史冊(cè),高運(yùn),楊光輝*

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院,南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)宿遷醫(yī)院骨科,江蘇 宿遷 223800;2.揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院骨科,江蘇 揚(yáng)州 225100)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以骨量降低、骨質(zhì)脆性增加而易于骨折為特征的常見(jiàn)骨骼代謝性疾病,對(duì)中國(guó)居民的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅[1]。既往研究表明,破骨細(xì)胞的數(shù)量異常增多以及功能異?；罨赡苁菍?dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的直接致病原因[2]。破骨細(xì)胞作為體內(nèi)唯一行使骨吸收功能的細(xì)胞,由骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)表面集落刺激因子-1受體(colony stimulating factor 1 receptor,CSF-1R)及核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)受體分別與巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,MCSF)及RANKL結(jié)合啟動(dòng)下游信號(hào)通路,最終分化而成[3]。MCSF屬于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs),能促使BMMs轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞并促進(jìn)其增殖,同時(shí)可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)RANK受體增加,進(jìn)一步促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)G蛋白抑制性α亞單位1/3(Gαi1/3蛋白)在腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、干細(xì)胞因子(stem cellfactor,SCF)等RTKs介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[5-7],而其在同為RTKs的MCSF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的作用尚不清楚。本研究著重探討Gαi1/3蛋白在調(diào)控破骨細(xì)胞生成的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮的作用,為防治骨質(zhì)疏松癥提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用8～10周齡野生型(wild type,WT)雌性C57BL/6小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)(SCXK(滬)2017-0005];Gαi1/3雙敲除(Gαi1/3-double knock out,Gαi1/3-DKO)C57BL/6雌性小鼠由吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司(上海)構(gòu)建完成。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑:α-MEM培養(yǎng)基(Corning公司,美國(guó));胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司,美國(guó));二甲亞砜(Abcam,中國(guó));重組小鼠MCSF蛋白、RANKL蛋白(Abcam公司,英國(guó));scr-shRNA、Gαi1-shRNA、Gαi3-shRNA(吉瑪制藥技術(shù)有限公司,中國(guó));Gαi1、Gαi3一抗(Santa Cruz公司,美國(guó));p-Akt473、Akt1/2/3、p-GSK3β、GSK3β、NFATc1一抗(Cell Signaling Technology公司,中國(guó));抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)(Sigma公司,英國(guó))。

主要儀器:酶標(biāo)儀(TECAN公司,瑞士);倒置顯微鏡(NIKON公司,日本),Micro CT掃描機(jī)(通用公司,美國(guó));低溫高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠BMMs提取及純化 將8～10周齡野生型及Gαi1/3-DKO雌性C57/BL6小鼠斷頸處死,切取下肢并剔除所附軟組織,剪除股骨及脛骨兩端軟骨沖取髓腔內(nèi)細(xì)胞,沖洗液經(jīng)70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后1 200 rpm離心5 min,吸棄上清液后加入2 mL紅細(xì)胞裂解液吹打重懸后靜置裂解2 min,加入4 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)終止裂解予1 200 rpm離心5 min,棄上清即得小鼠BMMs,加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后吸取上清液,同法離心棄上清,加入預(yù)制培養(yǎng)基[α-MEM+10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+50 ng/mL MCSF],培養(yǎng)2～3 d所得貼壁細(xì)胞即為純化BMMs。

1.3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 將所得純化BMMs以5×104/孔密度鋪板于6孔培養(yǎng)板中,待24 h細(xì)胞數(shù)量增殖約為1×105加入依據(jù)感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=10配置的含有scr-shRNA、Gαi1-shRNA和Gαi3-shRNA的無(wú)雙抗培養(yǎng)基(α-MEM+10%FBS),24 h后更換為無(wú)病毒培養(yǎng)基培養(yǎng),定期于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.3.3 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及TRAP染色 以5×104/mL密度于6孔培養(yǎng)板中接種先前成功轉(zhuǎn)染慢病毒BMMs,加入濃度50 ng/mL MCSF+50 ng/mL RANKL進(jìn)行誘導(dǎo),每2 d更換培養(yǎng)液至第4天破骨細(xì)胞分化成熟。依據(jù)TRAP操作說(shuō)明書進(jìn)行染色,使用倒置顯微鏡進(jìn)行樣本拍照,觀察破骨細(xì)胞大小及數(shù)量。

1.3.4 蛋白免疫印跡(western blot,WB) 待檢測(cè)預(yù)處理BMMs及分化成熟破骨細(xì)胞,使用RIPA裂解液提取蛋白。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離總蛋白,再轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)上,脫脂牛奶封閉1 h,4 ℃孵育一抗Gαi1、Gαi3、p-Akt473、Akt1/2/3、p-GSK3β、GSK3β、NFATc1搖床過(guò)夜,隨后二抗孵育2 h,完成后使用PBS加Tween20(PBS plus tween 20,PBST)清洗后加入電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi luminescence,ECL)壓片顯影,使用Image J軟件定量分析目標(biāo)條帶。

