余捷，李亞娜，夏瑾瑾，閆普普，劉佳麗，郭利偉，楊小林，劉國(guó)平，易提林

（長(zhǎng)江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 荊州 434000）

荷葉為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥葉，具有多種生理功效，如預(yù)防高脂血癥、高血壓、肥胖等[1-2]，同時(shí)具有抗氧化、抗癌、保肝、抗炎等作用[2]。荷葉中富含多種活性成分，如多糖、黃酮類(lèi)化合物和生物堿等[3]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)荷葉的研究主要集中在黃酮類(lèi)化合物[4-6]、生物堿等活性物質(zhì)方面[7-10]，對(duì)荷葉多糖的研究較少，而多糖作為一種廣泛存在的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、抗糖基化、免疫調(diào)節(jié)等作用[11-14]。我國(guó)荷葉年產(chǎn)量超過(guò)7 000 t，然而只有1%被用于茶葉和餐飲行業(yè)，大部分被作為副產(chǎn)品丟棄[2]。因此，為了促進(jìn)荷葉在食品工業(yè)中的應(yīng)用，開(kāi)發(fā)綠色高效的荷葉多糖制備方法是必要的。

目前，植物多糖的提取方法有溶劑法、酶解法、微波提取法、超聲輔助提取法、超臨界流體萃取法等。酸堿溶劑提取法易破壞多糖結(jié)構(gòu)[15]，超聲輔助提取法和超臨界流體萃取法則具有設(shè)備要求高、提取成本高、消耗能源大等缺點(diǎn)[16]。酶輔助可以提高多糖的提取效率和生物活性[17]。目前已有酶解法提取荷葉多糖的研究，但并未對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[18]，有關(guān)多種酶復(fù)合后酶解荷葉多糖的研究鮮有報(bào)道。因此，本文選擇纖維素酶和木瓜蛋白酶按照質(zhì)量比為1∶1 復(fù)合，在考察pH 值、溫度、液料比、復(fù)合酶添加量、提取時(shí)間5 個(gè)單因素對(duì)荷葉多糖得率影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化荷葉多糖的提取工藝，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究，以期為荷葉資源的深度開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

荷葉飲片：市售；纖維素酶（50 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、丙酮、濃硫酸、苯酚、無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、乙醚、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水（均為分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204 電子天平：上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HS-800D 恒溫水浴鍋：太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5804R 高速臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司；RE-5286A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；UV5500PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；Spectra Max 多功能酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；SCIENTZ-12N/B 冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；ST300 酸度計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取方法

荷葉飲片用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩，索氏提取器乙醚脫脂，揮干有機(jī)溶劑后65 ℃烘干。按照液料比30∶1（mL/g）配制pH 值為6.8 的碳酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的復(fù)合酶（纖維素酶∶木瓜蛋白酶質(zhì)量比=1∶1），50 ℃水浴活化10 min，加入5.0 g荷葉粉，50 ℃水浴100 min。沸水浴5 min 使酶失活，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入4 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置24 h。3 000 r/min，離心5 min 得沉淀，無(wú)水乙醇和丙酮洗滌后冷凍干燥即得荷葉多糖。

1.3.2 荷葉多糖含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取100 mg 無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，于100 mL容量瓶中配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的對(duì)照品溶液。分別精密移取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于具塞試管中，蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，再依次精密加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液，搖勻后迅速加入5 mL 濃硫酸，再次搖勻。50 ℃水浴30 min，流水冷卻至室溫[19]。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在490 nm 處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度和吸光度關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=6.693X+0.018 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。

1.3.2.2 多糖得率的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取稀釋后的溶液2.0 mL，按1.3.2.1 的方法，測(cè)定荷葉多糖的吸光度，重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算荷葉多糖得率。荷葉多糖得率計(jì)算公式如下。

式中：Y 為荷葉多糖得率，%；C 為多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；N 為測(cè)定樣品稀釋倍數(shù)；M 為干粉質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

精密稱(chēng)取經(jīng)處理的荷葉粉5.0 g，置于250 mL 的具塞錐形瓶中，考察pH 值、溫度、液料比、復(fù)合酶添加量、提取時(shí)間對(duì)荷葉多糖得率的影響，各因素分別設(shè)置5 個(gè)水平，進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of single factor tests

