張瑞馳，靳松林，李倫宇，阿衣留布，丁海麗

（成都體育學(xué)院，四川 成都 610041）

超負(fù)荷原則是現(xiàn)代運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練體系的主要原則，人體不斷適應(yīng)增加的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，從而使身體機(jī)能和運(yùn)動(dòng)能力得到提升[1]。在此過(guò)程中，若運(yùn)動(dòng)負(fù)荷長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度超出機(jī)體承受能力，可能會(huì)導(dǎo)致骨骼肌損傷發(fā)生，損傷又需要足夠的時(shí)間修復(fù)[2]，但實(shí)際情況下訓(xùn)練與損傷修復(fù)的時(shí)間平衡點(diǎn)往往難以把控。若損傷未愈仍持續(xù)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，可導(dǎo)致機(jī)體組織損傷進(jìn)一步累積并遷延[3]，影響運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。競(jìng)技體育中，推拿常被應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練及賽后的肌肉疲勞恢復(fù)和損傷治療，效果顯著。目前，現(xiàn)有研究在免疫調(diào)節(jié)[4]、蛋白合成/分解代謝[5-6]和細(xì)胞外基質(zhì)[7]等方面進(jìn)行了探究，證實(shí)推拿以力學(xué)形式作用于損傷或疼痛部位軟組織，從而達(dá)到緩解癥狀和促進(jìn)組織修復(fù)的效果[8]。但其具體作用分子機(jī)制仍不清晰，有待進(jìn)一步探討。

肌衛(wèi)星細(xì)胞（Muscle Satellite Cells, MSC）具有干細(xì)胞特性，即肌肉干細(xì)胞，是成體骨骼肌再生修復(fù)的主要細(xì)胞類(lèi)型，通常處于靜息狀態(tài)[9]。當(dāng)骨骼肌遭受損傷性刺激時(shí)，MSC 被激活并大量增殖，以滿足機(jī)體干細(xì)胞需求，這一過(guò)程中，部分激活和增殖的MSC 會(huì)重新退回靜息狀態(tài)以維持骨骼肌再生潛能，影響損傷修復(fù)[10]。V 型膠原蛋白（Collagen V,COLV）由MSC 分泌并通過(guò)作用于MSC 表面降鈣素受體介導(dǎo)MSC 靜息狀態(tài)的維持，是MSC 靜息生態(tài)位關(guān)鍵組成成分[11-12]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[13]，推拿可上調(diào)一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)骨骼肌損傷的Collagen V表達(dá)，促進(jìn)損傷修復(fù)。然而，推拿對(duì)長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)骨骼肌損傷的干預(yù)效果及機(jī)制仍不明晰。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后推拿對(duì)Collagen V表達(dá)及損傷修復(fù)的影響，探討推拿能否介導(dǎo)Collagen V表達(dá)促進(jìn)MSC 自我更新。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組8 周齡健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠共32 只，初始體重185±6g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK（川）2020-030。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在成都體育學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持自由飲食、飲水，室溫20℃～24℃，相對(duì)濕度30%～60%，12h 光照/黑暗模擬晝夜交替環(huán)境。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天后，所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組（C 組，n=8）、長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（E 組，n=8）、長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+推拿組（ET 組，n=8）、長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+假推拿組（ES組，n=8）。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物所有處理均遵循動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到成都體育學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與器材免疫染色封閉液、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒、ECL試劑盒：碧云天。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit）、熒光定量試劑盒（TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus））：寶日醫(yī)。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒：博士德。Collagen V 抗體：Thermo Fisher Scientific。Pax7 抗體：圣克魯斯。MyoD1 抗體、Myf5 抗體：Affinity Biosciences。HRP 標(biāo)記抗兔二抗：成都正能。TSAPLus 熒光雙重染色試劑盒、Fitc 標(biāo)記抗兔二抗、Cy3 標(biāo)記抗小鼠二抗：賽維爾。Finger-8-TR 型推拿量化儀：蘇州長(zhǎng)顯光電科技。YLS-13A 大小鼠抓力測(cè)定儀：徐州利華電子科技。

