陳 莉，安海燕，張承承，郭曉媛

北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的常見慢性微血管并發(fā)癥之一，也是世界范圍內(nèi)終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要病因。一項對中國北京地區(qū)DKD 患者長達12 年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，DKD 患者通常面臨著更高的死亡風險和更短的預期壽命［1］，生活質量嚴重下降，對DKD的早期預防與合理治療應得到高度重視。西醫(yī)治療DKD 主要包括降糖、降壓、降脂、控制尿蛋白、限制蛋白攝入等，藥物應用主要以血管緊張素轉化酶抑制劑及血管緊張素受體拮抗劑為主，但這些治療是否能延緩ESRD 的進展尚不明確［2］。近些年來，對中醫(yī)藥治療DKD的相關研究越來越多，且臨床方面證明具有良好療效［3-4］。

DKD 在中醫(yī)古籍中并沒有明確的病名記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)中醫(yī)將其歸于“消渴”“尿濁”“濁毒”“水腫”等范疇。從濕熱治DKD，中醫(yī)古籍中也多有記載，《素問·奇病論篇》云：“此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也……轉為消渴?！笨梢姽湃藢τ陲嬍巢划敁p傷脾胃導致消渴早有認識。現(xiàn)代人隨著生活質量的提高，喜食肥甘厚味，易損傷脾胃，導致納運失職，生濕化熱，此外，隨病程發(fā)展，濕熱可與其他病理因素，如痰濁、瘀血互結，導致DKD纏綿不愈?，F(xiàn)代中醫(yī)學者在治療DKD方面有眾多學說，例如絡病論、伏邪論、癥瘕論、濁毒論等，但不論哪種理論均強調(diào)了濕熱這一病理因素在DKD 病程中的作用，劉寶厚教授提出：“濕熱不去，蛋白難消”的觀點［5］，可見，在治療DKD 時加入清熱利濕藥物具有一定理論依據(jù)。

蒼術-黃柏藥對源至二妙散，最早見于危亦林《世醫(yī)得效方》，后于《丹溪心法》中改名為二妙散，具有清熱祛濕功效。其中黃柏為君藥，味苦性寒，苦以燥濕，寒以制溫，長于清下焦?jié)駸?；蒼術為臣藥，味辛、苦，性溫，為苦燥之品，長于入脾胃，既能健脾又能祛濕。兩藥合用，標本兼顧，能祛濕除熱。研究表明，加入蒼術和黃柏藥對的中藥方能明顯改善DKD患者的蛋白尿和腎功能［6-7］。現(xiàn)采用網(wǎng)絡藥理學方法探討蒼術-黃柏治療DKD的主要活性成分、作用靶點及信號通路，從現(xiàn)代微觀角度更精準地揭示中醫(yī)藥治療DKD的作用機制。

1 資料與方法

1.1 蒼術-黃柏活性成分篩選及靶點信息收集基于中藥系統(tǒng)藥理學平臺（http：//tcmspw.com/）檢索蒼術-黃柏藥對的活性成分，以中藥口服生物利用度（OB）≥30%及化合物類藥性（DL）≥0.18 為篩選標準對活性成分進行篩選，并根據(jù)TCMSP獲得的活性成分進一步收集對應靶蛋白，排除無法獲得靶蛋白的活性成分。利用Uniprot 蛋白質數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對檢索出的蛋白化合物進行靶點預測，去除非人源靶點，并將之轉化為基因名稱。

1.2 疾病靶點獲取在人類基因數(shù)據(jù)庫Genecards（https：//www.genecards.org/）和 人 類 孟 德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（https：//omim.org/）中輸入“diabetic kidney disease”進行檢索，獲得疾病靶點后進行整合和去重處理，利用Venn 圖將收集到的蒼術-黃柏藥對活性成分靶點與DKD 靶點取交集獲得藥對治療DKD 的靶點，并制作“藥物成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖。

1.3 關鍵靶點篩選及蛋白互作網(wǎng)絡（proteinprotein interaction，PPI）的構建將蒼術-黃柏藥對治療DKD 的交集靶點導入STRING 11.0 版（https：//string-db.org/），限定研究種屬為“homo sapiens”，最低相互作用閾值設為highest confidence（0.9），隱藏游離節(jié)點。獲得蛋白互作關系后將結果導入Cytoscape 3.7.2 軟件，利用MCODE插件按默認篩選標準篩選核心子網(wǎng)絡，同時借“network analyzer”對子網(wǎng)絡進行拓撲學分析。

1.4 核心靶點富集分析與可視化處理采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對蒼術-黃柏藥對治療DKD 的核心靶點進行GO 基因與KEGG 信號通路富集分析，利用微生信（www.bioinformatics.com.cn）平臺中富集氣泡圖對通路進行可視化處理。

2 結果

2.1 蒼術-黃柏藥對活性化合物及潛在作用靶點通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索蒼術-黃柏藥對的活性成分，排除無法獲得潛在作用靶點的活性成分后共留下28 個活性成分，其中蒼術4 個，黃柏24個，具體見表1。202個靶點用于后續(xù)研究。

