邵曉慶， 盧一銘， 徐衛(wèi)紅

西南大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715

鈣是人體不可缺少的營養(yǎng)元素,缺鈣會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、營養(yǎng)不良,嚴(yán)重影響人體正常發(fā)育和骨骼發(fā)展．正常情況下人體每日所需鈣量為800 mg,但兒童、老人群體每日需要的鈣量為1 200 mg．隨著人們生活水平的提高,對(duì)高品質(zhì)、功能型蔬菜的需求也不斷提升．鈣作為蔬菜正常生長發(fā)育過程中不可或缺的營養(yǎng)元素,參與蔬菜種子萌發(fā)、生長分化、形態(tài)建成和開花結(jié)果等過程[1]．同時(shí),鈣離子在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中作為第二信使參與蔬菜細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞,從而調(diào)控蔬菜的各種生理生化反應(yīng)和生長發(fā)育過程[2]．0.5～4.0 mmol/L鈣水平可顯著提高白菜葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度以及蒸騰速率,且對(duì)鈣敏感型品種菊春的影響顯著大于遲鈍型品種德高春[3]．噴施0.2% 的外源氯化鈣后,番茄的單果質(zhì)量、單株結(jié)果數(shù)和單株產(chǎn)量均顯著增加[4]．鈣肥的施用還可以改良土壤性能,調(diào)節(jié)土壤酸堿性,消除某些離子的毒害作用[5]．在營養(yǎng)液中添加10 mmol/L CaCl2,可緩解銅離子脅迫,明顯促進(jìn)花椰菜地上部和根系的生長,使地上部和根系的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量增加[6]．但也有研究顯示,高鈣水平會(huì)抑制蔬菜對(duì)鉀、鎂的吸收,也會(huì)降低鐵、錳、硼、鋅等元素的有效性,使蔬菜體內(nèi)養(yǎng)分失衡,甚至?xí)绊懯卟说墓夂献饔?從而導(dǎo)致其正常的生長發(fā)育受阻[7-8]．另外,細(xì)胞中過多的游離鈣離子會(huì)和磷酸根離子形成沉淀,使鈣離子信號(hào)傳遞受阻,磷代謝等有關(guān)過程也會(huì)受到干擾,從而使細(xì)胞的正常功能受損,甚至死亡,影響蔬菜的生長發(fā)育．我國土壤溶液中的鈣濃度約為10-2mol/L,土壤表土層平均含鈣量可達(dá)1.37%,正常情況下能夠滿足大多數(shù)作物的需要[9]．但近期有研究表明,南方因降雨充沛,土壤含鈣量較低,而北方土壤富鈣,在干旱條件下,土壤溶液鈣濃度會(huì)升高,從而抑制根系對(duì)鈣的吸收,導(dǎo)致部分作物出現(xiàn)生理性缺鈣,鈣需求量較大的果樹、蔬菜缺鈣現(xiàn)象更為普遍[10]．同時(shí),近年來由于追求高產(chǎn)、土壤酸化和化肥施用等因素的作用,土壤鈣供應(yīng)不足[9],加之設(shè)施栽培的大量涌現(xiàn),更容易導(dǎo)致棚室土壤缺鈣[11]．