1.3 造模方案所有大鼠進(jìn)入動(dòng)物房后適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，其中E、ES、ET 組大鼠進(jìn)行1 周適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)并參考張學(xué)林[14]所用方法建立4 周大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)損傷模型，C組不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)作為對(duì)照，運(yùn)動(dòng)方案見(jiàn)表1。

表1 大鼠大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)方案

1.4 干預(yù)措施根據(jù)《靈樞·經(jīng)筋》中“以痛為腧”，推拿操作主要利用阿是穴原理，對(duì)損傷部位進(jìn)行揉按，將機(jī)械力刺激傳遞至損傷部位。自正式運(yùn)動(dòng)起，每日運(yùn)動(dòng)結(jié)束后6h，除E組不予處理外，高年資中醫(yī)推拿科主治醫(yī)師參照鄭氏手法操作要求[15]對(duì)ET 組大鼠小腿三頭肌施以揉法為主的推拿手法，每側(cè)5min，每天1次，每周6天，休息1天，操作過(guò)程中借助Finger-8-TR 型FSR 薄膜式壓力傳感器對(duì)推拿參數(shù)進(jìn)行量化和監(jiān)測(cè)，根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]，并參照文獻(xiàn)[16]，控制推拿力度為4N 左右，頻率為120 次/min。僅對(duì)ES 組大鼠于小腿三頭肌處皮膚施以輕撫，頻率和時(shí)間同ET組。

1.5 樣本采集與處理于末次干預(yù)后24h 采用1%戊巴比妥鈉30mg/kg 腹腔麻醉，剝離兩側(cè)腓腸肌組織，左側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭采用3%戊二醛固定用于透射電子顯微鏡檢測(cè)；右側(cè)腓腸肌組織分為兩份，一份采用環(huán)保型GD 肌肉固定液固定用于后續(xù)免疫組化和免疫熒光染色，另一份以-80℃保存用于后續(xù)Western Bolt和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 后肢抓力測(cè)試參照Wang H等[17]的方法，使用YLS-13A 大小鼠抓力測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)：右手抓住大鼠背部將其放于網(wǎng)格抓桿，使其下肢抓住抓桿，左手托起大鼠上半身緩緩將其放平，然后右手握該大鼠尾部，將抓力儀推至前端，踩踏板清零，待大鼠抓牢后，緩緩拉動(dòng)大鼠尾部，直至其脫落或計(jì)數(shù)截止。抓力測(cè)定儀能夠準(zhǔn)確記錄大鼠后肢抓力的最大值，每只大鼠重復(fù)測(cè)試3次，取平均值。

1.6.2 透射電鏡 腓腸肌組織于3%戊二醛預(yù)固定后，1%四氧化鋨再固定。丙酮逐級(jí)脫水后，將樣品先經(jīng)脫水劑處理，又用環(huán)氧樹(shù)脂包埋，再經(jīng)加溫聚合后切片。采用超薄切片機(jī)制備約50nm切片后，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網(wǎng)。室溫下用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色液染色，運(yùn)用JEM-1400PLUS 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)并采集圖像。

1.6.3 免疫組織化學(xué)染色將固定后的組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，7μm 切片，脫蠟后的切片經(jīng)3%甲醇雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加免疫染色封閉液進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫封閉20min，加入一抗Collagen V（1：100），4℃孵育過(guò)夜。于次日PBS 水洗后，加入山羊抗兔二抗（1：1000），37℃孵育30min，再次PBS水洗。使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。使用BA200Digital 數(shù)碼顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集。采用Imagepro Plus 6.0 分析同一參數(shù)下總和光密度值，根據(jù)圖片總面積計(jì)算平均光密度值。

1.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 各大鼠取100mg骨骼肌組織，采用Trizol法提取mRNA，并將獲得的mRNA 經(jīng)超微量分光光度計(jì)（Thermo）檢驗(yàn)純度和濃度。使用PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒進(jìn)行基因組DNA 除去反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得樣品cDNA。按照TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）建立20μL 預(yù)混液反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃充分延伸30s，45 循環(huán)，并用PIKORed 96實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x進(jìn)行擴(kuò)增和采集熒光。使用PikoReal 軟件分析各檢測(cè)樣本的CT（Threshold cycle）值，通過(guò)2-△△CT計(jì)算Col5a1 和Col5a3 相對(duì)mRNA 表達(dá)水平。引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，序列如下：Col5a1:5'-GGACTCCGACTCCAATGTCTCTCC-3'；Col5a1:5'-GGCTCAATGATGGCTGGTTCTCC-3'；Col5a3:5'-TGAGAAGCTGCCGGAGACTGG-3'；Col5a3:5'-CCCTATGCACACCCAAGGTTTCC-3'；β-actin:5'-GAAGATCAAGATCATTGCTCC-3'；β-actin:5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'。

