萬松，陳泰輝，林長錦，王寧，張建芬

（浙江樹人學院 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310015）

桑椹味道鮮美、營養(yǎng)豐富，含有對人體有益的多糖、氨基酸、花青素、維生素、黃酮等成分[1]。桑椹具有增強人體免疫力、防止動脈硬化、降血脂、降血糖和預防癌癥等功能[2]。桑椹是一種藥食兩用的水果，市場需求廣，具有很高的開發(fā)利用價值。近年來，我國果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展快速[3-4]，桑椹的年產(chǎn)量逐年提高。桑椹為柔軟多汁的漿果，且缺乏保護性外皮，容易腐爛。桑椹真菌性病害主要包括果實成熟前的菌核病害和采后的腐生性病害[5-6]。桑椹菌核病的病原菌主要為核盤菌科真菌[7]，引起桑椹腐生性病害的微生物主要有鏈格孢屬（Alternaria sp.）、灰霉屬（Botrytis sp.）和毛霉屬（Mucor sp.）等[6，8]，這些真菌在環(huán)境中廣泛存在，極易引起桑椹采后的霉變腐爛。

目前桑椹保鮮研究主要集中于低溫保鮮法、化學試劑保鮮法和生物保鮮法等[2，9]。拮抗微生物具有成本低、安全性高、環(huán)境污染小等特點，更具有應用前景。目前，對于桑椹的微生物保鮮主要集中在拮抗細菌，如枯草芽胞桿菌（B.subtilis）[5]、貝萊斯芽孢桿菌（B.velezens）[10]、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）[11]等，鮮有酵母用于桑椹采后保鮮的研究。拮抗酵母菌是公認安全的微生物，容易被市場接受，是理想的水果采后保鮮劑[10]，是一種很有前景的化學殺菌劑替代品[12]。目前，已經(jīng)有一些拮抗酵母被廣泛研究，如假絲酵母屬（Candida spp.）、隱球菌屬（Cryptococcus spp.）、梅氏菌屬（Metschnikowia spp.）、畢赤酵母屬（Pichia spp.）、紅酵母屬（Rhodotorula spp）和酵母樣真菌（A.pullulans）[12-15]。并且橄欖假絲酵母（C.oleophila）、清酒假絲酵母（C.sake）、水果梅氏菌（M.fructicola）、釀酒酵母（S.cerevisiae）和白色隱球菌（C.albidus）等已開發(fā)為商業(yè)產(chǎn)品[12-16]。目前學者更傾向于通過從果蔬表面分離來篩選拮抗微生物，因為它們能夠更好地適應果實表面的生長環(huán)境，從而有效抑制病原真菌[17]。

本文從腐爛桑椹中分離鑒定致腐菌，然后研究前期從桑椹中分離得到的3 株內(nèi)生酵母菌[擬粉紅鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum） 和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）]對桑椹致腐真菌的拮抗效果，為開發(fā)一種天然、安全、高效的桑椹微生物保鮮劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品新鮮桑椹：市售，用塑料盒運至實驗室后剔除機械傷、病蟲果，于4 ℃貯藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（1 000 mL）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，若制備固體培養(yǎng)基，加入20 g 瓊脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基（1 000 mL）：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，若制備固體培養(yǎng)基，加入20 g 瓊脂粉。

1.2 桑椹采后致腐真菌的分離

桑椹樣品在實驗室中25 ℃放置2～3 d，將發(fā)生病害的桑椹在75%乙醇中浸泡30 s，用滅菌水漂洗3 次，用無菌刀從病果切取大小約為3 mm×3 mm 的組織塊，植入PDA 平板上，于28 ℃培養(yǎng)。待切口處長出菌絲后將菌絲轉接至新鮮的PDA 平板純化，多次純化直至獲得純菌株。

1.3 分離真菌的致病性測定

分離真菌的致病性測定按照柯赫法則進行驗證，具體參考周建華等[4]方法，每組實驗重復3 次。將分離的真菌接種到PDA 平板上，于28 ℃暗培養(yǎng)10 d。用滅菌打孔器取菌落邊緣菌絲塊，用無菌接種針針刺表面消毒的新鮮桑椹，將菌絲塊接種于針刺部位，以接種PDA 培養(yǎng)基的桑椹為空白對照。然后將桑椹置于鋪有3 層滅菌吸水紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃下暗培養(yǎng)，每隔1 d觀察桑椹的發(fā)病情況。待桑椹出現(xiàn)明顯霉變癥狀后再進行真菌分離，觀察再次分離的真菌與原接種真菌的平板菌落形態(tài)和顯微鏡觀察形態(tài)是否一致。

1.4 桑椹采后致腐真菌的鑒定

致腐真菌的形態(tài)學觀察：觀察分離菌株在PDA 平板上的菌落形態(tài)、色澤以及是否產(chǎn)生孢子，在光學顯微鏡（400 倍）下觀察菌絲及分生孢子形狀。

