馮永笑 張丑丑 董艷琴 趙曉亮

急性髓系白血病(AML)是一種髓系干細(xì)胞前體(紅細(xì)胞、血小板和除B和T細(xì)胞之外的白細(xì)胞)惡性腫瘤[1];病程進(jìn)展十分迅速,發(fā)病率隨著年齡的增長而增加,患者存活率較低且預(yù)后不佳[2,3]。目前,AML的臨床治療方法包括誘導(dǎo)分化治療、聯(lián)合化療、造血干細(xì)胞移植和免疫治療,最常見的還是藥物和化療,但由于化療耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致患者預(yù)后較差,探索新的更安全而有效的治療方式已亟不可待。MicroRNAs (miRNAs)是一類短鏈非編碼RNAs,長度為18～25個核苷酸,通過靶向下游mRNAs影響細(xì)胞分化、增殖和存活[4]。越來越多的證據(jù)表明miRNAs參與了人類癌癥的發(fā)展,失調(diào)的miRNAs已被確定在AML發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5];且一些miRNAs已被證明與AML患者的預(yù)后相關(guān),例如miR-12462[6]和miR-155[7]。在miRNAs中,miR-186位于染色體1p31.1,在鋅指蛋白265基因的第8個內(nèi)含子處,已在多種癌癥中得到廣泛研究,在癌癥中的作用取決于其對多種腫瘤生物學(xué)行為的影響,包括細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞周期等。糖酵解是能量供應(yīng)的主要方式,是腫瘤細(xì)胞的特征表型之一,miR-186可以抑制胃癌細(xì)胞的糖酵解[8]。研究報(bào)道稱miR-186在皮膚鱗狀細(xì)胞癌[9]中表達(dá)上調(diào),而在骨肉瘤[10]、肺癌[11]及口腔鱗狀細(xì)胞癌[12]中表達(dá)下調(diào)。另有研究表明,miR-186在AML患者中低表達(dá),并且與患者的低生存率相關(guān)[13],上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和遷移,且EMT相關(guān)因子E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和AML患者的不良預(yù)后相關(guān)[14-16]。觀察過表達(dá)miR-186對AML細(xì)胞增殖、遷移、糖酵解及EMT的影響,探討miR-186在白血病細(xì)胞中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人白血病細(xì)胞HL-60,購自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 藥品與試劑：miR-186 mimic、陰性對照片段(mimic NC)由北京華大基因設(shè)計(jì)合成,Lipofectamine2000陽離子脂質(zhì)體(美國Invitrogen公司),胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司),活細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)試劑盒(南京諾唯贊生物技術(shù)股份有限公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(杭州主諾生物技術(shù)有限公司),萄糖檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒(美國BioVision公司),RIPA裂解液(美國ABW公司),BCA蛋白試劑盒(英國Abcam公司),鼠抗人(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(二抗)(美國CST公司)。

1.1.3 儀器：BC-J160型細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司),7500型實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)儀器(美國ABI公司),IX71型光學(xué)倒置顯微鏡(日本Olympus公司),Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司),OI-1000型凝膠成像系統(tǒng)(廣州光儀生物科技有限公司),血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海梵態(tài)生物科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：在37℃、5% CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),將HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10% FBS)中,對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將白血病細(xì)胞分為3組,分別為對照組、mimic NC組、miR-186過表達(dá)組,對照組細(xì)胞不做轉(zhuǎn)染處理,mimic NC組采用脂質(zhì)體法將mimic NC轉(zhuǎn)染至白血病細(xì)胞,而miR-186過表達(dá)組采用脂質(zhì)體法將miR-186 mimic轉(zhuǎn)染至白血病細(xì)胞。然后收集轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 測定指標(biāo)

1.2.3.1 RT-qPCR測定HL-60細(xì)胞中miR-186相對表達(dá)量：Trizol試劑盒提取RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲取cDNA模版。然后參照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件設(shè)置：在94℃下分別預(yù)變性5 min及變性35 s,在58℃和72℃下分別退火35 s及延伸35 s,設(shè)置40次循環(huán)。miR-186以U6為內(nèi)參,E-cadherin,N-cadherin和Vimentin以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCT法計(jì)算miR-186、E-cadherin,N-cadherin和Vimentin相對表達(dá)量。見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.3.2 倒置顯微鏡觀察HL-60細(xì)胞的形態(tài)：細(xì)胞分組同2.2,將轉(zhuǎn)染后的HL-60細(xì)胞接種到12孔板中,每孔加約2×105個細(xì)胞,每組設(shè)置3個復(fù)孔,24 h后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