1.6.5 Western Blot 各大鼠取20mg 腓腸肌組織與裂解液混合并勻漿，4℃、12000r/min離心5min，取上清液采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加熱變性制作蛋白樣品。獲得樣品后加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（濃縮：80V 30min；分離：120V 90min），再以200mA 轉(zhuǎn)膜90min。用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉2h，分別加入Pax7（1：600）、MyoD1（1：1000）、Myf5（1：500）、β-actin（1：50000）一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST 充分洗滌，加入山羊抗兔二抗（1：10000），37℃孵育2h，TBST 再次充分洗滌，使用增強(qiáng)ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影、定影，采用Image-J 軟件分析目標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值并計(jì)算比值。

1.6.6 免疫熒光共定位將固定后的組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，7μm 切片。經(jīng)梯度乙醇脫蠟后，使用EDTA（pH 8.0）對(duì)玻片進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加免疫染色封閉液室溫封閉10min 后，分別添加一定比例Collagen V（1：500）、Pax7（1：300）一抗混合液，室溫孵育1～2h 后轉(zhuǎn)移至4℃過(guò)夜。次日PBS 水洗后，滴加Fitc 標(biāo)記山羊抗兔和Cy3 標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2h。再次PBS 水洗，滴加DAPI，室溫孵育10min，用抗熒光淬滅封片劑封片。采用Pannoramic 250 全自動(dòng)數(shù)字掃描顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，隨機(jī)選取視野采集。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。方差齊性檢驗(yàn)采用Brown-Forsythe test和Bartlett's test，方差齊時(shí)，采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，采用Tamhan's T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠后肢抓力測(cè)試各組間初始后肢抓力無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。E 組、ES 組與ET 組4 周后抓力較C 組均顯著增加（P＜0.01）。經(jīng)校準(zhǔn)，E 組與ES 組在完成運(yùn)動(dòng)方案后抓力增加值較C組具有顯著性差異（P＜0.05），ET 組也具有顯著性差異（P＜0.01）；同時(shí)，ET 組較E 組和ES 組抓力增加值也具有顯著性差異（P＜0.05）；E組與ES組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠后肢抓力變化（g）

2.2 透射電鏡觀察腓腸肌超微結(jié)構(gòu)C 組大鼠腓腸肌肌原纖維排列整齊，肌節(jié)明暗帶清晰可見(jiàn)，線粒體完整且有規(guī)律地排列在Z 線兩側(cè)。E 組與ES 組大鼠腓腸肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肌原纖維發(fā)生斷裂和降解、Z 線斷裂、肌漿網(wǎng)腫脹、線粒體結(jié)構(gòu)不清且腫脹。ET 組大鼠腓腸肌超微結(jié)構(gòu)較E 組和ES 有明顯改善，肌原纖維排列整齊、肌漿網(wǎng)完整，但仍有部分線粒體結(jié)構(gòu)不清，見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腓腸肌超微結(jié)構(gòu)（×20000）

2.3 免疫組織化學(xué)染色各組大鼠腓腸肌組織均出現(xiàn)深棕色顆粒陽(yáng)性表達(dá)，其中C組和ET組深棕色顆粒顯著多于E 組和ES 組。E 組與ES 組Collagen V表達(dá)水平較C 組均呈下降趨勢(shì)，其中E 組降低具有顯著性（P＜0.05）；ET 組Collagen V表達(dá)較其余三組均顯著升高（P＜0.01）；E 組與ES 組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠Collagen V表達(dá)（×400）