分子生物學鑒定：將菌株接入PDA 平板，28 ℃條件下培養(yǎng)7 d 后收集菌絲。采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取真菌基因組DNA。利用通用引物ITS1/ITS4 對菌株的內(nèi)源轉錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后，委托上海生工生物有限公司進行測序。將測序得到的DNA 序列提交GenBank 進行Blast 比對。比對后，下載同源序列，采用MEGA 7 軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 酵母菌對致腐菌的體外拮抗實驗

酵母于YPD 培養(yǎng)基平板活化后，接入YPD 液體培養(yǎng)基（50 mL/250 mL）中，于28 ℃下振蕩培養(yǎng)4 d，即得酵母發(fā)酵液。發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，得到的菌體沉淀用滅菌生理鹽水洗滌2 次，將菌體沉淀用無菌水重懸制成酵母菌懸液，并用血球計數(shù)板計數(shù)。酵母菌濃度分別調整為1×103、1×104、1×105、1×106個/mL，分別取0.1 mL，涂布PDA 平板，無菌水作對照。用打孔器從致腐菌菌落邊緣取直徑為6 mm 的菌絲塊，放在每個平板的中心，每組實驗重復3 次。28 ℃下培養(yǎng)5 d 后測量并記錄致腐真菌生長區(qū)的直徑。

1.6 酵母對桑椹的保鮮效果實驗

參照韓蓓蓓[6]的處理方法，挑選健康的桑椹鮮果放入酵母菌懸液（1×106個/mL）中浸泡3 min，取出后放在通風處自然風干，存放在塑料保鮮盒內(nèi)于4 ℃冰箱貯藏，以無菌蒸餾水處理為空白對照（Control）。酵母菌懸液處理和無菌水處理均為40 顆桑椹。以桑椹變軟或表面出現(xiàn)白色或灰色霉菌菌絲為腐爛，每3 d 觀察1 次，記錄腐爛桑椹的數(shù)量，計算腐爛率。腐爛率的計算參照文獻[11]方法，腐爛桑椹數(shù)量除以桑椹總數(shù)量即為腐爛率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

每組實驗平行3 次，采用Excel 進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 8.0 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 致腐真菌的分離、形態(tài)鑒定

從腐爛桑椹中分離得到3 株真菌（分別編號MFR-1、MFR-2、MFR-3）。在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，各菌株的菌落形態(tài)如圖1 所示。

圖1 桑椹致腐真菌的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of rot-causing fungi from mulberry fruit

由圖1 可知，MFR-1 在PDA 平板上生長迅速，菌絲發(fā)達，呈白色細密絨毛狀；MFR-2 菌落為黑色粗地毯狀，在其上密生黑色粉粒；MFR-3 菌絲較為稀疏，菌落內(nèi)肉眼可見鼠糞樣菌核。利用顯微鏡觀察3 株菌絲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)MFR-1 菌絲發(fā)達，菌絲無隔膜，分生孢子呈卵圓形且具有橫隔；MFR-2 菌絲發(fā)達，分生孢子頭為放射狀，有球形頂囊；MFR-3 分生孢子梗細長，叢生，頂端簇生橢圓形分生孢子。

2.2 致病性測定

致病性測定結果如圖2 所示。

圖2 不同菌株對桑椹的致病性檢測（接種第6 天）Fig.2 Detection of pathogenicity of different strains to mulberry fruit（day 6 of inoculation）

3 株真菌均可引起桑椹腐爛病發(fā)生，接種第3 天可觀察到桑椹病斑和菌絲生長，第5 天時，桑椹的菌絲塊接種周圍發(fā)生明顯的霉變腐爛，第6 天時（圖2），整顆桑椹腐爛，周圍形成肉眼可見的白色霉層或灰黑色霉層。因此，分離到的3 株真菌均可引起桑椹的霉變腐爛，其中菌株MFR-2 引起的桑椹腐爛最為嚴重。

2.3 致腐真菌的分子鑒定

以致腐真菌的基因組DNA 為模板，以ITS1 和ITS4 為引物，成功擴增ITS 區(qū)序列，進行測序后，提交GeneBank 經(jīng)Blast 比對分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，結果如圖3 所示。

圖3 桑椹致腐真菌的ITS 區(qū)系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of rot-causing fungi from mulberry fruit based on their ITS sequence

如圖3 所示，結合形態(tài)學特征和系統(tǒng)發(fā)育分析結果，菌株MFR-1 鑒定為鏈格孢菌（Alternaria alternata）；菌株MFR-2 鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）；菌株MFR-3 鑒定為富克爾核盤菌（Botryotinia fuckeliana）。鏈格孢菌可引起包括小麥、馬鈴薯、玉米、煙草、番茄、蘋果、梨、草莓等幾十種農(nóng)作物的真菌性病害[15]。黑曲霉分布廣泛，常引起蔬菜、水果等腐爛。核盤菌是引起桑椹菌核病的病原菌，肖建京等[18]從浙江省淳安縣的桑葉中分離鑒定出病原菌富克爾核盤菌（Botryotinia fuckeliana）。鄭澤林等[19]從陜西省周至縣桑園土壤中分離到一株核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。周建華等[4]研究發(fā)現(xiàn)，引起湖北省桑椹腐爛病的病原菌為灰霉菌。富克爾核盤菌（Botryotinia fuckeliana）是灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的有性型，灰葡萄孢寄主范圍廣泛，可引起多種蔬菜、果樹及觀賞作物發(fā)生灰霉病[20]。此外，也有其它桑椹致腐真菌分離的報道，如葡萄孢屬（Botrytis spp.）霉菌、匐枝根霉（Rhizopus stolonifer spp.）菌、毛霉屬（Mucor spp.）霉菌[6]和層出鐮刀菌（Fusarium prolifertum）[17]等。

