陳趙杰，陳偉明，莫萌苗，于淑娟，孔繁晟*

(1 廣東華糖實業(yè)有限公司，廣東江門 529100；2 亞聯(lián)糖業(yè)(廣東)有限公司，廣東佛山 528211；3 廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006；4 華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640)

0 前言

甘蔗葉擁有豐富的活性成分，包括多酚、黃酮、多糖等[1]。其中，多糖作為甘蔗葉最重要的活性成分之一，因其獨特的抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等生物活性而受到越來越多的關(guān)注[1]。多糖的含量、結(jié)構(gòu)特性與其生物活性的強弱密不可分，因此，合適的對多糖的提取方法具有重要影響。熱水提取法方法簡單、安全性高，但溫度過高且耗時耗能，提取時間過長會使多糖降解，從而降低其藥理活性[2]。超聲輔助提取(UAE)是一種有效的提取方法[3]，其空化作用可以高效地破壞細胞壁、減小顆粒大小并增強溶劑與目標化合物之間的接觸[4]，并且在高效提取過程中對多糖的結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)的損害最小，具有能耗低、溶劑消耗小等優(yōu)點。因此，本研究通過響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化超聲提取甘蔗葉多糖SLP 工藝條件，以期為超聲輔助高效提取SLP 技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘蔗葉，購自廣西壯族自治區(qū)南寧市賓陽縣古辣鎮(zhèn)農(nóng)場；葡萄糖，分析純，山東金勝生物科技有限公司；苯酚、濃硫酸、正丁醇、氯仿、95%乙醇、石油醚(均為分析純)，天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘蔗葉多糖的提取工藝

將新鮮甘蔗葉(1.0 kg)曬干、切段、粉碎并過60目篩。依次通過石油醚和95%乙醇處理后在60℃下干燥后保存。將甘蔗葉粉末進行超聲輔助熱水提取，提取結(jié)束后，將多糖提取液以5000 r/min 的轉(zhuǎn)速條件下離心15 min。離心結(jié)束后，取適量的上清液進行甘蔗葉多糖(SLP)提取率的測定。

1.2.2 甘蔗葉多糖提取率的測定

采用苯酚-硫酸法[5]對上述甘蔗葉多糖總糖含量進行測定。于玻璃試管中加入適量的待測溶液加入去離子水定容至2.0 mL 后，依次加入1.0 mL5%的苯酚溶液，再緩慢加入濃硫酸5.0 mL，將反應(yīng)液振蕩混勻，冷卻10 min 后于490 nm 的波長下借助紫外分光光度計測定吸光度，并以吸光度為縱坐標，葡萄糖標準品溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。甘蔗葉多糖提取率(Y)按以下公式計算：

式(1)中，c代表多糖濃度(mg/mL)；V代表多糖提取液體積(mL)；D代表稀釋倍數(shù)；m代表甘蔗葉粉末重量(mg)。

1.2.3 甘蔗葉多糖的超聲輔助提取的單因素實驗

以超聲功率、超聲溫度、超聲時間及液料比為影響因素，研究超聲輔助提取下，超聲功率(240、300、360、420、480 W)、超聲溫度(20、40、60、80、100℃)、超聲時間(40、50、60、70、80 min)和液料比(20、30、40、50、60 mL/g)對甘蔗葉多糖提取率的影響。

1.2.4 甘蔗葉多糖的超聲輔助提取法響應(yīng)面優(yōu)化

通過響應(yīng)面方法(RSM)優(yōu)化甘蔗葉多糖各提取過程并評估多個變量及其相互作用的影響[6]。如表1所示，以單因素實驗為基礎(chǔ)，使用Box-Behnken 進行設(shè)計，設(shè)計3 變量3 水平實驗，各因素包括超聲時間(40、60、80 min)、超聲溫度(50、60、70℃)和液料比(30、40、50 mL/g)，并通過方差分析評估模型的重要性。