1.3.5 小鼠骨質(zhì)疏松模型制備及給藥 隨機(jī)選擇12只6～7周齡雌性C57/BL6小鼠分為scr-shRNA及Gαi1/3-shRNA兩組各6只,喂養(yǎng)1周后行去勢(shì)手術(shù),術(shù)后3 d每只小鼠予肌注青霉素40 000 U預(yù)防感染。兩組小鼠術(shù)后第4天腹腔麻醉下予右側(cè)股骨干骺端微量注射慢病毒scr-shRNA及Gαi1/3-shRNA(每側(cè)1 μL,滴度為3×108U/mL),持續(xù)7 d。

1.3.6 骨骼樣本收集及Micro CT檢測(cè) 4周后將兩組小鼠脫頸處死,剝?nèi)∮覀?cè)股骨予多聚甲醛固定,3 d后行Micro CT檢查。掃描分辨率為10 μm,自生長(zhǎng)板底部0.5 mm處開(kāi)始掃描,應(yīng)用內(nèi)置軟件對(duì)干骺端松、皮質(zhì)骨進(jìn)行圖像重建及骨量測(cè)量。

2 結(jié) 果

2.1 BMMs中轉(zhuǎn)染shRNA慢病毒抑制Gαi1/3表達(dá) 為探討Gαi1/3在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控作用,采用shRNA慢病毒干擾方法,通過(guò)scr-shRNA(GFP-RNA)、Gαi1-shRNA和Gαi3-shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至WT BMMs中,24 h后在熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染情況(見(jiàn)圖1a)。轉(zhuǎn)染成功后WB證實(shí)BMMs中Gαi1/3蛋白表達(dá)受到顯著抑制(見(jiàn)圖1b)。

a scr-shRNA、Gαi1-shRNA、Gαi3-shRNA 慢病毒序列及轉(zhuǎn)染后熒光圖

2.2 敲減Gαi1/3抑制MCSF及MCSF+RANKL誘導(dǎo)Akt-GSK3β-NFATc1通路的活化 scr-shRNA、Gαi1/3-shRNA轉(zhuǎn)染W(wǎng)T BMMs成功后使用MCSF(50 ng/mL)、RANKL(50 ng/mL)、MCSF(50 ng/mL)+RANKL(50 ng/mL)處理30 min,WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,敲減Gαi1/3顯著抑制MCSF及MCSF+RANKL誘導(dǎo)Akt-GSK3β-NFATc1通路活化(見(jiàn)圖2a～b),而對(duì)RANKL誘導(dǎo)通路活化影響無(wú)顯著抑制作用(見(jiàn)圖2c)。

a MCSF誘導(dǎo)敲減Gαi1/3的BMMs中Akt-GSK3β-NFATc1通路蛋白表達(dá)

2.3 敲除Gαi1/3抑制MCSF及MCSF+RANKL誘導(dǎo)Akt-GSK3β-NFATc1通路的活化 為進(jìn)一步研究Gαi1/3對(duì)MCSF等因子活化作用影響,提取CRISPR/Cas9-Gαi1/3-DKO雌性C57BL/6小鼠的BMMs,同樣應(yīng)用MCSF(50 ng/mL)、RANKL(50 ng/mL)、MCSF(50 ng/mL)+RANKL(50 ng/mL)處理30 min,WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲除Gαi1/3顯著抑制MCSF及MCSF+RANKL誘導(dǎo)Akt-GSK3β-NFATc1通路活化(見(jiàn)圖3a～b),而對(duì)RANKL誘導(dǎo)通路活化無(wú)顯著抑制作用(見(jiàn)圖3c)。

a MCSF誘導(dǎo)敲除Gαi1/3的BMMs中Akt-GSK3β-NFATc1通路蛋白表達(dá)

2.4 敲減Gαi1/3抑制破骨分化關(guān)鍵蛋白表達(dá)及破骨細(xì)胞分化 采用WB進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲減Gαi1/3顯著抑制MCSF(50 ng/mL)+RANKL(50 ng/mL)誘導(dǎo)4 d的破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵蛋白NFATc1的表達(dá)(見(jiàn)圖4a),同時(shí)顯著抑制破骨細(xì)胞生成數(shù)量(見(jiàn)圖4b)。

a 敲減Gαi1/3破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵蛋白NFATc1的表達(dá)

