熊利能，陳 琦，杜 根，項(xiàng)華中，張大偉，王 成，王秀麗

（1.上海理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)光學(xué)和視光學(xué)研究所，上海 200093；2.同濟(jì)大學(xué) 上海皮膚病醫(yī)院光醫(yī)學(xué)研究所，上海 200443；3.上海理工大學(xué) 光學(xué)儀器與系統(tǒng)教育部工程研究中心，上海 200093）

引言

紋身是一種古老的習(xí)俗，現(xiàn)在也依然在很多地方流行[1]。一些有紋身的人，或因?yàn)椴粷M意紋身效果，或悔于當(dāng)初因好奇、沖動做了紋身，或由于學(xué)習(xí)和工作要求，需要對紋身進(jìn)行祛除。激光治療是主要的祛除手段，并已經(jīng)成為祛除紋身的金標(biāo)準(zhǔn)。在激光治療中，脈沖持續(xù)時間為納秒級的調(diào)Q 激光和強(qiáng)脈沖光應(yīng)用比較廣泛，在紋身祛除及許多良性的色素性皮膚病治療中都有較好的療效。但納秒激光祛除紋身也存在紅腫、疼痛、結(jié)痂等不良反應(yīng)，甚至有色素脫失，色素沉著，疤痕形成等風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。皮秒激光的脈沖寬度更窄，只有10-12s 量級。皮秒激光主要是通過所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)作用于表皮及真皮中的黑色素并將其破壞掉，隨后由吞噬細(xì)胞將這些色素排出體外[4-5]。皮秒激光在紋身祛除上獲得了良好的效果，且與納秒激光相比，效率更高，療效更好。2012 年，皮秒激光通過美國食物藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)證，被批準(zhǔn)用于紋身等皮膚病的治療[6]。

而關(guān)于紋身祛除的療效評價(jià)，目前多為由幾名專家或醫(yī)生采用獨(dú)立盲法進(jìn)行評價(jià)。在疾病療效的判斷上，病理活檢是金標(biāo)準(zhǔn)。然而，這個過程是復(fù)雜的，在很大程度上依賴于醫(yī)學(xué)專家的經(jīng)驗(yàn)。通常情況下，激光祛除需要經(jīng)過幾個治療階段，以實(shí)現(xiàn)紋身墨水的完全祛除。然而，以往的研究對每次治療后紋身墨水殘留量的量化分析較少。皮膚科醫(yī)生一般使用量表評分系統(tǒng)來測量激光治療后紋身的清除情況[7-10]。該評分系統(tǒng)采用較差（祛除率0～25%）、一般（祛除率26%～50%）、良好（祛除率51%～75%）和優(yōu)秀（祛除率76%～100%）來進(jìn)行臨床評分。但是，該評分是醫(yī)學(xué)專家主觀分析的結(jié)果，很難作為反映紋身墨水祛除量的量化指標(biāo)，從而容易導(dǎo)致非必要的進(jìn)一步治療。此外，激光祛除治療過量會產(chǎn)生一些副作用，包括瘢痕纖維化，色素沉著過多，以及多次治療后由于祛除不完全或過度/累積的熱損傷導(dǎo)致紋身色素顏色改變[11-12]。療效評價(jià)也會受到許多因素的干擾，因?yàn)獒t(yī)學(xué)專家需要花費(fèi)大量的時間來觀察組織學(xué)樣本并做出準(zhǔn)確的判斷。此外，由于不同實(shí)驗(yàn)室拍攝環(huán)境的不同，所得到的圖片也有差異，很難提取到準(zhǔn)確的參數(shù)。臨床上也有采用視覺模擬評分法來對療效進(jìn)行客觀評價(jià)，但是這種方法需要醫(yī)務(wù)人員對患者進(jìn)行耐心的解釋說明，這將耗費(fèi)較多的時間。在一項(xiàng)評估激光對豚鼠紋身祛除效果的研究中，研究人員采用色度計(jì)來測量色素沉著的變化，基于光的吸收原理來計(jì)算黑色素的多少，但吸光度的計(jì)算是比較復(fù)雜的[13]。此外，有學(xué)者利用Image J軟件中的顏色閾值調(diào)整工具對紋身區(qū)域圖像中的黑點(diǎn)像素進(jìn)行量化，以評估激光祛除的效率[14]。但閾值調(diào)整的過程往往是主觀的（依賴于測量方法）。目前，臨床上也有用Visia 面部皮膚檢測儀用來檢測面部皮下狀態(tài)，它功能全面，能檢測各種指標(biāo)，但仍不能對檢測出的色素進(jìn)行量化。因此，需要一種新方法，它不僅能快速準(zhǔn)確地對皮膚上的色素進(jìn)行量化，且操作簡單，不需要醫(yī)務(wù)人員花費(fèi)太多時間進(jìn)行訓(xùn)練。