蔬菜吸收鈣的主要部位是根尖和側(cè)根處[12]．蔬菜根系對(duì)鈣離子(Ca2+)的吸收過程一般包括: ① 土壤中的Ca2+通過質(zhì)流擴(kuò)散和根系截獲的方式轉(zhuǎn)移到蔬菜根系的表面,根系通過擴(kuò)散或細(xì)胞間隙的交換使Ca2+進(jìn)入根系細(xì)胞,之后Ca2+通過質(zhì)外體途徑進(jìn)行短距離橫向運(yùn)輸,到達(dá)木質(zhì)部[13]; ② 部分Ca2+還可以通過離子通道進(jìn)入內(nèi)皮層細(xì)胞,轉(zhuǎn)入共質(zhì)體,從而進(jìn)入木質(zhì)部薄壁細(xì)胞組織[14-15]．蔬菜中的Ca2+主要在木質(zhì)部進(jìn)行長距離運(yùn)輸,在韌皮部的運(yùn)輸十分有限,蒸騰作用是其運(yùn)輸?shù)闹饕獎(jiǎng)恿16]．另外,Ca2+的運(yùn)輸分配還受鈣傳遞分子途徑、木質(zhì)部水分流量和鈣信號(hào)與細(xì)胞壁的相互作用等影響[17]．Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在蔬菜從外界環(huán)境中吸收鈣以及運(yùn)輸和分配鈣的過程中發(fā)揮著重要作用[18],該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要包括2類: 胞質(zhì)Ca2+外流系統(tǒng)(Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Ca2+-ATPase)和Ca2+進(jìn)入胞質(zhì)的內(nèi)流系統(tǒng)(Ca2+通道)[19]．其中,Ca2+-ATPase又稱鈣泵(calcium pump),Ca2+-ATPase屬于P-型ATP酶,根據(jù)其蛋白質(zhì)氨基酸序列和生化特征的差異可以分為2個(gè)家族: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)型鈣泵(ER-type calcium ATPase,ECA)和自抑制的質(zhì)膜(PM)型鈣泵(autoinhibited calcium ATPase,ACA)[20]．其中,ECA分布在質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡膜上,只能水解底物ATP,對(duì)其有專一性,被CPA(cyclopiazonic acid)專性抑制,不受鈣調(diào)素(calmodulin,CaM)蛋白激活調(diào)控[21-22]．蔬菜細(xì)胞內(nèi)感受胞質(zhì)鈣離子濃度變化的原件被稱為Ca2+感受器(calcium sensor,CAS)．

CAS是一種跨膜蛋白,可以傳遞鈣信號(hào),進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá),達(dá)到維持蔬菜胞質(zhì)鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)的目的[23]．CAS感受到胞外鈣離子后,產(chǎn)生肌醇三磷酸(inositol triphosphate,IP3)和環(huán)腺苷酸二磷酸核糖(cyclic adenylate diphosphate ribose,cADPR)等第二信使,從而引起胞內(nèi)鈣離子濃度的變化[24]．Han等[25]通過功能基因篩選法(functional screening approach)首次在擬南芥中成功克隆了胞外鈣感受器基因CAS,這為進(jìn)一步研究其在蔬菜鈣富集中的作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)．植物ECA、CAS基因可以感受胞外Ca2+水平,提高胞內(nèi)Ca2+的濃度,因此探究其在不同Ca2+濃度蔬菜中的表達(dá)情況將為提高蔬菜中的鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)提供分子基礎(chǔ)．本試驗(yàn)基于課題組前期研究,以我國白菜栽培較為廣泛的兩個(gè)品種‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’為試驗(yàn)材料,采用盆栽試驗(yàn)研究了鈣誘導(dǎo)下兩個(gè)白菜品種的轉(zhuǎn)錄代謝信息差異,以及鈣富集關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的影響,探討了鈣富集關(guān)鍵酶基因表達(dá)與白菜鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性,以期為高鈣白菜品種選育提供技術(shù)支撐．

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試白菜(BrassiachinensisL.),品種為‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’．栽培基質(zhì)以草炭土、珍珠巖、蛭石按體積比3∶1∶1混合,其基本理化性質(zhì)為: pH值為6.50,有機(jī)質(zhì)為221.8 g/kg,全氮為3.13 g/kg,堿解氮為0.57 g/kg,有效磷為17.97 mg/kg,速效鉀為150.32 mg/kg,有效鈣為0.32 g/kg．

1.2 試驗(yàn)方法

盆栽試驗(yàn)于2021年3月15日至2021年4月30日在西南大學(xué)1號(hào)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行．蔬菜種植在無孔黑色塑料桶中(上口直徑25 cm,底部直徑20 cm,高度29 cm),每盆裝入栽培基質(zhì)9.5 L．鈣肥品種選擇CaSO4·2H2O,用作基肥與氮、磷、鉀肥一起以土施的方式施入,試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)濃度(0,0.2,0.4,0.6和0.8 g/kg)與兩個(gè)白菜品種兩兩組合,隨機(jī)排列,每盆種植4株,每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)．白菜氮肥總施用量為180 mg/kg,磷肥100 mg/kg、鉀肥150 mg/kg,氮肥、磷肥和鉀肥分別以尿素、磷酸二氫銨和硫酸鉀為肥源,其中,磷、鉀作為基肥施入,氮肥用量的70%作為基肥施入,同時(shí)施入鈣肥,與土壤混勻,平衡2周,剩余30%的氮肥作追肥在移栽后的第20天施入．土壤平衡結(jié)束后,選取長勢(shì)一致且健壯的4葉1心的白菜幼苗進(jìn)行移栽,培養(yǎng)期間用純水保持基質(zhì)含水量為飽和含水量的70%～80%．白菜生長45天后收獲．

