蔣全興，張 果，韋皓琪，張思睿，龔昱丹，余函芮，殷中瓊，2，鄒元鋒，2*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院天然藥物研究中心，四川 成都 611130；2.四川省動(dòng)物疾病與人類(lèi)健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）

“生脈飲”收錄于《中國(guó)藥典》，是由人參、麥冬及五味子組成的傳統(tǒng)中藥復(fù)方，有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津的功效。生產(chǎn)實(shí)踐中，人參的主根和麥冬的塊根被采收，留下的須根并未得到有效合理地利用而遭到浪費(fèi)。筆者課題組研究發(fā)現(xiàn)須根和主根塊根間的大類(lèi)成分相似，因此本試驗(yàn)選用了人參和麥冬的非藥用部位——須根作為原料，提取其中的多糖，制備顆粒并添加至免疫低下小鼠的飼料中，研究參麥須根多糖的免疫活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥材 人參須根購(gòu)買(mǎi)于成都荷花池中藥材市場(chǎng)，麥冬須根采自四川三臺(tái)縣。將人參須根和麥冬須根用蒸餾水洗凈、烘干，再用藥材粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩備用。

1.2 主要試劑和儀器 乙醇、苯酚（5%）、濃硫酸（98%）、淀粉、糊精、無(wú)水葡萄糖，藥材粉碎機(jī)、恒溫電熱套、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器、iMark酶標(biāo)儀。

1.3 藥材除雜 參麥須根的除雜：取100 g 人參須根和麥冬須根粉末置于圓底燒瓶中，圓底燒瓶放置于水浴鍋中，通入冷凝水以達(dá)到冷凝回流的效果，加入15 倍的無(wú)水乙醇溶液，在水浴鍋中加熱1 h為一次除雜，共除雜5次。

1.4 參麥須根多糖提取工藝的優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn) 采用水提法優(yōu)化提取工藝，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)的篩選，考察因素有料液比、提取溫度和提取時(shí)間。每個(gè)因素設(shè)置5 個(gè)水平，料液比設(shè)1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55 g/mL，提取時(shí)間設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取溫度設(shè)80、85、90、95、100℃，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù)。按照上述水提條件獲取水提液，并離心5min（3500r/min），小心吸取上清液200 μL轉(zhuǎn)移至潔凈玻璃試管中，采用苯酚-硫酸法測(cè)定上清液中的總多糖含量，計(jì)算得率。

1.4.2 正交試驗(yàn) 通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選后最終確定每個(gè)水平的最優(yōu)條件，在最優(yōu)條件附近取兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)。用SPSS 25.0 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表，按照表中的條件組合進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而確定參麥須根多糖的最優(yōu)水提工藝。

1.4.3 總多糖含量的測(cè)定 精密吸取樣品溶液50 μL 置于容量瓶中，定容至1 mL，再精密量取200 μL于試管中，加入5%苯酚溶液200 μL，迅速加入1 mL 98% H2SO4，搖勻后靜置30 min，吸取200 μL于96孔板中，以蒸餾水作空白對(duì)照。在多糖的最大吸收峰490 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)，按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量（葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示），每個(gè)樣品檢測(cè)3 次，計(jì)算提取率。計(jì)算公式如下：

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.4 參麥須根多糖顆粒的制備 將按最佳工藝得到的參麥須根提取液減壓濃縮至1 g/mL，加入4 倍無(wú)水乙醇靜置12 h，然后將下沉沉淀轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中離心10 min（3 500 r/min），取沉淀物與淀粉-糊精的混合物按1∶1.5 的比例混合均勻至“握之成團(tuán)、觸之即散”的狀態(tài)，其中淀粉、糊精混合物的比例為2∶1，過(guò)篩后放置烘箱中烘干得到。

1.5 參麥須根多糖顆粒對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將60 kg基礎(chǔ)日糧磨制成粉，均分三份，在飼料中以0.25%、0.5%、1%的劑量加入多糖顆粒，拌勻。再用飼料顆粒機(jī)制成顆粒飼料，常溫保存。