本文將圖像處理技術(shù)應(yīng)用到皮秒激光皮膚色素祛除的量化評價(jià)中。利用532 nm 和1 064 nm的皮秒激光對紋身模型進(jìn)行祛除，然后對色素祛除前后的圖像進(jìn)行處理，并對比計(jì)算出祛除率。該方法既避免了當(dāng)前臨床上人為評價(jià)的弊端，又提高了治療效果和效率，有望成為評價(jià)色素祛除率及其他疾病病理診斷效果的有效手段之一。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及色素模型制作

使用的Alice-PS 型固體激光器有1 064 nm與532 nm 2 種輸出波長：其中1 064 nm 波長下的最大輸出能量為500 mJ；532 nm 波長下的最大輸出能量為250 mJ。激光器脈寬為300 ps，重復(fù)頻率為1～10 Hz，且可調(diào)。使用豬皮制作了離體色素模型，用紋身器及紋身墨水在豬皮上紋上不同顏色的色素，待色素穩(wěn)定后用皮膚鏡拍下色素的分布情況。接著用皮秒激光對這些色素進(jìn)行祛除，針對不同顏色色素采用合適的激光參數(shù)，再次用皮膚鏡拍下激光祛除后的照片。基于圖像處理技術(shù)對色素祛除率進(jìn)行評價(jià)。

1.2 分割方法

1.2.1 基本原理

為了更準(zhǔn)確地提取色素部位的信息，先對圖像進(jìn)行了預(yù)處理。先將圖像灰度化后對灰度圖進(jìn)行觀察，針對灰度圖局部亮度的不均勻進(jìn)行了局部直方圖均衡化，以提高圖像對比度；然后，使用中值濾波或高斯濾波去除噪聲。經(jīng)過預(yù)處理操作后，采用不同方法對圖像進(jìn)行分割。

1.2.2 圖像二值化

圖像二值化就是將圖像中像素點(diǎn)的灰度值設(shè)置為0 和255（只有黑白2 種顏色，黑（0）是背景，白（255）是前景）。關(guān)鍵是尋找一個閾值T，使圖像中灰度值小于閾值T的像素點(diǎn)變?yōu)?，而大于T的像素點(diǎn)變?yōu)?55[15]，這樣就可以把需要的內(nèi)容分割出來。其表達(dá)式為

式中：B(x,y) 為圖像二值化后 (x,y) 點(diǎn)的灰度值；A(x,y)為圖像二值化前 (x,y) 點(diǎn)的灰度值；T為分割閾值。

1.2.3 大津閾值分割

大津閾值分割法，也叫最大類間方差法，由日本學(xué)者Ostu（大津展之）在1978 年提出[16]，經(jīng)常被用來作為一種閾值選取方法。它是在最小二乘法基礎(chǔ)上推導(dǎo)出來的，其基本思想是把圖像的直方圖以某一灰度為閾值分成2 組，即前景與背景。背景和前景的分界值就是要求得的閾值。遍歷不同的閾值，計(jì)算不同閾值下對應(yīng)的背景和前景之間的類內(nèi)方差，當(dāng)類內(nèi)方差取得極大值時，就以這個灰度值作為閾值來分割圖像[17]。

1.2.4 局部自適應(yīng)閾值分割

自適應(yīng)閾值分割法的主要思想不是計(jì)算全局閾值，而是根據(jù)圖像不同區(qū)域的亮度分布，計(jì)算其局部閾值，所以對于不同區(qū)域，它能夠自適應(yīng)計(jì)算不同的閾值。這樣就不會損失這一部分的特征值[18]。具體計(jì)算是將圖像分成很多小區(qū)域，通過區(qū)域內(nèi)平均或高斯加權(quán)進(jìn)行閾值計(jì)算，其表達(dá)式為

式中：T(x,y) 為圖像分割閾值；F(x,y) 為圖像像素的平均值或高斯加權(quán)濾波的卷積在像素點(diǎn)(x,y)的值；C是一個從均值或加權(quán)均值中提取的常數(shù)。

1.2.5 分割方法的選擇

大津閾值分割對單峰值或比較平坦的灰度值有很好的效果，對雙峰或者多峰的情況則較差。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，如果要分割的目標(biāo)面積較小時，大津閾值分割效果不理想，會出現(xiàn)欠分割現(xiàn)象。因?yàn)樗且环N全局閾值分割法，所以當(dāng)圖像之間光照不夠均衡時，則會出現(xiàn)過分割現(xiàn)象。為了解決這些問題，可以選擇基于局部閾值的自適應(yīng)閾值法來對圖像進(jìn)行分割，它能更好地處理明暗差異較大的圖像，獲得更好的分割效果，從而得到更準(zhǔn)確的祛除率。