1.3.4 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取pH 值（A）、溫度（B）、液料比（C）、復(fù)合酶添加量（D）、提取時(shí)間（E）為自變量，以多糖得率為響應(yīng)值Y，采用軟件Design-Expert V12.0 進(jìn)行五因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.3.5 荷葉多糖抗氧化試驗(yàn)

將采用最佳提取工藝提取的荷葉多糖配制成濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL 的溶液，通過(guò)分光光度法測(cè)定其對(duì)DPPH 自由基和羥自由基的清除能力，考察荷葉多糖的抗氧化作用。

1.3.5.1 荷葉多糖對(duì)DPPH 自由基清除率的測(cè)定

參考劉曉鵬等[20]的方法，并稍作修改。將100 μL測(cè)試樣品與100 μL 新配制的DPPH 溶液（0.1 mmol/L）混合，輕微振蕩后在室溫下避光孵育30 min?；旌衔镌?17 nm 處測(cè)定吸光度。DPPH 自由基清除率（X1，%）計(jì)算公式如下。

式中：Ab為對(duì)照組的吸光度；As為樣品組吸光度；Ac為未添加DPPH 溶液的空白對(duì)照組吸光度。

1.3.5.2 荷葉多糖對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定

參照Chen 等[21]的方法，并稍作修改。將1 mL 測(cè)試樣品置于5 mL 離心管中，分別快速向離心管中加入1 mL FeSO4溶液（0.009mol/L）和水楊酸乙醇溶液（0.009mol/L），混勻后快速加入1 mL H2O2溶液（0.009 mol/L），37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫后測(cè)定吸光度。羥自由基清除率（X2，%）計(jì)算公式如下。

式中：Ab為對(duì)照組的吸光度；As為樣品組吸光度；Ac為多糖溶液本身吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行繪圖，Design-Expert V12.0 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH 值對(duì)多糖得率的影響

pH 值對(duì)荷葉多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 pH 值對(duì)荷葉多糖得率的影響Fig.1 Effect of pH on the yield of lotus leaf polysaccharide

由圖1 可知，隨著pH 值的升高，荷葉多糖得率整體呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH 值為6.8 時(shí)，荷葉多糖得率達(dá)到最大值，為2.37%。因此選擇pH 值為6.2、6.8、7.4 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 溫度對(duì)荷葉多糖得率的影響

溫度對(duì)荷葉多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)荷葉多糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on the yield of lotus leaf polysaccharide

由圖2 可知，多糖得率在40～50 ℃之間隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，荷葉多糖的得率達(dá)到最大值，為1.95%。這可能是由于復(fù)合酶在50 ℃時(shí)活性最強(qiáng)，分解細(xì)胞壁的效果最佳。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，酶蛋白開(kāi)始受熱變性，使得酶活性逐漸降低，導(dǎo)致多糖得率下降[22-23]。因此選擇溫度為45、50、55 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 液料比對(duì)荷葉多糖得率的影響

液料比對(duì)荷葉多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 液料比對(duì)荷葉多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of lotus leaf polysaccharide

由圖3 可知，多糖得率呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)pH 值為6.2 時(shí)，得率達(dá)到最大值，為1.99%。這可能是因溶劑增加擴(kuò)大了反應(yīng)體系中荷葉粉與復(fù)合酶的接觸面積，隨著溶劑體積的增加，提取液黏度降低，多糖分子更多地被溶出。當(dāng)溶劑用量超過(guò)一定范圍時(shí)，使得酶的濃度明顯降低，從而影響到酶的催化效率，這可能是后期隨著溶劑用量不斷增加，荷葉多糖得率反而降低的原因[24-25]。此選擇液料比為20∶1、30∶1、40∶1（mL/g）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 復(fù)合酶添加量對(duì)荷葉多糖的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)荷葉多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 復(fù)合酶添加量對(duì)荷葉多糖得率的影響Fig.4 Effect of complex enzyme addition on the yield of lotus leaf polysaccharide

由圖4 可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，荷葉多糖得率不斷增加，當(dāng)復(fù)合酶添加量為0.6%時(shí)，荷葉多糖得率達(dá)到最大值，隨后得率不斷下降。因此選擇復(fù)合酶添加量為0.4%、0.6%、0.8%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)荷葉多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)荷葉多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)荷葉多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of lotus leaf polysaccharide

