桂 平, 王小紅, 徐小茜, 袁 瑞

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院, 貴州 銅仁 554300; 2.貴州省農(nóng)業(yè)科技信息研究所, 貴陽(yáng) 550006)

八月瓜 (Akebiatrifoliata(Thunb.) Koidz.)又名三葉木通、野香蕉、八月炸等[1],是木通科木通屬常綠纏繞性木質(zhì)藤本,廣泛分布于四川、云南、貴州、重慶、湖南、湖北等地區(qū)[2]。八月瓜果肉食用味糯甘甜,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,特別是總糖、氨基酸和維生素C等含量高,微量元素含量豐富,屬于典型的高鉀低鈉植物[3-4];其花紫色飄香、葉碧綠光亮,果形似香蕉,具有較高的觀賞價(jià)值;其種子含油量高,具備開(kāi)發(fā)工業(yè)用油和食用油的潛力,是一種集藥、食、賞、油同源植物[5],是一種珍稀的野生水果, 種質(zhì)資源非常稀少。目前八月瓜繁殖技術(shù)主要以種子繁殖為主,扦插繁殖為輔,眾所周知,八月瓜果實(shí)籽粒多,種子繁殖材料豐富,但采用此方法對(duì)選育的八月瓜優(yōu)良種質(zhì)進(jìn)行繁育,其遺傳變異大,優(yōu)良種質(zhì)的優(yōu)良種性保持得不到保障;扦插繁殖作為無(wú)性繁殖方式雖能保持母本的優(yōu)良性狀,但其繁殖率低,扦插成活后通常一插穗為一植株。因此,為了保障選育的八月瓜優(yōu)良種質(zhì)得到保持,提高其繁殖系數(shù),為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供快繁技術(shù),本試驗(yàn)以八月瓜當(dāng)年生幼嫩莖段為外植體,摸索外植體適宜的消毒方式和探索其組織培養(yǎng)基本營(yíng)養(yǎng)條件,以期為成功構(gòu)建八月瓜組織培養(yǎng)快繁體系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料八月瓜當(dāng)年生幼嫩莖段來(lái)源于2020年從銅仁市萬(wàn)山區(qū)大坪鄉(xiāng)野外引栽至銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技示范園的植株,剪取當(dāng)年萌發(fā)的幼嫩枝條,洗凈表面雜質(zhì),于實(shí)驗(yàn)室流水下沖洗1 h備用。

1.2 方 法

1.2.1適宜消毒方式的篩選

將流水下沖洗干凈的八月瓜試材轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái),用無(wú)菌水沖洗2遍,再用70%濃度酒精浸泡30 s后,置于0.1%的HgCl2溶液中消毒,時(shí)間分別設(shè)置6 min、8 min、10 min、12 min、15 min等5個(gè)梯度,消毒期間和消毒后均用無(wú)菌水沖洗4～5遍,無(wú)菌濾紙吸干水分備用。

用刀片將試材切成基部斜45°,1.5～2 cm,帶1個(gè)芽的外植體,接種至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L培養(yǎng)基中,pH值調(diào)至5.9±0.1。每個(gè)處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)25～30瓶,每瓶1個(gè)外植體,定期觀察外植體情況,30 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2基本培養(yǎng)基的篩選

在超凈工作臺(tái)上,將八月瓜試材用70%酒精30 s+0.1% HgCl212 min消毒后,用鋒利刀片切成基部斜45°,長(zhǎng)1.5～2 cm,帶1個(gè)芽的外植體。分別接種至以B5、WPM、MS、1/2 MS為基本培養(yǎng)基,附加相同的激素6BA 1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+GA32.0 mg/L,蔗糖30 g/L,瓊脂7 g/L,pH值調(diào)至5.9±0.1的培養(yǎng)基中,定期觀察外植體情況,45 d后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

用 Excel2016軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。計(jì)算公式如下:

死亡率/%=(死亡數(shù)/接種數(shù))×100%;

污染率/%=(污染數(shù)/接種數(shù))×100%;

成活率/%=[成活數(shù)/(接種數(shù)-污染數(shù)-死亡數(shù))]×100%;

誘導(dǎo)率/%=(誘導(dǎo)芽的外植體數(shù)/成活數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對(duì)八月瓜幼嫩莖段的消毒效果