表1 因素水平表

1.2.5 傳統(tǒng)熱水提取甘蔗葉多糖

設(shè)計傳統(tǒng)熱水提取法提取作為對照組。簡而言之，樣品直接放入100℃的去離子水中水浴2 h，液料比為40︰1，其他操作步驟與條件與上述超聲輔助提取相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有涉及的實驗至少平行3 次。所得數(shù)據(jù)值表示為平均值±標準差(SD)。實驗通過單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。使用SPSS 26.0 和OriginPro 2021 進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗分析

葡萄糖標準曲線的線性回歸方程為：y=16.87x-0.0991，R2=0.9991，表明在 0.01～0.06 mg/mL 范圍內(nèi)，吸光度與葡萄糖標準溶液濃度的線性關(guān)系良好。

2.1.1 超聲提取功率對多糖得率的影響

如圖1 所示，隨著功率從240 W 增加到360 W，SLP 的提取率明顯增加(P＜0.05)。多糖的產(chǎn)率增加可能是由于該功能范圍內(nèi)的超聲波會產(chǎn)生較大的空化效應(yīng)，同時產(chǎn)生微射流和沖擊波，從而確保了更高的細胞降解和更高的溶劑滲透[8]。然而，功率大于360 W 時，功率過大會降低超聲能量傳輸?shù)浇橘|(zhì)中的效率[9]導(dǎo)致SLP 得率降低。

圖1 超聲功率對SLP 提取率的影響

2.1.2 超聲提取溫度對多糖得率的影響

由圖2 可看出，在超聲提取溫度為60℃時，多糖的最大提取率為1.97%。提取率隨溫度呈先升后降。該現(xiàn)象可能是高溫增加了多糖的溶解度，并促進了多糖從細胞中擴散出來及較高的溫度可能會導(dǎo)致多糖的不穩(wěn)定性，破壞多糖的結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致其降解。

圖2 超聲提取溫度對SLP 提取率的影響

2.1.3 超聲提取時間對多糖得率的影響

如圖3 所示，在60 min 的多糖得率最大，當超過60 min 時，多糖得率降低，預(yù)示著超聲時間的延長可能會導(dǎo)致細胞破壞的增加，最終導(dǎo)致多糖的降解。

圖3 超聲時間對SLP 提取率的影響

2.1.4 液料比對多糖得率的影響

如圖4 所示，隨著液料比的增加，多糖的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這表示在合適的液料比范圍內(nèi)，液料比越高，植物細胞內(nèi)外的濃度越大，多糖擴散越快。然而超出范圍后，混合物的濃度降低，從而降低超聲波能量傳輸?shù)男蔥8]。

圖4 液料比對SLP 提取率的影響

2.2 利用響應(yīng)面法(RSM)與Box-Behnken(BBD)設(shè)計優(yōu)化提取率

綜上所述，SLP 的提取在很大條件下受限于提取條件。單獨考慮各因素的最佳條件可以概括為：超聲提取功率為360 W，提取溫度為60℃，提取時間為40 mL/g。其次，將BBD 實驗設(shè)計與RSM 相結(jié)合，能更好地探討各因素之間的關(guān)聯(lián)性，最終確定最佳提取條件。單因素分析結(jié)果表明：超聲溫度、提取時間和液料比對多糖得率影響較大。因此，優(yōu)選這3 個因素。超聲提取時間為40～80 min，提取溫度為50～70℃，液料比為30～50 mL/g。

2.2.1 模型擬合

BBD 實驗設(shè)計和結(jié)果見表 2 。 采用Design-Expert 8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)實施多元非線性回歸模擬，根據(jù)下列公式計算出3 個因素與SLP 提取率相關(guān)的二次多元回歸方程。

