劉 通，廖翔宇，陳玉寧，蔣 穎，陳瓊君，熊 亮，鄺偉川，文 希，劉 悅△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510095；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東 廣州 510095）

腦卒中嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命安全，其發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高。2019 年，發(fā)表于柳葉刀子刊《Lancet Neurology》的一項(xiàng)研究對(duì)1990 年至2019 年的204 個(gè)國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行了調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示：全球有1220 萬(wàn)中風(fēng)發(fā)病病例，1.01億中風(fēng)患病病例，1.43億傷殘調(diào)整壽命年中風(fēng)病例，以及655 萬(wàn)中風(fēng)死亡病例。該結(jié)果表明：中風(fēng)仍是世界第二大致死原因、第三大致殘?jiān)颍ò磦麣堈{(diào)整生命年衡量）[1]。在我國(guó)，缺血性腦卒中在所有腦卒中患者中所占比例可高達(dá)85%，缺血性腦卒中幸存者中約有3/4 的患者遺留有不同程度的勞動(dòng)能力喪失，給社會(huì)、家庭帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)[2-3]。因此，進(jìn)一步探討如何促進(jìn)腦卒中后肢體功能障礙的康復(fù)仍是全球亟待解決的問(wèn)題。

補(bǔ)氣活血合劑（原名：中風(fēng)復(fù)元合劑）是我院院內(nèi)制劑，對(duì)治療氣虛痰瘀型缺血性腦卒中有顯著的臨床療效[4-5]，然而其具體起效機(jī)制仍不明確。近期，有多項(xiàng)研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞均能分泌外泌體，并調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展，這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞衍生的外泌體在促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)炎癥和中風(fēng)后大腦重塑方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-7]。巢蛋白（Nestin）是神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，卒中后神經(jīng)細(xì)胞的再生多伴隨有Nestin 和GFAP 的表達(dá)升高[8-9]。因此，本研究擬觀察補(bǔ)氣活血合劑對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠血清外泌體及Nestin、GFAP蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確其起效機(jī)制，促進(jìn)補(bǔ)氣活血合劑的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取40 只成年雄性SPF 級(jí)SD 大鼠（廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXKC(粵)2022-0002），體重200±20g。于廣東省第二中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心分籠飼養(yǎng)，5 只/籠，溫度25℃左右，相對(duì)濕度50%～60%，明暗周期12h，自由飲水、攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)氣活血合劑組、合劑+GW4869 組各10 只。按科技部2006 年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，本研究經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：048604。

1.2 主要儀器與試劑

大鼠硅膠線栓（佳靈生物，廣州）；動(dòng)物用異氟烷（瑞普生物，天津）；氯化三苯基四唑（TTC）染色液（G3004，Solarbio）；戊二醛固定液（雷根生物，北京）；蘇木素染液（上海生工生物工程，上海），伊紅染液（索萊寶生物，北京）；Enhanced BCA Protein Assay Kit 測(cè)定試劑盒（P0009，Beyotime，China）；緩沖液（ES-8152，ECOTOP，China）；ECL Western Blotting Substrate（EX500B，ECOTOP，China）；Nestin、GFAP、CD63、GAPDH一抗（Abcam）。