從表1可知,隨著0.1% HgCl2消毒時(shí)間的增加,污染率呈下降趨勢(shì),死亡率卻呈上升趨勢(shì),存活率總體呈上升又下降的趨勢(shì),綜合污染率、死亡率、成活率3個(gè)指標(biāo),以70%酒精30 s+0.1% HgCl212 min的消毒方式最適宜,平均成活率最高,達(dá)81.47%。

表1 不同消毒方式對(duì)八月瓜莖段的消毒效果比較

方差分析結(jié)果顯示,5個(gè)處理的平均污染率、平均死亡率、平均成活率均存在顯著差異(p<0.05),其中A3號(hào)處理平均死亡率和平均成活率與其余4個(gè)處理均存在顯著差異,平均污染率和A1～A3差異顯著,與A5差異顯著不顯著。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)八月瓜莖段初代培養(yǎng)的影響

從表2可知,4種基本培養(yǎng)基對(duì)八月瓜莖段初代培養(yǎng)均起到一定的誘導(dǎo)作用,WPM明顯優(yōu)于其他基本培養(yǎng)基,平均誘導(dǎo)率67.59%,分別較1/2 MS、MS、B5高30.26%,11.06%,18.03%;平均芽高2.43 cm,分別比1/2 MS、MS、B5的高0.9 cm、1.36 cm、0.5 cm;WPM唯一出現(xiàn)增殖的培養(yǎng)基,平均芽數(shù)1.6個(gè)。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)八月瓜莖段啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

方差分析結(jié)果顯示,不同的基本培養(yǎng)基對(duì)八月瓜莖段的平均芽誘導(dǎo)率、平均芽數(shù)和平均芽高均存在顯著性差異。B3處理,即在WPM中平均芽誘導(dǎo)率、平均芽數(shù)、平均芽高均與其他3個(gè)處理存在顯著性差異。

3 討 論

通過(guò)設(shè)置0.1%升汞溶液不同的時(shí)間梯度對(duì)八月瓜幼嫩莖段進(jìn)行消毒處理,發(fā)現(xiàn)隨著消毒時(shí)間的增加,其污染率雖呈下降趨勢(shì),但死亡率卻呈上升趨勢(shì),成活率總體呈先上升后下降的趨勢(shì),這可能是隨著時(shí)間的增加,升汞對(duì)幼嫩莖段的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了部分生理傷害所致。升汞消毒效果好,但其毒性也大[6],在今后的研究中,應(yīng)該嘗試不同的消毒劑對(duì)八月瓜外植體的消毒效果。

注:B1、B2、B3、B4分別為1/2 MS、MS、WPM、B5培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果。圖1 八月瓜莖段啟動(dòng)培養(yǎng)效果

不同的基本培養(yǎng)基所含的生長(zhǎng)元素各有特點(diǎn),篩選適宜的基本培養(yǎng)基是了解植物培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)所需的基本手段。MS培養(yǎng)基硝酸及銨鹽濃度較高,即含N量高,1/2 MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度降低,即含N量降低,B5屬于高無(wú)機(jī)鹽、高 KNO3培養(yǎng)基,WPM是MS改良培養(yǎng)基,適合木本植物生長(zhǎng)[7-9]。試驗(yàn)中,八月瓜在WPM培養(yǎng)基中表現(xiàn)較突出,芽誘導(dǎo)率67.59%均高于MS、1/2 MS、B5培養(yǎng)基,這與同屬的白木通研究結(jié)果一致[10],在WPM培養(yǎng)基中能誘導(dǎo)部分叢生芽,而其他培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的均只是單芽,這可能與WPM培養(yǎng)基中含有大量的Ca2+,Ca2+能夠促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、物質(zhì)合成等生理反應(yīng)有關(guān)[11]。

4 結(jié) 論

八月瓜的初代組織培養(yǎng)中,篩選出70%酒精30 s+0.1% HgCl212 min是八月瓜幼嫩帶芽莖段最適宜的消毒方式,污染率19.82%,成活率達(dá)81.47%;最佳的基本培養(yǎng)基是WPM,芽誘導(dǎo)率為67.59%。本試驗(yàn)只探討了八月瓜莖段初代組織培養(yǎng)的基本條件,后續(xù)體系建立有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)類型及其標(biāo)志