試驗(yàn)一共選取50 只昆明小鼠，分為5 組，分別為空白對(duì)照組、模型組、低劑量組（0.25%）、中劑量組（0.5%）和高劑量組（1%）?？瞻捉M小鼠腹腔注射生理鹽水，其余組別的小鼠以每天60 mg/kg 的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺（CY），連續(xù)3 d，至小鼠出現(xiàn)精神萎靡和被毛逆立為造模成功。模型建立后，飼喂上述添加了參麥須根多糖的飼料10 d，每天關(guān)注小鼠的采食、體重等基礎(chǔ)指標(biāo)。

1.5.2 對(duì)臟器指數(shù)的影響 試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，采集小鼠眼球血1.5 mL 于EP 管中，然后脫頸處死小鼠，小心摘除脾臟和胸腺，用濾紙吸干表面的血液，然后用電子天平（感量0.1 mg）稱(chēng)重。

1.5.3 對(duì)血清中抗體及細(xì)胞因子分泌的影響 眼球血采集后先靜置30～60 min，使大部分纖維蛋白沉淀，然后以4 000 r/min 于4 ℃條件下離心15 min，小心吸取上清，分裝，-20 ℃冰箱保存。采用小鼠專(zhuān)用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒檢測(cè)小鼠血清中分泌抗體IgG 及細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因數(shù)方差分析（ANOVA），采用LSD法進(jìn)行組間多重比較。當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異顯著；P＜0.01時(shí)，表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 參麥須根多糖的提取工藝

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 由圖2 可知，多糖提取率隨溫度增加而增加，當(dāng)達(dá)到100 ℃時(shí)多糖提取率最高，達(dá)到19.89%。因此，選擇提取溫度100 ℃為中心值，并選取90 ℃和95 ℃2個(gè)水平再進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

圖2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖3 可知，多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加而增加，在2.0h時(shí)提取率最高（24.44%），在2.5h后提取率下降。因此，將2.0 h 設(shè)定為中間值，在兩邊取1.5 h 和2.5 h 兩個(gè)水平再進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖4可知，提取料液比在1∶25g/mL時(shí)提取率達(dá)到最高（25.14%），隨著料液比的增加，其提取率有降低的趨勢(shì)。因此，將料液比1∶25 g/mL 設(shè)為中心值，在兩邊取1∶20 和1∶35 g/mL 兩個(gè)水平再進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

圖4 提取料液比對(duì)多糖得率的影響

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 利用SPSS 25.0 軟件設(shè)計(jì)出9 組組合進(jìn)行正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1），通過(guò)軟件分析可知，對(duì)多糖提取含量的影響因素中，提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比，其中提取溫度和提取時(shí)間都對(duì)多糖得率有顯著性影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)最終分析出最優(yōu)提取工藝如下：提取溫度100℃，提取時(shí)間為2.5h，料液比為1∶35g/mL。

表1 正交試驗(yàn)表

按照正交分析得出最優(yōu)組合的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得多糖提取率為（29.62±0.95）%，大于正交試驗(yàn)中最大組合的多糖含量，符合試驗(yàn)預(yù)期。

2.2 參麥須根多糖顆粒對(duì)免疫低下小鼠的臟器指數(shù)的影響 由表2 可知，當(dāng)對(duì)環(huán)磷酰胺造成的免疫低下小鼠使用參麥須根多糖顆粒后，所有組別的脾臟指數(shù)都顯著高于模型組（P＜0.05），且低、中、高劑量組呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。對(duì)胸腺指數(shù)而言，各個(gè)組別間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但是各劑量組之間也呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。