2.4 酵母菌對致腐真菌的體外拮抗實驗

課題組前期從桑椹中分離得到酵母菌3 株，分別為擬粉紅鎖擲孢酵母（S.pararoseus）、葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）、異常威克漢姆酵母（W.anomalus），考察3 株酵母菌對桑椹致腐真菌的體外拮抗作用，結果如圖4 所示。

圖4 酵母菌對致腐真菌的體外拮抗實驗Fig.4 In vitro antagonistic experiments of yeasts against rotcausing fungi

由圖4 可知，擬粉紅鎖擲孢酵母對MFR-2 的抑制作用不明顯，對MFR-1 的抑制作用較強，而對MFR-3的抑制作用最強，當酵母菌濃度為1×106個/mL 時，對MFR-3 的抑制率為100%。葡萄汁有孢漢遜酵母和異常威克漢姆酵母對3 株桑椹致腐真菌均具有強烈的抑制作用，當酵母菌濃度為1×106個/mL 時，對3 株桑葚致腐真菌的抑制率達90%以上。綜上擬粉紅鎖擲孢酵母對桑椹致腐真菌的體外拮抗作用有選擇性，而葡萄汁有孢漢遜酵母和異常威克漢姆酵母的體外拮抗作用更為廣譜，具有更好的拮抗作用。

2.5 酵母菌對致腐真菌的體內(nèi)拮抗實驗

考察擬粉紅鎖擲孢酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母和異常威克漢姆酵母對桑椹致腐真菌的體內(nèi)拮抗作用，結果如圖5 所示。

圖5 酵母菌對致腐菌的體內(nèi)拮抗實驗Fig.5 In vivo antagonistic experiments of yeast against rotcausing fungi

由圖5 可知，經(jīng)3 種酵母菌懸液中浸泡處理之后，桑葚腐爛率均有不同程度的降低。其中，擬粉紅鎖擲孢酵母菌液和葡萄汁有孢漢遜酵母菌液處理過的桑椹，其腐爛率降低更為明顯，在處理12 d 后分別比空白對照降低了18.7%和21.9%。因此，綜合體外拮抗實驗結果和體內(nèi)拮抗實驗結果，擬粉紅鎖擲孢酵母菌液和葡萄汁有孢漢遜酵母對桑椹致腐真菌均有較好的拮抗作用，具有良好的應用前景。目前，對于桑椹的微生物保鮮主要集中在枯草芽孢桿菌，鮮有拮抗酵母用于桑椹保鮮的研究。草莓與桑椹都是易腐爛的漿果，有關拮抗酵母用于草莓保鮮的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)，擬粉紅鎖擲孢酵母對草莓灰霉病菌具有明顯的拮抗作用[21-22]。Qin 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄汁有孢漢遜酵母可通過產(chǎn)生揮發(fā)性物質延長草莓的貨架期。未來還需進一步研究這3 株酵母菌對桑椹致腐真菌的體內(nèi)外拮抗機理。

3 結論

有效控制采后病害的發(fā)生對保持果蔬品質、降低真菌毒素污染風險、延長貯藏和貨架時間具有重要意義。本文從腐爛桑椹中分離出3 株致腐真菌，經(jīng)形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，菌株MFR-1、MFR-2、MFR-3 分別鑒定為鏈格孢菌（A.alternata）、黑曲霉（A.niger）和富克爾核盤菌（B.fuckeliana）。然后研究桑椹內(nèi)生酵母菌對桑椹致腐真菌的體內(nèi)外拮抗效果。體外拮抗實驗顯示：擬粉紅鎖擲孢酵母對菌株MFR-1 和MFR-3 具有很好的抑制作用；葡萄汁有孢漢遜酵母和異常威克漢姆酵母對菌株MFR-1、MFR-2、MFR-3 具有很好的抑制作用，當酵母菌濃度為1×106個/mL 時，對3 株桑葚致腐真菌抑制率為90%以上。體內(nèi)拮抗實驗結果顯示，擬粉紅鎖擲孢酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母對3 株桑椹致腐真菌都具有很好的拮抗效果。后續(xù)還可進行酵母對桑椹致腐菌的拮抗機理研究，并研究它們的固體制劑，以加速拮抗酵母在桑椹采后病害控制中的實際應用進程。