1.2.6 圖像采集標(biāo)準(zhǔn)化

色素祛除率需要在同一實(shí)驗(yàn)樣品上對激光祛除前后的同一區(qū)域進(jìn)行評價(jià)，需要保證祛除前后所選評價(jià)區(qū)域的一致性。所以，拍攝時需要保持前后條件不變，且拍攝前后所得圖片像素大小一致。為此，制作了相機(jī)固定支架，以控制物體與相機(jī)間距不變；在暗室環(huán)境下進(jìn)行拍攝以避免外界環(huán)境中光的干擾；拍攝時保持前后的光照強(qiáng)度一致，曝光時間一致。隨后，需將色素目標(biāo)拍全，即保證所需圖像信息是完整的，保持圖片大小不變，即可達(dá)到圖像標(biāo)準(zhǔn)化采集的目的。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 分割方法的驗(yàn)證

在計(jì)算色素的祛除率之前，先對分割算法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證。制作圖1（a）所示的標(biāo)準(zhǔn)色塊模板，其中的像素灰度值為隨機(jī)分布，然后用上述的局部自適應(yīng)閾值分割方法對標(biāo)準(zhǔn)色塊進(jìn)行分割并計(jì)算色塊在整個模板中所占的比值。制作了3 個模板，大小均為200 mm×200 mm，模板中設(shè)置了多個不同面積的色塊，灰度值均大于0。在3 個模板中色塊面積總和的占比分別為25%，50%和75%。局部自適應(yīng)閾值分割法分割并計(jì)算后所得的色塊占比分別為24.99%，49.99%，74.99%，該分割方法的誤差小于0.01%，對色塊的分割及祛除率計(jì)算較準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)色塊及其分割圖如圖2所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)色塊與其分割圖的對比Fig. 1 Comparison between standard color block and its segmentation diagram

圖2 皮秒激光祛除結(jié)果Fig. 2 Removal results of picosecond laser

2.2 分割后的圖像特征及2 種分割方法的對比

分別利用1 064 nm 和532 nm 波長的皮秒激光對色素進(jìn)行祛除，發(fā)現(xiàn)波長為1 064 nm 的皮秒激光對黑色色素祛除效果較佳，而波長為532 nm 的皮秒激光對紅色色素的祛除效果較佳，利用上述2 種分割方法對圖像進(jìn)行分割并做對比。圖2 為實(shí)驗(yàn)得到的祛除效果較好的2 組圖片，其自變量為皮秒激光能量密度。圖2（a）和（b）分別為1 064 nm 的皮秒激光對黑色色素祛除前后的原圖及分割圖；圖2（c）和（d）為532 nm的皮秒激光對紅色色素祛除前后的原圖及分割圖。經(jīng)過圖像處理后，色素更好地從周圍組織中被分割了出來，這為色素祛除的評價(jià)提供了更客觀的依據(jù)，也為各種色素性疾病治療的診斷及治療效果的評價(jià)提供了參考依據(jù)。分割結(jié)果顯示，隨著激光能量密度的增加，色素的祛除效果也更好。對比大津閾值分割法與自適應(yīng)閾值分割法，發(fā)現(xiàn)大津閾值分割法出現(xiàn)了明顯的過分割現(xiàn)象，當(dāng)分割目標(biāo)不連續(xù)時，其過分割現(xiàn)象更加明顯，這驗(yàn)證了之前有關(guān)這2 種方法的分析。因此，接下來將選擇基于局部閾值的自適應(yīng)閾值分割法對色素進(jìn)行分割量化，避免過分割現(xiàn)象，以提高祛除率的計(jì)算準(zhǔn)確性。

