王秋生，張 震，楊 子，張小鳳，葛思堂，左蘆根，

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 1胃腸外科 2中心實驗室 3炎癥相關性疾病基礎與轉化研究安徽省重點實驗室，安徽蚌埠 233000

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。據SEER數據庫顯示，2007至2021年胃癌患者的5年生存率依次為38.3%、40.6%和42.9%，呈緩慢上升趨勢，且晚期胃癌患者的5年生存率僅為10%，胃癌患者的遠期預后不容樂觀[2]。近年來，越來越多的學者嘗試從分子病理學層面尋找與胃癌預后有關的分子標志物，探究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的生物學作用[3-4]，旨在為胃癌臨床診療提供新思路。細胞周期是多種生物學分子共同調控的結果，而細胞周期調控失衡是引起胃癌細胞惡性增殖的重要原因[5-6]，可顯著影響胃癌的發(fā)生發(fā)展及遠期預后[7-8]。中介體復合物亞基8(mediator complex subunit 8，MED8)是一種RNA聚合酶調節(jié)因子，在mRNA轉錄過程中充當RNA聚合酶Ⅱ和調節(jié)蛋白之間的橋梁[9]。有研究表明，MED8在肝細胞癌組織中高表達且與預后不良相關[10]，被證實是腎細胞癌的致癌基因[11]。但MED8在胃癌中的表達及對患者預后的影響相關報道較少。本研究基于公共數據庫及病理組織學分析MED8在胃癌及癌旁組織中的表達，探討MED8與胃癌患者臨床病理參數及遠期預后的關系，利用生物信息學預測MED8在胃癌中的生物學作用，并采用細胞學實驗進行驗證，旨在明確MED8作為胃癌預后評估標志物和治療新靶點的潛在應用價值。

資料和方法

基線資料采集回顧性分析蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2012年6月至2017年7月行胃癌根治術的患者。納入標準：依據病理學檢查，明確診斷為原發(fā)性胃癌；成功施行胃癌根治術并達到肉眼及顯微鏡下均無腫瘤殘留。排除標準：合并其他組織來源的惡性腫瘤；臨床資料缺失。依據納入及排除標準入選并采集患者相關資料：(1)基線資料：性別、年齡、術前外周血癌胚抗原、糖類抗原199、腫瘤大小、組織學分型、分化程度、TNM分期、手術病理診斷等信息；(2)生存資料：通過電話隨訪患者術后5年生存情況；(3)手術病理：調取癌組織及癌旁組織蠟塊，并進行免疫組織化學染色。本研究獲得蚌埠醫(yī)學院倫理委員會批準(倫理審查編號：2019KY038)。

生物信息學分析TIMER2.0平臺(http：//timer.cistrome.org)分析MED8在人類常見腫瘤及胃癌中的表達情況。UALCAN平臺(ualcan.path.uab.edu)分析MED8在胃癌中的表達情況。Kaplan-Meier平臺(https：//kmplot.com/analysis/)分析MED8(探針：213127_s_at)與胃癌患者總生存期的相關性。UCSC Xena平臺(https：//xena.ucsc.edu)獲取GDC TCGA胃癌數據集基因表達豐度值表，共包含60 489個基因、407例組織，基迪奧生物平臺(https：//www.genedenovo.com)進行差異基因分析及基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，通過DAVID Bioinformatics Resources平臺(htpps：//david.ncifcrf.gov)獲取基因本體論(gene ontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)基因富集列表，并采用Bioinformatics(www.bioinformatics.com.cn)在線作圖工具進行富集結果可視化。

細胞培養(yǎng)、慢病毒轉染及分組胃癌細胞系(MGC-803)購自國家生物醫(yī)學實驗細胞資源庫，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數生長期細胞，使用過表達MED8載體(吉凱基因)和對照空載體(質粒GV358)、MED8干擾(小干擾RNA：TTCAAACCTTCTGGAGAAAATCA)和對照空載體(質粒GV248)對MGC-803細胞進行慢病毒轉染實驗，步驟簡述為：調整細胞懸液密度為2×105個/ml，接種于6孔板，待細胞生長至70%，加入含有慢病毒(1×107TU/ml)和感染增強液的完全培養(yǎng)基進行感染，7 h后更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后用含1 μg/ml嘌呤霉素完全培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達細胞株，利用免疫印跡法驗證調控效果。實驗分組為：正常對照組、過表達空載組、MED8過表達組、敲減空載組和MED8敲減組。