1.3 模型制備

大腦中動(dòng)脈閉塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）大鼠模型復(fù)制采用Zea-Longa 改良法[10]：給予易氟烷（誘導(dǎo)濃度3%，維持濃度1.5%）吸入麻醉，氣體麻醉后，將大鼠仰臥固定，頸部脫毛、消毒，行頸部正中切口縱向切開(kāi)皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及迷走神經(jīng)。在頸總動(dòng)脈近心端予醫(yī)用縫合線結(jié)扎，予微動(dòng)脈夾夾閉頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，在頸總動(dòng)脈剪開(kāi)一小切口，將線栓經(jīng)該小切口沿頸總動(dòng)脈緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈插入，出現(xiàn)輕度阻力時(shí)停止，此時(shí)線栓上黑點(diǎn)大約位于頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉口上方1mm，線栓插入的深度約18.0±1.0mm，并在頸總動(dòng)脈處結(jié)扎，以防線栓脫落。最后松開(kāi)動(dòng)脈夾，如無(wú)活動(dòng)性出血后，逐層縫合皮膚。切口常規(guī)消毒，單籠飼養(yǎng)觀察。2h 后，將線栓拔出1cm 左右，動(dòng)物術(shù)后在25℃環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。假手術(shù)組僅行血管神經(jīng)分離操作，不作插線處理，其他操作相同。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組、模型組與補(bǔ)氣活血合劑組同步灌胃等劑量生理鹽水。補(bǔ)氣活血合劑組、合劑+GW4869組在缺血再灌注2h后開(kāi)始灌胃補(bǔ)氣活血合劑（粵藥制字Z20170002，廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供），10mL/kg，3 次/日，連續(xù)灌胃7 天；其中合劑+GW4869 組前3 天每次灌胃前予腹腔注射外泌體抑制劑GW4869（2.5mg/kg·d），以抑制大鼠外泌體釋放。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)估

根據(jù)Zea-Longa 評(píng)分表[10]的5 分制行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0 分：活動(dòng)正常，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1 分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，提尾時(shí)，對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲（為輕度神經(jīng)功能損傷）；2 分：行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈（為中度神經(jīng)功能損傷）；3 分：站立或行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒（為重度神經(jīng)功能損傷）；4 分：不能自發(fā)行走，意識(shí)昏迷。評(píng)分值為1～3 分的MCAO 大鼠視為造模成功，納入為研究對(duì)象。

1.5.2 TTC染色法測(cè)定大鼠腦梗死體積

干預(yù)7天后予易氟烷氣體麻醉，斷頭取腦，放至培養(yǎng)皿中，迅速冷藏于-20℃冰箱，20min 后取出，將腦組織置于腦槽，沿冠狀面間隔2mm 進(jìn)行切片，切好的腦組織薄片浸泡在2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液中，錫箔紙包好后避光置放于37℃恒溫箱中30min，期間不斷上下翻動(dòng)腦組織薄片以使腦組織均勻浸泡染色液；30min 后進(jìn)行拍照，采用Image J 軟件對(duì)腦組織梗死體積進(jìn)行測(cè)量。計(jì)算公式為：腦梗死體積百分比=梗死區(qū)體積/大腦體積×100%。

1.5.3 HE染色檢測(cè)神經(jīng)損傷程度

異氟烷吸入麻醉后，斷頭取腦，取缺血側(cè)大腦運(yùn)動(dòng)皮層，組織取材后在PBS 中漂洗，4%PFA 中固定過(guò)夜。依次使用50%、70%、90%、100%乙醇脫水，進(jìn)行石蠟包埋、切片，然后將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，再次梯度乙醇（體積分?jǐn)?shù)分別為100%、90%、70%、50%、70%）脫水，蘇木精-伊紅染色，100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固。使用MshOt（ML31，China）拍照存圖，于顯微鏡下取10 倍光鏡觀察腦組織冠狀面切片，以每個(gè)樣本左下象限視野為觀察區(qū)域，觀察治療前后腦組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5.4 Western blot 檢測(cè)缺血皮質(zhì)區(qū)Nestin、GFAP 蛋白表達(dá)