2.5 敲減Gαi1/3減輕小鼠骨質(zhì)疏松模型中的骨質(zhì)丟失 分別向WT小鼠骨質(zhì)疏松模型股骨干骺端注射scr-shRNA、Gαi1/3-shRNA,4周后行Micro CT檢查敲減Gαi1/3可顯著減輕骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨質(zhì)丟失,進(jìn)一步分析顯示敲減Gαi1/3對(duì)于松質(zhì)骨丟失的挽救作用略高于皮質(zhì)骨的丟失(見(jiàn)圖5)。

a 小鼠骨質(zhì)疏松模型股骨干骺端注射scr-shRNA、Gαi1/3-shRNA后Gαi1/3表達(dá)

3 討 論

既往研究表明骨質(zhì)疏松癥主因在于骨代謝失衡骨吸收增多所致,而破骨細(xì)胞數(shù)量增多及異?；罨蛔C實(shí)是骨吸收異常增多的主因[2]。目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物可導(dǎo)致下頜骨缺血性壞死、骨重建紊亂等不良反應(yīng)[8],因此進(jìn)一步了解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制,針對(duì)性開(kāi)發(fā)更加安全的新型治療藥物顯得愈加迫切[9-10]。

G蛋白由α、β、γ三個(gè)亞單位構(gòu)成,其中Gα蛋白可分為Gi、Gs等6種類型亞基,既往研究顯示G蛋白抑制性α亞基(Gαi蛋白)可以與G蛋白耦聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)相互結(jié)合從而發(fā)揮介導(dǎo)下游信號(hào)傳遞的作用[11]。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)G蛋白抑制性α亞單位1/3(Gαi1/3)能夠介導(dǎo)多個(gè)RTKs諸如BDNF、VEGF、SCF等下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),通過(guò)敲減Gαi1/3可使其下游PI3K-Akt-mTOR、MAPK-Erk等通路的活化受到抑制[5-7]。

為進(jìn)一步明確Gαi1/3在同屬于RTKs的MCSF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用,本研究采用MCSF和RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)原代BMMs分化破骨細(xì)胞,該方法接近破骨細(xì)胞體內(nèi)分化微環(huán)境,目前廣泛用于骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展調(diào)控的研究[9]。本研究采用慢病毒敲減及基因敲除策略,獲取scr-shRNA、Gαi1/3-shRNA及Gαi1/3-DKO三種BMMs,研究中發(fā)現(xiàn)敲減、敲除Gαi1/3可顯著抑制經(jīng)典破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路Akt-GSK3β-NFATc1中關(guān)鍵蛋白的表達(dá),尤其是終末分化關(guān)鍵蛋白NFATc1[12]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲減、敲除Gαi1/3對(duì)于RANKL誘導(dǎo)的Akt-GSK3β通路活化無(wú)顯著抑制作用,考慮RANKL不屬于RTKs且Gαi1/3未參與核因子NF-κb等主要傳導(dǎo)通路所致,與前期既往研究結(jié)果一致[13-16]。本研究Gαi1/3-shRNA BMMs中加入MCSF 50 ng/mL+RANKL 50 ng/mL聯(lián)合誘導(dǎo)4 d進(jìn)行染色顯示生成的破骨細(xì)胞的細(xì)胞核較少及體積明顯縮小,且生成數(shù)量顯著減少,提示敲減Gαi1/3對(duì)于BMMs向破骨細(xì)胞分化有顯著的抑制作用。最后體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,在小鼠骨質(zhì)疏松模型中股骨干骺端注射Gαi1/3-shRNA可顯著抑制去勢(shì)雌鼠的骨質(zhì)丟失,且對(duì)松質(zhì)骨的丟失有更強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)趨勢(shì),進(jìn)一步證實(shí)Gαi1/3蛋白在骨質(zhì)疏松進(jìn)程中扮演關(guān)鍵角色。

既往研究顯示MCSF對(duì)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的存活和增殖是必需的,同時(shí)MCSF含量與破骨細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān),MCSF基因缺陷可導(dǎo)致小鼠先天性骨質(zhì)硬化癥,而外源性補(bǔ)充MCSF可促進(jìn)骨硬化癥小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)量增多恢復(fù)骨吸收功能[17]。目前對(duì)于MCSF調(diào)控破骨細(xì)胞分化的研究主要集中在MCSF受體c-fms及相關(guān)信號(hào)通路[18],而本研究著重于探討Gαi1/3蛋白對(duì)于破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用,從而進(jìn)一步明確MCSF調(diào)控破骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制并對(duì)其進(jìn)行干預(yù),對(duì)于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松具有重要的臨床意義。

綜上所述,本研究從分子、細(xì)胞及在體實(shí)驗(yàn)初步解析Gαi1/3蛋白通過(guò)介導(dǎo)Akt-GSK3β-NFATc1信號(hào)通路調(diào)控破骨細(xì)胞分化機(jī)制,可為臨床治療骨質(zhì)疏松提供新的思路和治療靶點(diǎn)。