免疫組織化學染色及積分光密度值分析組織切片經脫蠟水化、抗原修復、一抗MED8(1∶200，武漢三鷹生物技術有限公司)及二抗孵育、二氨基聯(lián)苯胺顯色、脫水及封片等處理，Image Pro Plus軟件對組織進行積分光密度值(integrated optical density，IOD)定量分析。

免疫印跡實驗采用放射免疫沉淀實驗裂解液與蛋白酶抑制劑提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白電泳，經轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、凝膠成像，Image J軟件對圖像進行分析處理。一抗信息如下：MED8、細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，Cdk4)和G1/S-特異性周期蛋白-D1(G1/S-specific cyclin-D1，CyclinD1)稀釋比均為1∶1000，購自武漢三鷹生物技術有限公司。

流式細胞實驗培養(yǎng)并收集MGC-803細胞，離心后收集細胞沉淀，預冷磷酸緩沖鹽溶液洗滌后用70%冰冷乙醇4 ℃過夜固定。按照細胞周期檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說明書進行細胞周期檢測，并用Flowjo10.0軟件分析細胞周期不同時相的細胞比例。

結 果

MED8在胃癌組織的表達TIMER2.0平臺分析顯示，與正常組織相比，MED8在包括胃癌在內的多種腫瘤組織中高表達(P均<0.05)(圖1)，UALCAN平臺進一步分析顯示，MED8在胃癌組織的表達顯著高于癌旁組織，且MED8在臨床1～4期、G2～3級、N0～3期的表達明顯高于正常組織(P均<0.05)(圖2)。免疫組織化學結果進一步顯示，胃癌組織中MED8表達高于癌旁組織，且定位于癌細胞核中(t=34.670，P<0.001)(圖3)。

與正常組織比較，aP<0.05，bP<0.01

圖3 免疫組織化學檢測MED8蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達

胃癌組織中MED8表達與臨床病理參數的關系以胃癌組織中MED8表達相對IOD值的中位數(3.085)為界，將患者分為MED8高表達組(n=52)和MED8低表達組(n=52)，并分析其與臨床病理參數的關系，結果顯示MED8表達水平與分化程度(P=0.029)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.006)及外周血癌胚抗原(P=0.048)、糖類抗原199(P=0.003)水平相關(表1)。

表1 胃癌組織中MED8的表達與臨床及病理參數的關系

MED8表達對胃癌患者術后5年生存率的影響及危險因素分析Kaplan-Meier Plotter平臺分析MED8表達對胃癌患者生存率的影響，結果顯示MED8高表達組患者術后總生存期顯著低于MED8低表達組(P=0.002)(圖4A)。Kaplan-Meier生存分析顯示，MED8高表達組患者術后5年生存率顯著低于MED8低表達組[23.1%(12/52)比67.3%(35/52)，χ2=21.476，P<0.001)(圖4B)。單因素分析顯示，性別、年齡、腫瘤大小、組織學類型與胃癌患者術后5年生存期差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，而MED8高表達(P<0.001)、分化程度(P=0.020)、T分期(P<0.001)、N分期(P=0.003)、癌胚抗原(P<0.001)、糖類抗原199(P<0.001)可能是影響胃癌患者術后5年生存率的危險因素(圖4C～4G)。Cox回歸進一步分析顯示，MED8高表達(P=0.037)、腫瘤低分化(P=0.034)、T3～T4期(P=0.017)、N2～N3期(P=0.031)、癌胚抗原≥5 ng/ml(P<0.001)和糖類抗原199≥37 U/ml(P=0.012)是影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因素(圖4H)。