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 基質(zhì)基本理化性質(zhì)和植物鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

pH采用土水比1∶1的方法測(cè)定; 有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀等基本理化指標(biāo)用常規(guī)方法測(cè)定[26]．植株收獲后先用自來水沖洗干凈,然后用去離子水清洗3次,然后分離根、莖、葉和果實(shí),在105 ℃下殺青15 min,60 ℃下烘干稱重,用破壁機(jī)打磨干樣,全鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用HNO3-HClO4消化,原子吸收分光光度法進(jìn)行測(cè)定[26]．參照劉雙等[27]和王春曉等[28]的計(jì)算方法計(jì)算植株鈣元素積累量,計(jì)算公式如下:

鈣積累量(g/株)=鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/kg)×干質(zhì)量(kg/株)

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.3.2.1 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及Illumina測(cè)序

選取成熟期白菜第5～6位葉片用于總RNA提取、mRNA純化、cDNA文庫構(gòu)建及高通量測(cè)序(深圳華大基因股份有限公司)．基本過程為: 用mRNA富集法對(duì)總RNA進(jìn)行處理,用打斷buffer把獲得的RNA片段化,結(jié)合cDNA二鏈形成雙鏈DNA,雙鏈DNA處理過后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、熱變性成單鏈直至得到單鏈環(huán)狀DNA文庫,將檢測(cè)合格的文庫進(jìn)行Illumina測(cè)序．

1.3.2.2 RNA-seq分析

原始測(cè)序數(shù)據(jù)首先通過SOAPnuke 1.4.0軟件去除接頭及低質(zhì)量的序列,之后利用Hisat 2.1.0 將獲得的clean reads比對(duì)到大白菜參考基因組,使用Bowtie 2將clean reads比對(duì)到基因組序列上,然后使用RSEM計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平．通過DESeq 2軟件進(jìn)行樣品組間差異表達(dá)分析,將滿足閾值|log2FC|≥1且FDR<0.05的基因定義為差異表達(dá)基因(DEG),并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能注釋及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析[29]．

1.3.3 鈣富集關(guān)鍵酶基因表達(dá)研究

1.3.3.1 總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

本試驗(yàn)白菜材料的總RNA采用北京全式金有限公司TransZol Up Plus RNA Kit抽提試劑盒提取,提取出的一部分RNA用于RNA的質(zhì)量檢測(cè),剩余的RNA保存在-80 ℃冰箱中,等待進(jìn)一步的純化和反轉(zhuǎn)錄．

1.3.3.2 RNA的純化與反轉(zhuǎn)錄

使用北京全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransCript One-Step gDNA Removal and Cdna Synthesis SuperMix)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄．首先去除殘存基因組DNA,再按照試劑盒說明進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)．反轉(zhuǎn)錄所合成的cDNA置于-20 ℃條件下保存．

1.3.3.3 引物及目標(biāo)基因的qRT-PCR分析

用ddH2O將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋3倍,熒光定量PCR采用Power Up TM SYBRTM Green Master Mix(AppliedBiosysrems,Vilnius,Lithuania)試劑盒配制反應(yīng)體系．使用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system進(jìn)行定量PCR反應(yīng)．PCR反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán); 60 ℃上升至95 ℃檢測(cè)產(chǎn)物溶解曲線,所有試驗(yàn)重復(fù)3次．用2-ΔΔCT的方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量,CT值表示熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的反應(yīng)循環(huán)數(shù)[30]．其中PCR反應(yīng)體系為2 μL cDNA,7.2 μL ddH2O,0.4 μL Primer-Forward(10 μM),0.4 μL Primer-Reverse(10 μM),10 μL 2×SYBR Green Mix．引物設(shè)計(jì)如表1所示．