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR E 組、ES 組與ET 組Col5a1mRNA 表達(dá)水平較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組表達(dá)較E 組和ES 組呈上升趨勢(shì)，其中較E 組升高具有顯著性（P＜0.05）。E 組與ES 組Col5a3 mRNA 表達(dá)水平較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組表達(dá)較C組顯著升高（P＜0.05），同時(shí)較E 組與ES 組也顯著升高（P＜0.01）；E 組與ES 組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4。2.5 Western Blot E 組Pax7 蛋白表達(dá)水平較C 組降低（P＜0.01），同時(shí)ES 組Pax7 蛋白表達(dá)較C 組也降低（P＜0.05），兩組MyoD 和Myf5 蛋白表達(dá)較C 組均降低（P＜0.01）；而ET 組較C 組除Pax7 蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）外，其Pax7蛋白表達(dá)較E組和ES組顯著升高（P＜0.01），且MyoD 和Myf5 蛋白表達(dá)較另三組均顯著升高（P＜0.01）；ES 組較E 組除MyoD蛋白表達(dá)升高顯著（P＜0.05）外，其余蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

圖4 各組大鼠Col5a1和Col5a3 mRNA表達(dá)

圖5 各組大鼠Pax7、MyoD和Myf5蛋白表達(dá)

2.6 免疫熒光共定位紅色熒光標(biāo)記Pax7，綠色熒光標(biāo)記Collagen V，Pax7 與Collagen V共定位呈現(xiàn)黃色熒光。E組和ES組黃色熒光信號(hào)較C組減少；ET組黃色熒光信號(hào)較C 組無(wú)明顯差異，而較E 組和ES組增加；E 組和ES 組黃色熒光信號(hào)無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖6。E 組與ES 組Pax7 與Collagen V的Overlap 系數(shù)較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組較C 組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而較E 組和ES 組均顯著升高（P＜0.01）；E組與ES組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)圖7。

圖6 各組大鼠Collagen V與Pax7免疫熒光共定位結(jié)果（×400）

圖7 各組大鼠Collagen V與Pax7共定位表達(dá)

3 討論

推拿作為中國(guó)傳統(tǒng)療法之一，常應(yīng)用于治療長(zhǎng)期過(guò)度使用骨骼肌引起的慢性肌肉勞損，緩解肌肉酸痛和疲勞無(wú)力等癥狀[18]。競(jìng)技運(yùn)動(dòng)中，運(yùn)動(dòng)員平日反復(fù)進(jìn)行的高強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致骨骼肌重復(fù)性微損傷積累，造成骨骼肌過(guò)度使用，久之則易形成慢性勞損[19-20]。有研究證實(shí)，離心大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)易造成骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致骨骼肌微損傷[21-22]。而長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，為適應(yīng)骨骼肌的過(guò)度使用，其超微結(jié)構(gòu)損傷及重復(fù)性微損傷會(huì)累積，出現(xiàn)組織炎癥浸潤(rùn)及纖維化等現(xiàn)象[23]。推拿已被證實(shí)具有加速運(yùn)動(dòng)所致骨骼肌損傷修復(fù)的作用[24]，與團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)推拿可加速一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷修復(fù)結(jié)果一致[13]。且有研究表明，通過(guò)推拿給予機(jī)體一定機(jī)械力刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白重塑[25]，這也對(duì)骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷修復(fù)具有重要意義。本研究運(yùn)用大鼠四周遞增連續(xù)離心下坡跑模擬運(yùn)動(dòng)員長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，通過(guò)透射電鏡觀察到大鼠腓腸肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了肌原纖維斷裂及降解、Z線斷裂等改變，而經(jīng)推拿干預(yù)的大鼠腓腸肌超微結(jié)構(gòu)有明顯改善，提示推拿可促進(jìn)長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所致骨骼肌損傷修復(fù)。此外，另有研究表明推拿在促進(jìn)損傷修復(fù)的同時(shí)還能有效改善肌肉力量[26]。本研究結(jié)果顯示，推拿組大鼠后肢抓力的提升遠(yuǎn)超單純運(yùn)動(dòng)大鼠，這進(jìn)一步說(shuō)明推拿促進(jìn)損傷修復(fù)的同時(shí)，能更有效地鞏固并增強(qiáng)長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的肌肉力量。