CEA：癌胚抗原；CA199：糖類抗原199

MED8表達對胃癌患者遠期預后的預測價值繪制時間依賴性ROC工作曲線評估MED8表達對胃癌患者術后5年生存情況的預判價值，結果顯示以MED8相對表達量3.075為截斷值，預判胃癌根治術后5年死亡的敏感度為71.9%，特異度為74.5%，曲線下面積為0.733(圖5)。

圖5 MED8表達對胃癌患者術后5年生存期的預測價值

MED8基因功能富集分析結果根據在線獲取的胃癌數據集基因表達豐度表，以MED8表達豐度值的中位數為界進行分組，對60 489個基因進行差異分析，共篩選出6006個差異表達基因，其中包括4856個表達上調基因和1150個表達下調基因(圖6A、6B)。對包括MED8在內的6006個差異基因進行基因富集及基因集富集分析，結果顯示GO富集的生物學過程包括細胞周期、細胞分裂、凋亡等生物學過程(圖6C)；KEGG富集的通路包括細胞周期、p53信號通路、轉化生長因子-β信號通路等(圖6D)；基因集富集分析結果顯示，6006個差異基因在胃癌、細胞周期、DNA復制等基因集中呈現(xiàn)正向調控(圖6E)。

GO：基因本體論；KEGG：京都基因與基因組百科全書

過表達MED8對MGC-803細胞G1/S期轉化及細胞周期蛋白表達的影響慢病毒轉染MGC-803細胞過表達MED8，Western blot檢測MED8蛋白表達水平，結果顯示轉染后成功過表達MGC-803細胞MED8蛋白表達水平(P<0.001)(圖7A、7B)。細胞周期流式實驗分析過表達MED8對MGC-803細胞G1/S期轉換的影響，結果顯示與過表達空載組相比，MED8過表達組MGC-803細胞G1期細胞比例顯著減少(P<0.001)，S期細胞比例顯著增加(P<0.001)(圖7C～7F)。免疫印跡實驗檢測Cdk4和CyclinD1蛋白表達水平，結果顯示與過表達空載組相比，MED8過表達組MGC-803細胞中的Cdk4和CyclinD1蛋白水平均顯著升高(P均<0.001)(圖7G、7H)。

Mr：相對分子質量；Cdk4：細胞周期蛋白依賴性激酶4；CyclinD1：G1/S-特異性周期蛋白-D1

敲減MED8對MGC-803細胞G1/S期轉化及細胞周期蛋白表達的影響慢病毒轉染MGC-803細胞敲減MED8，Western blot檢測MED8蛋白表達水平，結果顯示轉染后成功敲減MGC-803細胞MED8蛋白表達(P<0.001)(圖8A、8B)。細胞周期流式實驗分析敲減MED8對MGC-803細胞G1/S期轉換的影響，結果顯示與敲減空載組相比，MED8敲減組MGC-803細胞G1期細胞比例顯著增加(P<0.001)，S期細胞比例顯著減少(P<0.001)(圖8C～8F)。免疫印跡實驗檢測Cdk4和CyclinD1蛋白表達水平，結果顯示與敲減空載組相比，MED8敲減組MGC-803細胞中的Cdk4和CyclinD1蛋白水平均顯著降低(P均<0.001)(圖8G、8H)。

A、B.Western blot檢測慢病毒轉染后基因調控效果；C～F.流式細胞學分析敲減MED8對MGC-803細胞G1/S期轉換的影響；G、H.Western blot檢測敲減MED8對MGC-803細胞中Cdk4和CyclinD1蛋白表達的影響

討 論

胃癌是一個全球性健康問題[12]，近50年來，針對胃癌的手術治療、全身化療和放療以及靶向和免疫治療等均取得了長足進步[13]，然而，胃癌仍然是全球癌癥相關死亡的第3大原因[14]。尋找判斷胃癌遠期預后的敏感特異性標志物并探索其在胃癌中的作用，有望改善患者預后并為胃癌的治療提供更多參考[15-16]。本研究基于公共數據庫及本機構臨床病例發(fā)現(xiàn)MED8在胃癌中高表達且對胃癌患者的遠期預后具有較高的的預測價值，同時，體外細胞實驗表明MED8蛋白表達水平顯著影響細胞周期進程，有望成為評估胃癌患者遠期預后和胃癌治療新靶點的潛在生物學標志物。