式(2)中，A代表超聲提取溫度(℃)；B代表超聲提取時間(min)；C代表液料比(mL/g)；Y代表提取率(%)。方差分析結(jié)果如表3 所示。從表3 結(jié)果分析所得，模型Pvalue＜0.0001，表明此模型對提取率的響應(yīng)極顯著。失擬項的P值和F值分別為0.3721 和1.37，證明該模型模擬的準確性。此外，在回歸模型中，決定系數(shù)(R2)為0.9823，調(diào)整后的決定系數(shù)R2adj為0.9596，精密度高達16.463，變異系數(shù)(CV%)低至3.45，表明實驗值與預(yù)測值呈現(xiàn)高度相關(guān)性。3 個變量二次項F值順序為：A＞C＞B，表明3 個因素對SLP 提取率的影響順序依次為：超聲溫度(A)＞液料比(C)＞超聲時間(B)。

表3 SLP 提取率回歸模型的方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析

利用Design Expert 8.0.6 軟件繪制交互作用的二維等高線及三維響應(yīng)面圖(圖5)。如圖5a 所示，超聲溫度邊的曲線呈拋物線，而超聲時間邊幾乎保持直線，曲線較為平滑，這結(jié)果表明提取溫度對SLP得率的影響尤為重要。因為在一定范圍內(nèi)提高提取溫度可顯著破壞植物細胞壁，從而使溶劑充分滲透，促進細胞內(nèi)多糖擴散到溶劑中[10]。二維等高線稀疏，說明超聲溫度與超聲時間的交互作用并不明顯。如作用，對SLP 得率的影響顯著(P＜0.05)。圖5e 所示，液料比的斜率明顯大于超聲時間的斜率，表明液料比對SLP 得率的影響大于超聲時間且根據(jù)二維圖兩者的交互作用顯著。當液料比適當升高時，相對較大的溶劑濃度梯度同樣也提高了多糖的傳質(zhì)效率和驅(qū)動力，促進了超聲提取過程[10]。而當液料比從40 上升至50 mL/g，SLP 得率下降的原因可能是溶劑過多導(dǎo)致的多糖溶解度降低所致。圖5c 所示，三維圖響應(yīng)面的曲面陡峭，二位等高線密集，說明超聲溫度與液料比之間存在較大的交互

圖5 三因素交互作用的三維響應(yīng)面和二維等高線圖

2.2.3 預(yù)測模型的驗證和最佳工藝條件的確定

根據(jù)上述結(jié)果，RSM 優(yōu)化后的最佳條件為超聲溫度59.62℃、超聲時間59.55 min、液料比40.26 mL/g，SLP 得率預(yù)測為1.95%。根據(jù)實際條件及操作誤差考慮，最佳工藝條件修改為：超聲溫度60℃、超聲時間60 min、液料比40 mL/g。

為檢驗?zāi)Ｐ头匠淘谧罴秧憫?yīng)值預(yù)測中的準確性，進行了3 次平行實驗。SLP 實際得率為1.96%±0.12%，與預(yù)測值基本吻合(P＞0.05)。因此，結(jié)果表明所采用的回歸模型在RSM 優(yōu)化超聲輔助提取甘蔗葉多糖工藝研究條件的顯著性和適用性。

2.2.4 與傳統(tǒng)熱水提取法的比較

2 種不同方法提取 SLP 得率分別為1.96%±0.12%和0.89%±0.23%，UAE 大大提高了SLP得率(約120%)，并將提取時間從3 h 縮短至2 h，更能證明UAE 對于甘蔗葉多糖提取的優(yōu)異性。

3 結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取SLP 的最佳工藝條件為：超聲功率360 W、超聲溫度60℃、超聲時間60 min 及液料比40 mL/g。在此條件下SLP實際得率為1.96%±0.12%，與預(yù)測值1.95%基本吻合。此外，為了評估超聲輔助法(UAE)提取SLP 的提取效率，將其與傳統(tǒng)熱水法(HWE)進行比較，結(jié)果表明，通過UAE 法提取SLP 提取率提高約120%，提取時間從3 h 大大減少至2 h?？傮w而言，通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取甘蔗葉多糖工藝，不僅是甘蔗葉多糖提取工藝上的技術(shù)突破，該研究也為甘蔗葉多糖在工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。