1.2.3.3 CCK-8法測定HL-60細(xì)胞的增殖：細(xì)胞分組同2.2,將轉(zhuǎn)染后的HL-60細(xì)胞用完全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸,以8×103個/孔的密度接種于96孔板,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h,后加入10 μl CCK-8溶液進(jìn)行孵育,2 h后使用酶標(biāo)儀測450 nm處各孔的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(OD對照組-ODmimic NC組或miR-186過表達(dá)組)/OD對照組×100%。

1.2.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)測定HL-60細(xì)胞的遷移能力：將轉(zhuǎn)染后的HL-60細(xì)胞接種到24孔板Transwell小室的上室中,每孔加入200 μl無血清的細(xì)胞懸液(1×106/ml),并在Transwell小室的下室中加入600 μl含10% FBS的RPMI-l640培養(yǎng)基;在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,取出Transwell小室,棉簽擦去小室薄膜上層細(xì)胞,PBS清洗Transwell小室后,用4%多聚甲醛固定薄膜下層細(xì)胞,然后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況,隨機(jī)選取3個視野,并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對遷移的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。遷移率=(mimic NC組或miR-186過表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù))/對照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3.5 用試劑盒檢測HL-60細(xì)胞糖酵解能力：取各組干預(yù)24 h處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,以2×105個/ml的密度接種于96孔板,待細(xì)胞融合度達(dá)約80%,收集細(xì)胞上清液,用乳酸含量檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清液中的乳酸生成量,葡萄糖含量檢測試劑盒檢測上清液中葡萄糖消耗水平,以不含細(xì)胞的對照孔培養(yǎng)液作為初始濃度。葡萄糖消耗量=初始葡萄糖濃度-實(shí)測葡萄糖濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.6 蛋白免疫印跡(WB)法檢測HL-60細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平：將轉(zhuǎn)染后的HL-60細(xì)胞用RIPA液在冰上進(jìn)行裂解,4℃,12 000 r/min離心20 min后,將上清蛋白變性,然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳,200 mA恒流轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后,參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin),4℃孵育過夜,隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗,孵育2 h。TBST洗滌后,加入顯影液,然后凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。蛋白灰度值用G表示,蛋白相對表達(dá)量=G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白(β-actin)。

2 結(jié)果

2.1 miR-186在不同腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平比較 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析miR-186在不同腫瘤組織中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示miR-186在血液科細(xì)胞中表達(dá)水平最高,白血病屬于血液科腫瘤,所以我們選擇miR-186作為干預(yù)手段在白血病細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 miR-186在不同腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平;hsa-miR-186-5p代表miR-186

2.2 HL-60細(xì)胞中miR-186表達(dá)水平比較 轉(zhuǎn)染24 h后,對照組、mimic NC組和miR-186過表達(dá)組 miR-186水平分別為1.01±0.16、0.97±0.09、1.90±0.06。與對照組和mimic NC組相比,miR-186過表達(dá)組miR-186表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);而mimic NC組與對照組比較,miR-186表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 過表達(dá)miR-186對HL-60細(xì)胞形態(tài)的影響 轉(zhuǎn)染24 h后,對照組與mimic NC組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;與對照組和mimic NC組相比,miR-186過表達(dá)組細(xì)胞生長受到抑制,數(shù)量減少,形狀不規(guī)則。見圖2。

對照組 mimic NC miR-186

2.4 過表達(dá)miR-186抑制HL-60細(xì)胞的增殖 不同組別吸光度值隨著時間增長呈逐漸上升趨勢,較對照組和mimic NC組,過表達(dá)miR-186細(xì)胞增殖延緩,在48、72 h時間點(diǎn),miR-186過表達(dá)組吸光度值顯著低于對照組和mimic NC組(P<0.05)。miR-186過表達(dá)組較mimic NC組在48 h和72 h細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)。見圖3,表2。

圖3 過表達(dá)miR-186對HL-60細(xì)胞增殖的影響

表2 細(xì)胞增殖抑制率

2.5 過表達(dá)miR-186抑制HL-60細(xì)胞的遷移 轉(zhuǎn)染24 h后,對照組、mimic NC組和miR-186過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力分別為(100.00±8.55)%、(99.14±3.83)%、(45.27±8.00)%。與對照組和mimic NC組相比,過表達(dá)miR-186顯著降低了HL-60細(xì)胞的遷移能力(P<0.05);mimic NC組與對照組比較,相對遷移率無顯著差異(P>0.05)。

2.6 過表達(dá)miR-186抑制HL-60細(xì)胞的糖酵解水平 相較于對照組和mimic NC組,miR-186組細(xì)胞的葡萄糖消耗水平和乳酸生成量顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對照組和mimic NC組葡萄糖消耗水平和乳酸生成量無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 過表達(dá)miR-186對人白血病HL-60細(xì)胞糖酵解水平的影響

2.7 過表達(dá)miR-186對HL-60細(xì)胞中EMT相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平影響 與對照組和mimic NC組相比,miR-186組N-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)量顯著降低,E-cadherin mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。對照組和mimic NC組E-cadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 RT-qPCR檢測HL-60細(xì)胞中EMT相關(guān)因子mRNA的表達(dá)水平

