞的生物特性,可以采用骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法和流式細胞儀器進行分選,下面對每種方法進行簡要介紹。

(1)骨髓貼壁培養(yǎng)法

主要是根據(jù)細胞的貼壁性進行區(qū)分,通過固定時間間隔更換培養(yǎng)基來去除不貼壁的細胞,主要包括血細胞(如紅細胞、白細胞、造血細胞等)。骨髓貼壁培養(yǎng)法具有操作簡單、經濟實惠等優(yōu)點,但是該方法獲得的骨髓間充質干細胞成分比較復雜、純度較低。

(2)密度梯度離心法

主要是根據(jù)細胞的大小和密度進行分選。該方法先用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)等體積稀釋骨髓血,再將稀釋后的骨髓血與等體積的 Ficoll 淋巴分離液通過梯度離心(3000 r/min,15 min)獲得不同類型的沉淀液。不同細胞根據(jù)其密度的差異分布在不同的高度上,紅細胞以及多核細胞位于最底層(1.08 g/mL),淋巴細胞分離液(1.08 g/mL)位于倒數(shù)第二層,骨髓間充質干細胞、造血干細胞等單核細胞位于第二層(1.05~1.08 g/mL),而血漿及其溶解物處于最高層(1.05 g/mL)[11]。第二層為單核細胞層,該層細胞在顏色和形狀上呈現(xiàn)出灰白色云霧狀,在實際分離過程中,可根據(jù)操作的熟練程度,直接吸取第二層;或先去除第一層,再吸取第二層。將吸取的白色云霧狀液體,用PBS 洗滌后,倒入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。通過骨髓貼壁培養(yǎng)法,進一步分離骨髓間充質干細胞。目前,由于梯度離心法為非破壞性分析,且操作簡單性、可擴展性強,從而廣泛應用于實驗室高純度BMSCs 的分離。

(3)流式細胞儀器分選

主要是根據(jù)不同細胞的表面標志物進行分選。利用電場的作用力分離細胞,通過標記多個表面標志物甚至是細胞內標準物對細胞進行識別。盡管這種方法獲得的BMSCs 純度更高,但分選時間長、效率低,因此,在臨床實驗中該方法未得到普及。

2 骨髓間充質干細胞的多向分化能力

提取純化后的骨髓間充質干細胞,需要進行細胞分化能力的表征鑒定。常用的方法為利用流式細胞儀對細胞表型進行鑒定以及對細胞進行三系分化誘導。

骨髓間充質干細胞在流式細胞儀中,一般表現(xiàn)為CD29、CD44、CD71、CD90、CD105 和CD106 陽性以及CD3、CD4、CD14、CD34 和CD45 陰性。其中成軟骨潛力與CD105 有關,該表型為轉化生長因子β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)的一個受體[12],這意味著通過與TGF-β3 相互作用,CD105 在軟骨組織的再生和修復過程中可能起到重要的調控作用。此外CD146 作為與成骨潛能密切相關的標記物在BMSCs 中被廣泛表達,即在骨組織的再生和修復過程中,BMSCs 可以分化為骨細胞,參與骨組織的生成和修復。

骨髓間充質干細胞三系誘導分化是指通過特定的培養(yǎng)條件,將骨髓間充質干細胞誘導分化成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。這一過程需要在特定的時間點添加多種刺激和抑制因子,這些因子在特定細胞類型分化的前期和末期發(fā)揮著重要的作用[13]。成骨誘導主要是將處于生長旺盛期的骨髓間充質干細胞接種于預埋了0.1%明膠的6 孔細胞培養(yǎng)板上,同時加入2 mL 完全培養(yǎng)基,待細胞融合60%~70%后,去除6 孔細胞培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基,同時加入2 mL 成骨誘導分化完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸酯和50 μmol/L 抗壞血酸)。定時換液,在誘導3 周后,使用茜素紅進行染色,并利用顯微鏡觀察染色情況。研究報道,Runt 相關轉錄因子2(Runtrelated transcription factor 2,Runx2)、成骨細胞特異性轉錄因子(Osterix)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在成骨誘導分化中發(fā)揮舉足輕重的作用[14-17]。成脂肪誘導是將處于生長旺盛期的骨髓間充質干細胞接種到6 孔板中,每孔加入2 mL 完全培養(yǎng)基并且定時換液,等到細胞融合度達到100%或者過融合時,去除孔內的培養(yǎng)基,并向每孔加入2 mL 成脂誘導分化培養(yǎng)基A 液(1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 甲基異丁基黃嘌呤、10 μg/mL 胰島素、100 mmol/L 吲哚美辛和10% 胎牛血清)。誘導3 d 后,吸走6 孔板中的A 液,加入2 mL 帶10 μg/mL 胰島素和10%胎牛血清的成脂誘導分化培養(yǎng)基B 液。B 液作用24 h 后,吸走B 液,換回A 液進行誘導。如此循環(huán)3~5 次,繼續(xù)用B 液維持培養(yǎng)4~7 d 直到脂滴變得足夠大、足夠圓。B 液維持培養(yǎng)期間,每隔2~3 d 需要更換新鮮的B 液,21 d 后,通過油紅O 染色評估細胞質內脂質空泡的形成情況。在成脂分化過程中,主要參與的轉錄因子有miR-17、miR-21 和miR-143[18]。成軟骨誘導分化與上述兩種分化的主要差異在于對細胞的懸浮培養(yǎng)。取生長旺盛的細胞置于離心管中,用0.5 mL 間充質干細胞成軟骨誘導完全培養(yǎng)基重懸,室溫下150 r/min 離心5 min(擰松離心管管蓋以便于氣體交換),后將其放置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞團出現(xiàn)聚攏現(xiàn)象時,輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底,懸浮在液體中。定時更換培養(yǎng)基,誘導21~28 d 后,對軟骨球進行福爾馬林固定和石蠟包埋切片,最后進行阿利辛藍染色。成軟骨分化中,性別決定Y 染色體區(qū)域(SRY)相關的高遷移率族盒基因9(Sox9)[19-20]以及鋅指蛋白145(ZNF145)[21]等都是起到關鍵作用的主要轉錄因子。