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和制圖,采用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行相關(guān)性分析(Pearson相關(guān)系數(shù)法),Fisher least significant difference(LSD)檢測(cè)法進(jìn)行不同處理均值的差異顯著性比較(p<0.05)．

2 結(jié)果分析

2.1 供鈣水平對(duì)白菜生物量的影響

不同施鈣水平(0,0.2,0.4,0.6和0.8 g/kg CaSO4·2H2O)下‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’的地上部生物量和根生物量如圖1所示．‘黑葉五月慢’的地上部隨著鈣肥水平的提高呈先升高再降低的趨勢(shì),根生物量的變化趨勢(shì)與之相似,先升高后降低,與對(duì)照組相比各處理的地上部和根生物量分別增加了23.22%～29.79%和3.35%～28.96%,‘黑葉五月慢’的地上部和根生物量均在0.6 g/kg CaSO4·2H2O處理下達(dá)到最大值．‘上海六月慢’的地上部和根生物量的變化趨勢(shì)相同,均表現(xiàn)為先升高后降低,各處理的地上部和根生物量較對(duì)照分別增加了27.62%～53%和6.91%～17.74%,在0.4 g/kg CaSO4·2H2O處理下該品種的地上部和根生物量達(dá)到最大值,分別為116.11和5.11 g/盆．與對(duì)照相比,‘黑葉五月慢’的地上部和根生物量均在0.4和0.6 g/kg CaSO4·2H2O處理下存在顯著差異; ‘上海六月慢’各施鈣處理下的地上部生物量較對(duì)照均表現(xiàn)出顯著差異,而根生物量僅在0.2,0.4和0.6 g/kg CaSO4·2H2O處理下表現(xiàn)出顯著差異．

不同小寫字母表示不同品種間的差異顯著性(p<0.05)．圖1 不同鈣水平下白菜生物量

2.2 鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)

如圖2所示,‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’的地上部和根系鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨著施鈣水平的增加呈先增加后降低的趨勢(shì),在0.6 g/kg CaSO4·2H2O處理下達(dá)到最大值．‘黑葉五月慢’地上部和根系鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對(duì)照分別增加了14.0%～21.6%和12.7%～24.4%; ‘上海六月慢’ 地上部和根系鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較對(duì)照增加了6.6%～41.3%和29.1%～46.9%．總體來講,‘黑葉五月慢’的地上部和根系鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于‘上海六月慢’．

不同小寫字母表示不同品種間的差異顯著性(p<0.05)．圖2 不同鈣水平下白菜地上部和根系鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3 差異表達(dá)基因分析

本試驗(yàn)以|log2FC|≥0,Q值≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)來篩選差異表達(dá)基因,并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,如圖3所示,‘黑葉五月慢’施鈣處理與對(duì)照組相比共篩選到3 018個(gè)差異表達(dá)基因,其中1 498個(gè)上調(diào)表達(dá),1 520個(gè)下調(diào)表達(dá); ‘上海六月慢’施鈣處理與對(duì)照組相比共篩選到2 224個(gè)差異表達(dá)基因,其中1 229個(gè)上調(diào)表達(dá),995個(gè)下調(diào)表達(dá); ‘黑葉五月慢’對(duì)照組與‘上海六月慢’對(duì)照組相比共篩選到2 187個(gè)差異表達(dá)基因,其中941個(gè)上調(diào)表達(dá),1 246個(gè)下調(diào)表達(dá); ‘黑葉五月慢’施鈣處理與‘上海六月慢’施鈣處理相比共篩選到6 264個(gè)差異表達(dá)基因,其中3 052個(gè)上調(diào)表達(dá),3 212個(gè)下調(diào)表達(dá)．對(duì)這些差異表達(dá)基因作韋恩圖分析,結(jié)果表明: ‘黑葉五月慢’施鈣處理及對(duì)照組與‘上海六月慢’施鈣處理及對(duì)照組之間存在927個(gè)差異表達(dá)基因; ‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’的對(duì)照組與‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’的施鈣處理之間存在1 255個(gè)差異表達(dá)基因．