本研究通過在線數據庫挖掘發(fā)現(xiàn)MED8在胃癌組織中高表達，免疫組織化學實驗表明MED8在胃癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織。為進一步探索MED8在評估胃癌患者遠期預后的臨床價值，本研究通過Kaplan-Meier Plotter數據庫挖掘發(fā)現(xiàn)MED8高表達組患者術后總生存期顯著低于MED8低表達組；結合本機構臨床病例隨訪資料繪制Kaplan-Meier生存曲線，結果提示MED8高表達組患者有更低的5年生存率。既往研究表明，MED8在肝癌組織中高表達且與患者預后不良密切相關[9-10]；MED8與透明細胞腎細胞癌的惡性進展相關并被證實是腎細胞癌的致癌基因[11]，與本研究結果相似。此外，Cox回歸模型分析表明，MED8高表達是影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因素，可作為影響胃癌發(fā)生發(fā)展的獨立影響因子，同時，ROC曲線進一步提示MED8蛋白表達水平對評估胃癌患者術后5年生存率具有較高的預測價值。但MED8影響胃癌患者術后5年生存期的具體途徑或機制尚不明確。

MED8位于中介體的頭部[17]，是mRNA轉錄過程所必需的一種RNA聚合酶調節(jié)因子，在mRNA轉錄過程中充當RNA聚合酶Ⅱ和調節(jié)蛋白之間的橋梁[9-18]。為進一步挖掘MED8影響胃癌進展及遠期預后的可能途徑，本研究通過TCGA公共數據庫進行GO、KEGG及GSEA富集分析，結果提示MED8可能參與細胞周期、DNA復制等生物學過程。同時，流式細胞學實驗及免疫印跡實驗進一步表明，過表達MED8可顯著促進MGC-803處于G1期細胞向S期轉化，且過表達組細胞Cdk4和CyclinD1蛋白水平顯著升高，敲減組則相反。提示MED8可能通過調控細胞周期進程進而影響胃癌疾病進展及遠期預后。

Zeng等[19]研究指出，胃癌作為一組異質性疾病具有獨特的發(fā)病機制和分子致病途徑，一定程度上造成了胃癌的治療效果欠佳及預后不良。Hume等[5]指出，G1期細胞過度活躍或加速進入S期會導致復制應激和DNA損傷，可引發(fā)并促進腫瘤進展。近年，基于精準醫(yī)學的分子治療有望改善胃癌患者的不良預后[20]，F(xiàn)ukami等[21]進一步指出，特定生物學分子高表達引起的細胞周期改變可對胃癌的遠期預后產生重要影響。本研究顯示MED8在胃癌組織中高表達且與患者不良預后相關，體外細胞實驗進一步發(fā)現(xiàn)，過表達MED8可促進MGC-803處于G1期的細胞向S期轉化，加快細胞周期進程，敲減MED8則相反，提示靶向MED8基因進行腫瘤細胞周期調控并進一步抑制腫瘤細胞惡性增殖，有望成為胃癌治療的新策略。

本研究的不足：(1)本研究是回顧性研究，存在病例選擇偏倚及資料收集的局限性；(2)本研究納入病例數有限，所得結果需要進一步擴大樣本量進行驗證；(3)在線數據庫的分析顯示不同病理分級、分期不影響MED8的表達，但本研究納入的臨床樣本分析顯示MED8表達水平與分化程度、T分期、N分期均有關，該問題仍需進一步擴大樣本量以驗證；(4)MED8對胃癌細胞其他生物學功能的影響及可能參與的分子信號通路仍需進一步探索及驗證。

綜上，MED8在胃癌中高表達且可能通過調控胃癌細胞周期G1/S期轉換影響疾病進展，并對患者預后的評估具有潛在臨床價值。