3 骨髓間充質干細胞在關節(jié)軟骨缺損修復中的應用

基于骨髓間充質干細胞的軟骨缺損修復應用,主要分為兩類:一類是直接將骨髓間充質干細胞注射到軟骨損傷中,通過注射,干細胞可以促進軟骨細胞的增殖和分化,并為損傷區(qū)提供細胞修復所需的生物因子和生長因子。該方法可以將干細胞通過局部注射的方式,直接輸送到軟骨缺損處,具有簡單、非侵入性的特點,在臨床應用中較為方便。另外一類則是通過組織工程軟骨的遞送系統(tǒng),利用水凝膠等生物材料包裹干細胞,將材料移植到軟骨缺損處。遞送系統(tǒng)具有良好的生物相容性和可塑性,可以提供支架結構和細胞定位,在移植后,骨髓間充質干細胞可以逐漸分化為軟骨細胞,并與材料共同促進軟骨組織的再生和修復。這種方法可以根據(jù)缺損的大小和形狀,精確定位和定制支架,為軟骨修復提供更好的結構和功能重建。

由于提取骨髓間充質干細胞的治療侵入性小,且能夠降低發(fā)病率和手術成本,因此骨髓間充質干細胞的臨床前驗證得到了眾多學者的廣泛關注。Maeda 等[22]通過體外細胞實驗驗證BMSCs 制造的圓盤形細胞薄片具有較好的成軟骨性能。Al Faqeh等[23]和Ude 等[24]通過山羊的骨關節(jié)炎動物模型,發(fā)現(xiàn)在關節(jié)腔內注射干細胞可以促進軟骨再生。此外,比格犬、豬等大型動物[25-26]以及兔子、小鼠[27-28]等小型動物的關節(jié)腔注射動物實驗結果也表明,骨髓間充質干細胞有利于軟骨修復。Li 等[29]將不同來源的間充質干細胞負載到脫鈣骨支架并研究其軟骨分化潛力,結果發(fā)現(xiàn)利用BMSCs 修復軟骨缺損,其修復組織在細胞形態(tài)和染色特性方面的表現(xiàn)超過了其他來源(如骨膜、脂肪、滑膜和肌肉等)的干細胞(P＜0.05)。Nejadnik 等[30]將72 名病情類似的患者隨機分成兩組,對兩組患者分別使用軟骨細胞和骨髓間充質干細胞進行修復,結果發(fā)現(xiàn)BMSCs 移植在緩解疼痛和提高患者生活質量方面與軟骨細胞同樣有效,且與患者的年齡無關。盡管目前BMSCs 的采集相對簡單且具有低免疫原性,但直接注射BMSCs 仍存在一定的問題,例如注射過程剪切力和局部缺氧等問題導致注射過程細胞死亡率較高、細胞在病灶區(qū)粘附力弱和細胞擴散等問題導致干細胞無法在病灶區(qū)長時間停留等。

軟骨組織工程是利用生物材料作為遞送系統(tǒng)進行修復,以水凝膠等生物材料作為支架,通過支架模仿細胞外基質,利用支架復合細胞,將支架-細胞復合物移植到軟骨損傷區(qū)。自體軟骨替代物的產生和軟骨缺陷新治療策略的開發(fā)是組織工程軟骨領域的重大挑戰(zhàn)。通過使用支架為細胞生長提供一個三維空間,有利于種子細胞的存活,同時避免有害微環(huán)境的影響。目前,常見的支架材料主要分成兩類:一類是自然材料,另外一類是合成材料。自然材料(如去細胞基質、膠原蛋白、殼聚糖、絲素蛋白、海藻酸鹽等)生物相容性好,可降解,但強度偏低。合成材料(高分子材料(聚乳酸、聚乙二醇)、水凝膠材料(甲基丙烯酸酐化明膠、甲基丙烯?；该髻|酸明膠)等)來源廣、強度高,但可能存在潛在的排異反應。