表2 各組的臟器指數(shù)比較

2.3 參麥須根多糖顆粒對(duì)血清免疫因子含量的影響 為了進(jìn)一步說(shuō)明參麥須根多糖顆粒的免疫調(diào)節(jié)作用，本研究通過(guò)ELISA 試劑盒測(cè)定了小鼠血清中免疫球蛋白細(xì)胞因子的分泌變化。結(jié)果顯示：添加參麥須根多糖顆粒后，除低劑量組外，其余組別小鼠血清中的免疫球蛋白IgG和IL-2含量與模型組之間都有顯著性差異（P＜0.05），且趨勢(shì)相同，其中中劑量組顯著低于空白組（P＜0.05），又顯著高于模型組（P＜0.05），高劑量組極顯著的高于模型組（P＜0.01）；對(duì)細(xì)胞因子IL-10含量的影響則是，高劑量組和空白組血清中的IL-10 含量顯著高于模型組（P＜0.05），其余組別無(wú)顯著性差異；空白組血清中的IFN-γ含量顯著高于模型組。

3 討論

3.1 提取因素對(duì)多糖提取率的影響 人參和麥冬均為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，多糖是其中發(fā)揮效果的最主要活性物質(zhì)之一，是研究的重點(diǎn)。然而，本試驗(yàn)提取的是人參須根和麥冬須根中的多糖，目前鮮有研究報(bào)道。張國(guó)榮等［1］以料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素考察了紅參多糖的最佳提取工藝。結(jié)果如下：料液比1∶8，溫度為100 ℃，次數(shù)為3 次，時(shí)間為3 h；對(duì)提取率的影響依次為提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。李晶等［2］研究表明，麥冬多糖最優(yōu)水提工藝中對(duì)提取率的影響因素依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比。本研究中對(duì)參麥須根多糖提取率的影響因素依次為提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比，這與本課題組之前的研究結(jié)論一致［3］，原因是參麥須根和主根的大類(lèi)成分相似，因此對(duì)提取率的影響因素也相同。

3.2 參麥須根多糖對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié) 多糖作為主要的活性大分子，是有提高免疫力、提高抗氧化能力、抗炎抗腫瘤等多種藥理活性，多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)為免疫增強(qiáng)或免疫刺激［4］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加參麥須根多糖顆粒后可以改善環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠引起的免疫抑制，從而提高免疫器官的重量，這與伍芳芳［5］的研究結(jié)果一致。此外，本試驗(yàn)分別檢測(cè)了環(huán)磷酰胺造模引起的免疫低下小鼠血清中的IgG、IL-2、IL-10、IFN-γ含量，作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫水平的指標(biāo)，以綜合判斷小鼠的免疫性能。IgG 作為機(jī)體中免疫球蛋白的主成分，其含量的多少與機(jī)體免疫力的高低直接相關(guān)，本試驗(yàn)中采食了參麥須根多糖日糧的小鼠體內(nèi)的IgG含量顯著提高。IL-2能刺激T 細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，增強(qiáng)T 細(xì)胞的殺傷活性，本試驗(yàn)中中、高劑量組的參麥須根多糖均能提高血清中IL-2的含量，這與之前的研究結(jié)果一致［6］。IL-10 是機(jī)體內(nèi)重要的抗炎因子之一，它的表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，在維持正常免疫調(diào)節(jié)中作用顯著，本研究發(fā)現(xiàn)高劑量的多糖增加了血清中IL-10 的含量，與林?。?］的研究結(jié)果一致。IFN-γ也能激活免疫細(xì)胞，控制細(xì)胞增殖，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，本研究結(jié)果表明添加參麥須根多糖能顯著增加IFN-γ的含量。

4 結(jié)論

本研究表明，參麥須根多糖的最優(yōu)提取工藝為：提取溫度100 ℃，提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶35 g/mL，其多糖提取率為（29.62±0.95）%。將參麥須根多糖飼喂免疫低下小鼠后，與模型組相比能顯著增加脾臟指數(shù)，同時(shí)能顯著增加血清中的IgG和IL-2含量，對(duì)IL-10和IFN-γ的含量也有一定提升作用；且以添加量為1%時(shí)效果最佳，幾乎能完全消除來(lái)自環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制。因此，把參麥須根多糖顆粒作為一種潛在的免疫調(diào)節(jié)藥物添加至飼料中，將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。