2.8 過表達(dá)miR-186抑制HL-60細(xì)胞的EMT進(jìn)程 本研究用WB方法檢測了EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對照組相比,mimic NC組HL-60細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的相對表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05);而較對照組和mimic NC組,miR-186過表達(dá)組中E-cadherin表達(dá)顯著升高,N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖4,表5。

圖4 WB檢測HL-60細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平

表5 WB檢測HL-60細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平

3 討論

AML是成人急性白血病中最常見的類型,目前臨床上最常見治療的仍然是藥物和化療,但化療有骨髓抑制、心臟毒副作用及易復(fù)發(fā)等特點(diǎn),且化療耐藥性能夠?qū)е骂A(yù)后不良。有研究表明,異常表達(dá)的miRNAs參與腫瘤的發(fā)生,這些miRNAs可以作為腫瘤分子標(biāo)志物,通過干擾或重建相關(guān)miRNAs可能是腫瘤治療的一種潛在途徑,過表達(dá)miR-204可以抑制AML細(xì)胞的增殖和遷移[17]。多項(xiàng)研究表明,miR-186在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá),過表達(dá)miR-186能夠抑制非小細(xì)胞肺癌[18]、膀胱癌[19]細(xì)胞的增殖和遷移,提示了miR-186在腫瘤發(fā)展及抗腫瘤治療中的作用。本研究指出miR-186在血液科腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平最高,白血病屬于血液科腫瘤,所以選擇miR-186進(jìn)行實(shí)驗(yàn),而且miR-186在AML患者中屬于低表達(dá)[13],因此本研究過表達(dá)miR-186干預(yù)AML細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miR-186組miR-186表達(dá)量顯著升高,驗(yàn)證了過表達(dá)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染成功。惡性的增殖和遷移是AML細(xì)胞兩個主要的生物過程,對AML的發(fā)展起著關(guān)鍵作用。本研究通過評估m(xù)iR-186對HL-60細(xì)胞的增殖和遷移的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-186能夠顯著地抑制白血病細(xì)胞HL-60的生長、增殖和遷移能力,這與其在肝癌[20]細(xì)胞中的作用相符。腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性顯著高于正常細(xì)胞,并且在氧含量充足條件下仍選擇糖酵解的方式進(jìn)行能量代謝,主要表現(xiàn)為乳酸生成增多及葡萄糖消耗變快。乳酸的不斷累積會形成酸性微環(huán)境,有利于腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、免疫逃逸等反應(yīng)[21]。本研究結(jié)果表明過表達(dá)miR-186對HL-60細(xì)胞糖酵解的抑制作用,提示miR-186過表達(dá)通過抑制AML細(xì)胞的糖酵解,減少細(xì)胞增殖、遷移需要的能量和營養(yǎng),從而抑制細(xì)胞的生長、增殖和遷移能力。

EMT是指細(xì)胞由上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型,激活后在生物體的發(fā)育以及上皮性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用,是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的關(guān)鍵因子[22]。EMT作為惡性腫瘤預(yù)后的主要影響因素,在AML患者中與其不良預(yù)后相關(guān),EMT相關(guān)因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)和疾病侵略性相關(guān),其能夠促進(jìn)AML的進(jìn)程[23]。并且有報(bào)道稱miRNAs能夠通過調(diào)節(jié)EMT抑制AML的發(fā)展,如miR-148a-3p和miR-608[24,25]。Lu等[20]證實(shí)miR-186通過直接靶向CDK6抑制肝癌細(xì)胞的EMT;Sun等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-186能夠通過調(diào)節(jié)Twist1表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT。與這些報(bào)道相似,本研究結(jié)果提示,過表達(dá)miR-186增加了AML細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá),減少了間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá),提示過表達(dá)miR-186可以通過上調(diào)E-cadherin及下調(diào)N-cadherin和Vimentin抑制AML細(xì)胞的EMT進(jìn)程,這些變化可以導(dǎo)致細(xì)胞粘附性降低,從而抑制了細(xì)胞的增殖和遷移能力。

綜上所述,miR-186通過減弱白血病HL-60細(xì)胞EMT進(jìn)程抑制細(xì)胞的增殖、遷移和糖酵解,進(jìn)而抑制AML的進(jìn)展。該結(jié)果為miR-186在AML治療的應(yīng)用上提供了參考依據(jù)。但美中不足的是本研究僅使用了單一的白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞系,并未檢測miR-186在其他細(xì)胞系中的作用,且本研究僅限于體外研究,未在動物模型中進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證,這些不足將成為我們接下來要進(jìn)行研究的一個方向,繼續(xù)深入探討miR-186對AML治療的作用機(jī)制。