H0: ‘黑葉五月慢’對(duì)照處理,H0.6: ‘黑葉五月慢’0.6 g·kg-1鈣處理; S0: ‘上海六月慢’對(duì)照處理,S0.6: ‘上海六月慢’0.6 g·kg-1鈣處理,下同．圖3 不同鈣處理下白菜的差異表達(dá)基因

2.4 差異表達(dá)基因GO分析

如圖4所示,‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’的差異表達(dá)基因主要富集在生物學(xué)過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)．‘黑葉五月慢’施鈣處理與對(duì)照組在生物過程類別中包含基因數(shù)較多的條目依次是: 細(xì)胞過程(cellular process)322個(gè)、代謝過程(metabolic process)320個(gè)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)64個(gè)和生物調(diào)控(biological regulation)61個(gè); 在細(xì)胞組分類別中富集較多的條目依次是: 細(xì)胞(cell)321個(gè)、細(xì)胞部分(cell part)321個(gè)、細(xì)胞器(organelle)259個(gè)、膜(membrane)183個(gè)和膜部分(membrane part)171個(gè); 在分子功能類別中富集較多的條目依次是: 催化活性(catalytic activity)377個(gè)、聯(lián)結(jié)(binding)357個(gè)、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)(structural molecule activity)86個(gè)和轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)(transporter activity)57個(gè)．‘上海六月慢’施鈣處理與對(duì)照組在生物過程類別中包含基因數(shù)較多的條目依次是: 細(xì)胞過程312個(gè)、代謝過程299個(gè)、應(yīng)激反應(yīng)42個(gè)和細(xì)胞組分或生物合成(cellular component organization or biogenesis)35個(gè); 在細(xì)胞組分類別中富集較多的條目依次是: 細(xì)胞317個(gè)、細(xì)胞部分317個(gè)、細(xì)胞器282個(gè)、蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein-containing complex)195個(gè)和膜(membrane)125個(gè); 在分子功能類別中富集較多的條目依次是: 聯(lián)結(jié)283個(gè)、催化活性238個(gè)、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)137個(gè)和轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)31個(gè)．

2.5 差異表達(dá)基因KEGG通路分析

由圖5可知,‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’施鈣處理較對(duì)照組在轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝(transport and catabolism)通路中的差異表達(dá)基因數(shù)目分別為67和47個(gè); 在環(huán)境信息處理類別下,兩個(gè)品種施鈣處理較對(duì)照組在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)通路中的差異表達(dá)基因數(shù)目分別為68和50個(gè); 在新陳代謝類別下,兩個(gè)品種施鈣處理較對(duì)照組在氨基酸代謝(amino acid metabolism)通路中的差異表達(dá)基因數(shù)目分別為163和130個(gè),‘黑葉五月慢’施鈣處理和對(duì)照組的差異表達(dá)基因主要富集在碳代謝(carbon metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine,serine and threonine metabolism)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、氮代謝(nitrogen metabolism)、α-亞麻酸代謝(alpha-Linolenic acid metabolism)等代謝通路．‘上海六月慢’施鈣處理和對(duì)照組的差異表達(dá)基因主要富集在氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、賴氨酸生物合成(lysine biosynthesis)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(cysteine and methionine metabolism)、戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成(valine,leucine and isoleucine biosynthesis)、生物素代謝(biotin metabolism)代謝通路．