取凍存于-80℃冰箱的腦組織，稱(chēng)質(zhì)量，加入適量RIPA 裂解液，冰上裂解15min 后，勻漿以13000×g離心20min。提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白含量，加入適量Loadingbuffer，用沸水將蛋白煮沸5min 進(jìn)行蛋白變性，按每孔50μg 蛋白上樣。電泳時(shí)采用80V電壓將蛋白電泳至濃縮膠與分離膠分界線處，然后換為120V 繼續(xù)電泳70min，當(dāng)溴酚藍(lán)的條帶跑至距膠底1cm 左右時(shí)停止電泳，開(kāi)始電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)采用300mA 轉(zhuǎn)膜70min。轉(zhuǎn)膜完畢后，將蛋白所在區(qū)域切下，用含1%脫脂奶粉的TBST 封閉1h，后用Nestin、GFAP 一抗（均為1:1000）4℃孵育過(guò)夜，次日PBS 洗膜后采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37°C孵育45min，ECL 顯色，GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照。Alpha Innotech?Fluor Chem FC2凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J 軟件定量分析Nestin、GFAP 的吸光度值，取Nestin、GFAP與GAPDH吸光度比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.5 血清外泌體的提取及Western blot 檢測(cè)CD63蛋白表達(dá)取血后RT 放置2h，4°C，1500rpm離心3min，取上清到新的EP 管，以2000g 離心力、4℃條件離心10min，移液槍將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，以10000g離心力、4℃條件離心30min。取上清用0.22μm 針頭濾器進(jìn)行過(guò)濾，然后用0.22μm針頭濾器的PBS進(jìn)行配平，要求精確到小數(shù)點(diǎn)后3 位。使用超速離心機(jī)進(jìn)行110000g、4℃、70min 的離心，用移液槍吸走上清，沉淀為初步分離的外泌體。用0.22μm 針孔濾器過(guò)濾的PBS 再次重懸外泌體并配平，再次進(jìn)行120000g、4℃、70min 的離心。用移液槍吸走上清，倒置離心管在吸水紙上，使液體流干，加入50μL 的PBS 溶解外泌體，放置于-80℃長(zhǎng)期保存。Western blot檢測(cè)步驟同1.5.4。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間對(duì)照均值比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)，均由SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

干預(yù)后，假手術(shù)組未表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高（P＜0.01），補(bǔ)氣活血合劑組神經(jīng)功能缺損評(píng)分較模型組顯著降低（P＜0.05）；應(yīng)用GW4869后，神經(jīng)功能缺損評(píng)分較補(bǔ)氣活血合劑組顯著升高（P＜0.01），模型組和合劑+GW4869組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠干預(yù)前后神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.2 腦梗死體積

假手術(shù)組大鼠腦組織成正常紅色，未見(jiàn)肉眼蒼白梗死灶，模型組、補(bǔ)氣活血合劑組、合劑+GW4869組均可見(jiàn)右側(cè)大腦蒼白梗死灶；與假手術(shù)組相比，模型組、補(bǔ)氣活血合劑組、合劑+GW4869 組大鼠的腦梗死體積比均顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，補(bǔ)氣活血合劑組的大鼠腦梗死體積比顯著降低（P＜0.05）；與補(bǔ)氣活血合劑組相比，合劑+GW4869 組大鼠的腦梗死體積比均顯著增加（P＜0.01），模型組和合劑+GW4869組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組大鼠梗死區(qū)TTC染色情況

圖3 各組大鼠腦梗死體積百分比的比較

2.3 神經(jīng)損傷程度

假手術(shù)組染色均勻，組織完整，神經(jīng)細(xì)胞形狀為圓錐狀，排列整齊，核大居中，有明顯的核仁。模型組腦皮層神經(jīng)細(xì)胞排列不規(guī)則，神經(jīng)元明顯腫脹，核仁不明顯，出現(xiàn)核固縮、細(xì)胞間隙存在不同大小的空泡樣改變，出現(xiàn)間質(zhì)水腫。與模型組比較，補(bǔ)氣活血合劑組、合劑+GW4869 組神經(jīng)元壞死減少、組織水腫的形態(tài)表現(xiàn)較輕。與合劑+GW4869組比較，補(bǔ)氣活血合劑組壞死神經(jīng)元和腦組織水腫等病理?yè)p傷較輕，見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠大腦皮層的HE染色結(jié)果（10x/20x）

2.4 蛋白表達(dá)

Western-blot 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組GFAP、CD63 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，補(bǔ)氣活血合劑組GFAP、CD63 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；加用GW4869 后，補(bǔ)氣活血合劑組GFAP、CD63 表達(dá)顯著下降（P＜0.05），Nestin 表達(dá)僅有與GFAP、CD63 相似的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 各組大鼠梗死皮層中Nestin、GFAP及血清外泌體中CD63的表達(dá)