目前,軟骨組織工程中常用BMSCs 和水凝膠相結合的治療方法,基于免疫調節(jié)和抗炎作用相關的“醫(yī)學信號細胞”特性,在受傷組織中誘導再生微環(huán)境的建立。Feng 等[31]首先合成了巰基明膠和乙烯基磺化透明質酸,并通過微流道法將其與骨髓間充質干細胞混合后注射至軟骨損傷部位,結果發(fā)現(xiàn),細胞在水凝膠材料中具有較高的活性、增殖能力和分化能力,這種可注射的自組裝負載干細胞的水凝膠能夠實現(xiàn)簡單有效的軟骨修復。Abdul Rahman等[32]以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-coglycolic acid),PLGA)/纖維蛋白構建了一個三維支架,將細胞接種于三維支架上有利于細胞成軟骨分化。Liu 等[33]通過3D 打印技術,利用甲基丙烯酸透明質酸(methacrylated hyaluronic acid,MeHA)/聚己酸內酯打印了復合BMSCs 的多層支架,其中MeHA 用于負載干細胞,雙氯芬酸鈉用于抑制炎癥反應,結果顯示,負載BMSCs 的支架有利于促進二型膠原表達和抑制白細胞介素1 表達,進一步說明利用BMSCs 復合支架能夠有效的避免關節(jié)內炎癥反應并促進軟骨修復。Erickson 等[34]研究表明,在體外植入BMSCs 的透明質酸水凝膠可以改善軟骨修復。Ansboro 等[35]將擬軟骨的透明質酸微球用作誘導BMSCs 軟骨形成的生長因子傳遞源,負載TGF-β3 的微球孵育生長的BMSCs 增強了軟骨相關糖胺聚糖的積累,并且II 型膠原蛋白和蛋白聚糖的陽性染色證實了體外軟骨的形成;體內植入實驗同時也發(fā)現(xiàn)組織中蛋白聚糖表達的增加。Meng 等[36]設計了一種由親和肽修飾的脫礦質骨基質顆粒與殼聚糖水凝膠結合的復合支架用于軟骨工程,這種支架具有適當?shù)目紫堵?并為細胞粘附和增殖提供了微環(huán)境,能夠改善BMSCs 體外軟骨分化的能力,可用于不規(guī)則形狀軟骨缺陷的修復。在臨床軟骨修復中使用BMSCs 可以避免自體軟骨細胞植入(autologous chondrocyte implantation,ACI)的局限性。在過去的10 年中,BMSCs 用于治療軟骨缺損的植入方法取得了與第一代ACI 相當?shù)呐R床結果。此外,這種治療方法并沒有顯著增加腫瘤形成的風險[37]。

4 小結與展望

目前,大量的研究人員就骨髓間充質干細胞在軟骨修復中的應用進行了豐富的研究。動物實驗和臨床試驗研究結果表明,利用骨髓間充質干細胞能夠較好的實現(xiàn)對軟骨的修復,干細胞軟骨治療具有較好的發(fā)展前景。

盡管干細胞療法為軟骨損傷修復應用開辟了新途徑,但移植后干細胞的存活率普遍較低。因此,研究如何支持干細胞的存活、促進細胞生物活性以及增強細胞與周圍環(huán)境的結合,對于提高治療效果具有重要的意義。另外,與細胞外基質類似的水凝膠材料作為遞送干細胞的載體已經得到了廣泛的研究。目前,實現(xiàn)軟骨完全恢復到其原始的組成、結構、力學性能和生物功能仍然是一個重大的挑戰(zhàn)。例如,同時實現(xiàn)整合軟骨和軟骨下骨再生已成為組織工程學中的關鍵挑戰(zhàn)。同時,在考慮軟骨修復過程中,還需要考慮軟骨下骨修復,在組織工程支架設計上應仔細考慮兩種不同類型組織的結構和模量差異。對于軟骨修復部分,需要支架表現(xiàn)出高彈性模量以承受壓力并抵抗摩擦,同時增強BMSCs 的軟骨形成,抑制肥大分化。軟骨下骨修復部分,則需考慮促進水凝膠內血管網絡的形成能力,以促進營養(yǎng)物質的運輸,刺激成骨細胞的增殖并為再生軟骨提供強大的支持。另外還需考慮,植入物與周圍軟骨界面粘附力,提高組織工程軟骨的植入成功率。

在未來,隨著科技的進一步發(fā)展,隨著問題的逐一解決,將能夠實現(xiàn)利用骨髓間充質干細胞精準、高效地修復軟骨損傷。