MSC 自我更新是骨骼肌損傷修復(fù)的內(nèi)源性動(dòng)力，該過(guò)程受MSC 生態(tài)位嚴(yán)格調(diào)控。Pax7 是MSC及其自我更新的關(guān)鍵標(biāo)志物，參與維持MSC 生態(tài)位、調(diào)控其自我更新且持續(xù)表達(dá)抑制成肌細(xì)胞肌源性分化程序[27]。與此同時(shí)，骨骼肌再生修復(fù)依賴肌源性調(diào)節(jié)因子來(lái)調(diào)節(jié)分化程序[28]。MSC 通常處于靜息狀態(tài)，穩(wěn)定表達(dá)Pax7，當(dāng)受到損傷刺激活化后，則開(kāi)始表達(dá)MyoD 和Myf5，參與肌肉中成纖維細(xì)胞等非肌肉細(xì)胞向肌肉的轉(zhuǎn)化過(guò)程。本研究檢測(cè)了大鼠腓腸肌中Pax7、MyoD 和Myf5 蛋白表達(dá)情況，以探究推拿對(duì)MSC自我更新的影響。有證據(jù)證明，運(yùn)動(dòng)引起的重復(fù)性損傷會(huì)降低MyoD 和Myf5 表達(dá)[29]，本研究發(fā)現(xiàn)單純運(yùn)動(dòng)組中Pax7、MyoD 和Myf5蛋白表達(dá)均降低，這說(shuō)明長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致重復(fù)性損傷。而推拿組相較于空白對(duì)照組MyoD 和Myf5 蛋白表達(dá)顯著升高，提示骨骼肌損傷后推拿有助于MSC自我更新。另一方面，推拿組三種蛋白表達(dá)較單純運(yùn)動(dòng)組和假推組均顯著升高，結(jié)合透射電鏡結(jié)果，提示推拿可能因促進(jìn)MSC自我更新而加速長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所致骨骼肌損傷修復(fù)。

Collagen V是MSC 生態(tài)位關(guān)鍵組成成分，對(duì)維持MSC靜息態(tài)起重要作用。Baghdadi MB等[11]發(fā)現(xiàn)Collagen V缺失時(shí)，會(huì)導(dǎo)致MSC進(jìn)入異常細(xì)胞周期，消耗干細(xì)胞池，影響MSC 生態(tài)位穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致自我更新受損。為驗(yàn)證推拿能否通過(guò)干預(yù)Collagen V表達(dá)，影響MSC 自我更新，本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Collagen V表達(dá)，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后Collagen V表達(dá)顯著降低，而介入推拿會(huì)上調(diào)Collagen V表達(dá)，與團(tuán)隊(duì)前期研究推拿對(duì)一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所致骨骼肌損傷Collagen V表達(dá)變化趨勢(shì)一致[13]。與此同時(shí)，本研究還檢測(cè)了Collagen V主要基因Col5a1和Col5a3 mRNA表達(dá)，推拿干預(yù)下兩基因mRNA 表達(dá)升高，與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果類(lèi)似，這提示長(zhǎng)期推拿有助于上調(diào)Collagen V表達(dá)。為進(jìn)一步探究Collagen V在推拿干預(yù)下對(duì)MSC 自我更新的作用，本研究就Collagen V與Pax7 進(jìn)行免疫熒光共定位，結(jié)果顯示長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后Collagen V與Pax7 共定位程度降低，而長(zhǎng)期推拿使共定位程度有所提高，這說(shuō)明Collagen V參與推拿促進(jìn)MSC 自我更新過(guò)程。由此推測(cè)，推拿的確可能通過(guò)上調(diào)Collagen V表達(dá)，促進(jìn)長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌損傷中所進(jìn)行的MSC自我更新。

綜上所述，本研究探究了推拿可能通過(guò)上調(diào)Collagen V表達(dá)的方式，促進(jìn)MSC自我更新，從而加速長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌損傷的修復(fù)，并增強(qiáng)肌肉力量。但由于MSC生態(tài)位成分復(fù)雜，是否還有其他細(xì)胞和因子參與推拿修復(fù)骨骼肌損傷過(guò)程，或參與調(diào)控Collagen V來(lái)間接影響其損傷修復(fù)，仍有待進(jìn)一步研究。