2.3 定量分析及祛除率計(jì)算

在驗(yàn)證了算法的可行性之后，將算法應(yīng)用到激光處理色素模型前后的圖像上。嘗試創(chuàng)建一個50×50 像素大小的滑動窗口，在圖像上搜索感興趣的區(qū)域，并保證對激光祛除前后所拍攝的圖像的選取區(qū)域是相同的。最后，在圖中背景與前景灰度相差較大的區(qū)域中選擇5 個窗口，計(jì)算皮秒激光祛除前后的色素占比，求出色素祛除率。圖3所示為圖像分割前后的對照圖，皮秒激光參數(shù)設(shè)置為：光斑直徑5 mm；頻率5 Hz。圖3（a）為1 064 nm 的皮秒激光祛除黑色色素前的組織原圖，3 種不同能量對應(yīng)的5 個區(qū)域的色素平均面積比分別為43.75%（0.25 J/cm2），41.18%（0.50 J/cm2），51.20%（1.00 J/cm2）。圖3（b）為色素祛除后的組織圖像，3 種不同能量激光對應(yīng)的5 個區(qū)域的色素平均面積比分別為14.10%（0.25 J/cm2），9.36%（0.50 J/cm2），7.63%（1.00 J/cm2）。由此，可計(jì)算得出黑色色素的祛除率分別為67.78%（0.25 J/cm2），77.27%（0.50 J/cm2），85.10%（1.00 J/cm2）。圖3（c）為532 nm皮秒激光祛除紅色色素前的組織，3 種能量對應(yīng)的5 個區(qū)域的色素平均面積比為43.99%（0.10 J/cm2），34.21%（0.25 J/cm2），31.19%（0.64 J/cm2）。圖3（d）為祛除后的組織圖像，3 種能量激光對應(yīng)的5 個區(qū)域的色素平均面積比為33.69%（0.10 J/cm2），19.54%（0.25 J/cm2），3.74%（0.64 J/cm2）。可得出紅色色素祛除率分別為23.41%（0.10 J/cm2），42.88%（0.25 J/cm2），88.01% （0.64 J/cm2）。表1列出了1 064 nm 與532 nm 皮秒激光各激光能量密度對應(yīng)的祛除率，由此可見，皮秒激光祛除色素的效果隨其能量密度的增加而增強(qiáng)，且使用圖像處理的方法能直觀清晰地計(jì)算出色素祛除率。

表1 激光祛除率統(tǒng)計(jì)Tab. 1 Statistics of laser removal rate

圖3 2 種波長的不同能量的激光祛除色素前后的原圖及分割圖對比Fig. 3 Comparison of original and segmented images before and after removal of pigment by two kinds of lasers with different energies

3 總結(jié)與展望

激光器自被發(fā)明以來，便在各個領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，激光也被應(yīng)用到美容與皮膚病的治療上，并被證實(shí)其具有顯著的療效和較好的安全性[19-21]。目前在紋身祛除及皮膚色素性疾病的治療上應(yīng)用得較廣泛的是納秒激光，其作用機(jī)理是選擇性光熱理論。雖然納秒激光療效不錯，但其光熱效應(yīng)和光化學(xué)效應(yīng)會對皮膚造成損傷[22]。而皮秒激光相較于納秒激光，其主要的作用機(jī)制是光機(jī)械效應(yīng)，它利用更小的能量可達(dá)到較好的治療效果，治療周期也大大縮短，故其能更安全高效地應(yīng)用于紋身祛除及色素性疾病的治療中。通過豬皮組織進(jìn)行的色素祛除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1 064 nm 和532 nm 皮秒激光的光斑、頻率、能量均對色素祛除有影響，其中能量的影響最大。但由于當(dāng)前使用的是豬皮組織進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)，故不能評估治療方法的安全性和復(fù)發(fā)率。所以該實(shí)驗(yàn)所得出的適宜激光能量只能認(rèn)為其治療效果很好，但不能保證其安全性，需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，通過活體動物或臨床數(shù)據(jù)來驗(yàn)證其安全性。

本文采用了圖像處理的方法來對皮秒激光祛除色素的效果進(jìn)行評價(jià)，實(shí)驗(yàn)證明這種評價(jià)方法更為直觀、便捷、簡單，便于使用者對療效迅速做出判斷。該方法不需要耗費(fèi)大量的人力和時間來觀察圖像以做出評價(jià)，且不需要評價(jià)人員有經(jīng)驗(yàn)累積，使用者能用這種方法快速評價(jià)祛除效果，減少了病理診斷所需的人力。通過對色素祛除率的量化，還可以實(shí)現(xiàn)對祛除次數(shù)的預(yù)測，更精準(zhǔn)地評估治療，避免過度治療，提高安全性。

但本研究是在離體豬皮組織上進(jìn)行的，所以只能對祛除效果進(jìn)行評價(jià)，不能反映活體對色素吞噬的狀態(tài)，也不能給出對應(yīng)的人體不良反應(yīng)結(jié)果。在接下來的研究中，將建立更多的動物模型并制作組織染色切片，收集臨床數(shù)據(jù)，積累其他相關(guān)疾病的數(shù)據(jù)，以研究出更多更優(yōu)秀的分割方法，用來解決更多疾病的病理診斷問題，爭取以最少成本做出更加高效且高質(zhì)量的診斷。