圖6 各組大鼠梗死皮層中Nestin、GFAP及血清外泌體中CD63的表達(dá)的比較

3 討論

腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，缺血性腦卒中是主要類(lèi)型，約占全球范圍腦卒中患者總數(shù)的60%～70%[11-12]。溶栓是治療急性卒中的有效方法，但遺憾的是其治療時(shí)間窗僅為4.5h，超過(guò)該時(shí)間再使用溶栓藥可能會(huì)得不償失[13]，而出血轉(zhuǎn)化和氧化應(yīng)激是主要的臨床風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)[14]。而卒中后缺血半暗帶的拯救是防止梗死區(qū)繼續(xù)擴(kuò)大、促進(jìn)卒中恢復(fù)的有效目標(biāo)[15]。因此，卒中后的神經(jīng)保護(hù)對(duì)腦卒中患者的功能恢復(fù)非常重要。目前所有可用的神經(jīng)保護(hù)藥物在腦卒中治療的臨床研究中均以失敗告終[16-17]，故進(jìn)一步探索治療腦卒中的有效候選藥物也迫在眉睫。

越來(lái)越多的研究表明，中藥及其有效成分在治療心肌缺血、心力衰竭、缺血性中風(fēng)、動(dòng)脈硬化等各種心腦血管疾病（CCVDs）方面具有獨(dú)特的療效[18-19]。補(bǔ)氣活血合劑是我院院內(nèi)制劑，由我院劉悅教授從1992 年應(yīng)用至今，以益氣活血、化痰開(kāi)竅為治法，由黃芪、赤芍、當(dāng)歸、何首烏、桃仁、瓜蔞子、半夏、陳皮、萊菔子、石菖蒲等藥物組成，前期臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)[4-5,20]已對(duì)其療效及有效成分等進(jìn)行了初步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)補(bǔ)氣活血合劑的臨床起效機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探索，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)氣活血合劑可縮小腦梗死體積，提高腦梗死組織中GFAP、Nestin蛋白的表達(dá)，改善大鼠缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損程度，該作用可能與促進(jìn)外泌體分泌有關(guān)。巢蛋白（Nestin）是一種中間絲類(lèi)型的蛋白，是能夠特異性地表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞上的一種分子標(biāo)記物，為神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物；GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成并維持其張力強(qiáng)度；GFAP、Nestin蛋白表達(dá)的升高表明補(bǔ)氣活血合劑可顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的再生活化。外泌體直徑約為30～150nm，是一種異質(zhì)性細(xì)胞外囊泡，具有功能分子裝飾的磷脂雙分子層，富含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核酸[21-22]。CD63 是外泌體的標(biāo)志蛋白之一，其表達(dá)量可一定程度上代表外泌體的含量。作為全細(xì)胞植入的替代治療策略，外泌體通過(guò)體液和循環(huán)將各種蛋白質(zhì)和核酸傳遞給鄰近和遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞，在細(xì)胞間通信中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[23]。最近，基于外泌體的治療在腦卒中的血管生成、抗炎、神經(jīng)發(fā)生和抗凋亡方面顯示出巨大的作用[24-25]。小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞均能分泌外泌體，并調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞衍生的外泌體在促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)炎癥和中風(fēng)后大腦重塑方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25]。因此推測(cè)，補(bǔ)氣活血合劑可能是通過(guò)促進(jìn)外泌體的分泌進(jìn)一步調(diào)控了血管生成、炎癥反應(yīng)等而起到了對(duì)腦功能調(diào)控的作用。

然而，本實(shí)驗(yàn)仍然存在一定缺陷：首先，補(bǔ)氣活血合劑是多種藥物的復(fù)方制劑，其調(diào)控外泌體分泌的作用到底有哪些藥物密切相關(guān)仍需要進(jìn)一步研究；其次，補(bǔ)氣活血合劑誘導(dǎo)的外泌體由何種細(xì)胞產(chǎn)生，以及外泌體中的何種成分起到關(guān)鍵作用，仍不清楚。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)氣活血合劑可縮小腦梗死體積，提高腦梗死組織中GFAP蛋白的表達(dá)，改善大鼠缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損程度，該作用可能與促進(jìn)外泌體分泌有關(guān)，但該制劑中的具體起效成分及其介導(dǎo)外泌體分泌的具體起效機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。