由圖5 可知，隨著提取時(shí)間的增加，荷葉多糖得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，并在100 min 時(shí)達(dá)到最大值。因此選擇提取時(shí)間為80、100、120 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立

利用軟件Design-Expert V12.0 對(duì)5 個(gè)自變量進(jìn)行二次多元線性回歸分析，得到結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface testresults

建立二次回歸方程，對(duì)響應(yīng)因素和多糖得率進(jìn)行二次多元方程擬合，得到回歸方程為Y=1.67+0.125 6A+0.065 2B +0.174 0C +0.206 1D +0.047 2E +0.353 0AB-0.328 9AC+0.196 1AD+0.633 1AE+0.442 6BC+0.324 2BD-0.0353BE+0.291 3CD+0.120 5CE+0.308 7DE+0.144 2A2-0.384 9B2+0.476 1C2+0.262 8D2+0.107 3E2。

2.2.2 響應(yīng)面模型的方差分析

回歸方差分析見(jiàn)表4。

表4 回歸方差分析Table 4 Results of analysis of variance

2.2.3 響應(yīng)面條件優(yōu)化及驗(yàn)證

回歸方程的三維響應(yīng)面和二維等高線如圖6 所示。

等高線圖的形狀越呈橢圓說(shuō)明兩個(gè)影響因素之間的交互作用越顯著，反之則為不顯著。由響應(yīng)面優(yōu)化得到荷葉多糖的最佳提取工藝條件為pH7.027、溫度51.665 ℃、液料比39.163∶1（mL/g）、復(fù)合酶添加量0.739%、提取時(shí)間115.787 min。考慮到試驗(yàn)操作的可行性，對(duì)預(yù)測(cè)工藝條件修正為pH7.0、溫度52 ℃、液料比39∶1（mL/g）、復(fù)合酶添加量0.7%、提取時(shí)間116 min。在此條件下，重復(fù)提取荷葉多糖3 次，結(jié)果荷葉多糖的得率均值為3.26%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明模型有效合理，可以用于荷葉多糖提取工藝的優(yōu)化。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH·清除能力

荷葉多糖的DPPH 自由基清除率如圖7 所示。

圖7 荷葉多糖的DPPH·清除率Fig.7 DPPH free radical scavenging ability of lotus leaf polysaccharide

由圖7 可知，荷葉多糖在0.1～4.0 mg/mL 的范圍內(nèi)對(duì)DPPH 自由基的清除率隨著濃度增大而升高，IC50值為2.355 mg/mL。DPPH 自由基清除能力測(cè)定是一種快速、簡(jiǎn)便的評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抗氧化活性的方法，該結(jié)果表明荷葉多糖具有較好的清除DPPH 自由基作用。

2.3.2 羥自由基清除能力

荷葉多糖的羥自由基清除率如圖8 所示。

圖8 荷葉多糖的羥自由基清除率Fig.8 Hydroxy radical scavenging ability of lotus leaf polysaccharide

由圖8 可知，羥自由基隨著荷葉多糖濃度的增加而增加，在2.0 mg/mL 時(shí)清除率接近100%，IC50值0.331 2 mg/mL。活性氧中，羥自由基活性最強(qiáng)，可引起組織損傷或細(xì)胞死亡。因此，清除羥自由基對(duì)細(xì)胞或機(jī)體的抗氧化防御很重要，該結(jié)果表明荷葉多糖具有較好的清除羥自由基作用。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助提取荷葉多糖的最佳工藝條件為pH7.0、溫度52 ℃、液料比39∶1（mL/g）、復(fù)合酶添加量0.7%、提取時(shí)間116 min，荷葉多糖得率可達(dá)3.26%，說(shuō)明采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取荷葉多糖的方法可行，具有較強(qiáng)的實(shí)際意義，可用于提取荷葉多糖。

荷葉多糖抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，荷葉多糖對(duì)自由基的清除能力與濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)效應(yīng)，多糖濃度越大，抗氧化能力越強(qiáng)，清除DPPH 自由基和羥自由基的IC50值分別為2.355、0.331 2 mg/mL，表明荷葉多糖對(duì)羥自由基的清除能力強(qiáng)于對(duì)DPPH 自由基的清除能力，說(shuō)明荷葉多糖具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑加以開(kāi)發(fā)利用。因此，本研究結(jié)果為荷葉多糖的開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)踐基礎(chǔ)和理論支撐。