圖4 白菜差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

圖5 白菜差異表達(dá)基因的KEGG功能富集分析

2.6 供鈣水平對(duì)白菜鈣富集關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

2.6.1BcECA家族基因

由圖6可知,‘黑葉五月慢’BcECA2基因僅在0.4 g/kg鈣水平處理時(shí)上調(diào)表達(dá),表達(dá)量是對(duì)照的1.08倍; ‘上海六月慢’BcECA2基因表達(dá)量隨著施鈣量的增加先上調(diào)后下調(diào),在0.2 g/kg和0.4 g/kg鈣水平處理下分別是對(duì)照的1.91和1.14倍．與對(duì)照相比,施鈣處理后‘黑葉五月慢’BcECA3.1基因均上調(diào)表達(dá),表達(dá)量隨施鈣水平的提高先上調(diào)后下調(diào); ‘上海六月慢’BcECA3.1基因表達(dá)量在0.4 g/kg和0.6 g/kg鈣水平處理下均表現(xiàn)為下調(diào)．兩個(gè)品種的BcECA4.1基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致,均在0.4 g/kg鈣水平處理下達(dá)到最大值．與對(duì)照相比,施鈣處理后‘黑葉五月慢’BcECA4.2基因表達(dá)量均上調(diào),在0.4 g/kg和0.6 g/kg鈣水平處理下較對(duì)照提高了1.93和1.35倍; ‘上海六月慢’BcECA4.2基因表達(dá)量隨著施鈣量的增加先上調(diào)后下調(diào),在0.4 g/kg鈣水平處理下達(dá)到最大．

不同小寫字母表示不同品種間的差異顯著性(p<0.05)．圖6 施鈣水平對(duì)白菜ECA家族基因表達(dá)量的影響

2.6.2BcCAS家族基因

由圖7可知,‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’的BcCAS1基因表達(dá)量均隨著施鈣量的增加先上調(diào)后下調(diào),‘黑葉五月慢’在0.4 g/kg鈣水平處理下BcCAS1基因表達(dá)量達(dá)到最大值,較對(duì)照提高了2.76倍; ‘上海六月慢’在0.2 g/kg鈣水平處理下達(dá)到最大值．‘黑葉五月慢’的BcCAS2基因表達(dá)量隨施鈣水平的提高先上調(diào)后下調(diào),在0.4 g/kg鈣水平處理下達(dá)到最大值; 與對(duì)照相比,施鈣處理后‘上海六月慢’的CAS2基因表達(dá)量整體上調(diào),是對(duì)照的1.64～2.09倍．‘黑葉五月慢’的BcCAS4基因表達(dá)量在0.4 g/kg鈣水平處理下較對(duì)照提高了1.32倍; 與對(duì)照相比,‘上海六月慢’的BcCAS4基因表達(dá)量整體上調(diào),在0.6 g/kg鈣水平處理下達(dá)到最大值．

不同小寫字母表示不同品種間的差異顯著性(p<0.05)．圖7 施鈣水平對(duì)白菜CAS家族基因表達(dá)量的影響

2.7 BcECA和BcCAS家族基因表達(dá)與白菜鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性分析

如表3所示,Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明,白菜鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與BcECA2,BcECA3.1,BcECA4.1和BcECA4.2相對(duì)表達(dá)量均呈正相關(guān)關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)分別為0.737,0.204,0.286和0.524,且與BcECA2的相關(guān)性達(dá)到顯著水平; 鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與BcCAS1,BcCAS2和BcCAS4相對(duì)表達(dá)量也均呈正相關(guān)關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)分別為0.661,0.489和0.184,但其相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平．

表3 BcECA和BcCAS家族基因表達(dá)與鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)間的相關(guān)系數(shù)

3 討論

土壤缺鈣或白菜對(duì)鈣的吸收與利用受阻,會(huì)嚴(yán)重影響白菜正常生長和產(chǎn)量形成[31]．本試驗(yàn)中,施鈣顯著促進(jìn)了白菜生長,提高了地上部和根系的生物量．隨著施鈣水平的提高,‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’地上部和根系的鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)及鈣積累量均呈先上升后下降趨勢(shì),生物量和鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本都在0.4或0.6 g/kg CaSO4·2H2O處理時(shí)達(dá)到最大值．說明適宜濃度或用量的外源鈣能夠提高白菜的產(chǎn)量和鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù),但濃度或用量過大反而對(duì)白菜生長和鈣吸收不利[11]．

轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’中分別有3018和2224個(gè)差異表達(dá)基因,說明鈣對(duì)兩個(gè)白菜品種的基因表達(dá)影響不同．在GO分析中,兩個(gè)白菜品種對(duì)照和施鈣處理的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞組分這一類別中,因?yàn)橹参镏薪^大部分鈣是細(xì)胞壁的果膠質(zhì)結(jié)構(gòu)成分,與果膠酸形成果膠酸鈣被固定于相鄰2個(gè)細(xì)胞壁之間．通過GO功能分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因主要富集在催化活性、聯(lián)結(jié)、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)和轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng),表明鈣在白菜生長發(fā)育的多個(gè)代謝途徑中均發(fā)揮著重要作用．該結(jié)果與張圣美等[32]報(bào)道一致．對(duì)兩個(gè)白菜品種的對(duì)照和施鈣處理進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因富集在了轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝通路中,表明外源施用鈣肥后,為了調(diào)節(jié)植物體內(nèi)外鈣離子的平衡,相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)基因開始表達(dá)．鈣離子可與含 EF 手性單元結(jié)構(gòu)的鈣離子感受蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)下游靶蛋白活性,起到重要的信使作用[33]．本研究結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,這說明施鈣后白菜能夠迅速響應(yīng)外界鈣離子濃度的變化．‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’的對(duì)照和施鈣處理的差異表達(dá)基因富集在氨基酸的生物合成、氨基酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、氮代謝和α-亞麻酸代謝等通路中．檀龍顏等[34]指出,鈣脅迫下越南槐萌發(fā)種子中谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)上調(diào),證明了越南槐種子通過調(diào)控氨基酸代謝適應(yīng)高鈣環(huán)境．而絲氨酸可以作為脅迫條件下次生代謝物合成的前體[35]．這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致．

環(huán)境缺鈣和鈣離子(Ca2+)運(yùn)輸、利用效率低是造成植物缺鈣的2個(gè)主要原因[31]．王照[36]研究指出,ECA基因家族參與調(diào)控植物對(duì)Ca2+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程,同時(shí),RrECA2在刺梨根系中的表達(dá)與鈣吸收速率呈正相關(guān),RrECA1在葉片中的表達(dá)與鈣吸收速率呈正相關(guān),對(duì)刺梨吸收Ca2+具有重要意義．在本研究中,施用鈣肥后,兩個(gè)白菜品種的BcECA家族基因上調(diào)表達(dá),BcECA2表達(dá)量在兩個(gè)品種中均顯著上調(diào),在0.4 g/kg的鈣處理下,BcECA3.1,BcECA4.1和BcECA4.2表達(dá)量在‘黑葉五月慢’品種中顯著上調(diào)．CAS在擬南芥基因組中是一個(gè)單拷貝基因,它編碼了一個(gè)由387個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),分子量為41 268 Da．實(shí)驗(yàn)表明BcCAS的氨基端是一個(gè)對(duì)Ca2+低親和但高結(jié)合的區(qū)域,每個(gè)BcCAS的氨基端能結(jié)合10～12個(gè)Ca2+,定位于葉綠體的類囊體膜上調(diào)節(jié)Ca2+水平[37-39]．本試驗(yàn)中,施用鈣肥提高了‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’植株中BcCAS家族基因的表達(dá)量,且BcCAS1和BcCAS2表達(dá)量在‘黑葉五月慢’品種中顯著上調(diào)．Weinl等[39]報(bào)道了CAS受抑制的擬南芥在低鈣時(shí)也能抽薹,但時(shí)間比野生型晚,說明CAS在植物生長發(fā)育中起著重要的作用,同時(shí)其Ca2+濃度比野生型高了40%,也暗示了植物可能借助CAS來調(diào)節(jié)Ca2+水平．

4 結(jié)論

施鈣可以顯著提高‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’地上部和根系生物量,‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’生物量分別在0.6 g/kg和0.4 g/kg CaSO4·2H2O處理時(shí)最佳．隨著施鈣水平的增加,兩個(gè)白菜品種地上部和地下部的鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體上表現(xiàn)為先增后減趨勢(shì),在0.6 g/kg CaSO4·2H2O處理下達(dá)到最大值．轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),兩個(gè)白菜品種的對(duì)照和施鈣處理的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞組分這一類別中,富集的代謝通路包括轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、氨基酸的生物合成、氨基酸代謝和氮代謝等通路中．施鈣處理后,‘黑葉五月慢’和‘上海六月慢’的BcECA和BcCAS家族基因表達(dá)量上調(diào)．Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明,不同鈣水平處理下白菜BcECA和BcCAS家族基因表達(dá)量與鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間具有正相關(guān)關(guān)系．