表1 蒼術-黃柏藥對活性成分

2.2 蒼術-黃柏藥對防治DKD靶點通過人類基因數(shù)據(jù)庫和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫收集疾病靶點并整合，最終共獲得DKD 靶點3494 個，將蒼術-黃柏藥對潛在作用靶點與DKD 靶點取交集獲得133個共同靶點，用于后續(xù)分析，見圖1。

圖1 蒼術-黃柏藥對靶點與DKD靶點Venn圖

2.3 蒼術-黃柏藥對活性成分-潛在作用靶點-疾病網(wǎng)絡構建及分析將上一步中篩選出的133 個潛在作用靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件構建網(wǎng)絡圖，見圖2。網(wǎng)絡圖中共162 個節(jié)點，353 條邊。其中藍色菱形部分為作用靶點，紅色圓形部分為活性成分Mol 編號，綠色方形部分為藥物名稱（CZ蒼術、HB 黃柏），節(jié)點間的連線代表二者之間的對應關系，連線越多提示該活性成分或作用靶點在網(wǎng)絡中發(fā)揮作用越強，圖中節(jié)點越大，表明節(jié)點度值越高。根據(jù)節(jié)點度值排名，排名前3 的活性化合物依次為MOL000098 槲皮素、MOL000173 漢黃芩素、MOL000358β-谷甾醇。

圖2 蒼術-黃柏藥對活性成分-潛在作用靶點-疾病網(wǎng)絡

2.4 PPI 網(wǎng)絡構建與分析將133個交集靶點導入STRING 平臺后獲得PPI 網(wǎng)絡圖，見圖3。將結果導入Cytoscape 軟件進行可視化處理，利用MCODE插件按默認篩選標準共篩選出6個子網(wǎng)絡，其中分值最高的子網(wǎng)絡分數(shù)為42.941，共含有52個靶點，取該網(wǎng)絡為核心子網(wǎng)絡，其中所含靶點為核心靶點，見圖4；該網(wǎng)絡圖共52個節(jié)點，1095條邊，并利用“Network Analyzer”對該核心子網(wǎng)絡進行拓撲分析，圖中每個節(jié)點的大小代表其度值大小，顏色由綠變紅表明節(jié)點度值越來越大，根據(jù)度值大小將排名前15的靶點展示出來，見表2。

圖3 蒼術-黃柏藥對治療DKD潛在作用靶點PPI圖

圖4 蒼術-黃柏藥對治療DKD核心作用靶點子網(wǎng)絡圖

表2 蒼術-黃柏藥對治療DKD的核心靶點

2.5 GO 基因及KEGG 信號通路富集分析通過David 數(shù)據(jù)庫對2.4 步驟中篩選出的52 個核心靶點進行GO基因功能及KEGG通路富集分析，并根據(jù)P值＜0.05 進行篩選，其中生物過程（biological process，BP）有98 條，細胞組分（cellular component，CC）有9 條，分 子 功 能（molecular function，MF）16 條。按P值對生物過程、細胞組分及分子功能進行排名并分別取前5 位以柱狀圖的形式輸出，見圖5。可以看出蒼術-黃柏藥對治療DKD 的生物過程主要包括對RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調(diào)控、脂多糖介導的信號通路、對細胞因子的反應、炎癥反應等。細胞組分分析主要集中在細胞外空間、質膜外側、細胞外基質、核、細胞溶質等。分子功能分析主要集中在細胞因子活性、生長因子活性、轉錄調(diào)控區(qū)DNA 結合、內(nèi)肽酶活性、轉錄因子活性，序列特異性DNA結合等。

圖5 蒼術-黃柏藥對治療DKD的GO分析

對蒼術-黃柏藥對治療DKD的核心交集靶點進行KEGG 富集分析，其中P值＜0.05 的通路共有88條，按P 值排序取排名前20 名的KEGG 通路以氣泡圖形式輸出，結果見圖6，主要包括各種癌癥、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎、TNF信號通路、甲型流感、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路等。

3 討論

張介賓《景岳全書》云：“下消者，下焦病也，小便黃赤，為淋為濁，如膏如脂……其病在腎?！卑l(fā)病初期患者因飲食、環(huán)境致脾虛，脾為后天之本，腎為先天之本，先天有賴于后天之滋養(yǎng)，土生水，母病及子，最終致脾腎俱虛，病情加重。腎主水，腎虛則水失所主而妄行，脾虛運化失職則水濕積聚，水濕聚久化熱灼傷腎絡，加之脾腎虧虛腎精失固，外泄而成蛋白尿。以蒼術、黃柏為主藥的二妙散為治下焦?jié)駸嶂矸?，其中蒼術健脾燥濕，有補有瀉，常用于濕阻中焦。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，蒼術主要包括倍半萜類、烯炔類、三萜及甾體類、芳香苷類等化學成分［8］，其提取物中多糖類成分在降低血糖方面具有重要作用。段國峰等［9］研究發(fā)現(xiàn)，茅蒼術多糖可降低四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠血糖并提高胰島素水平。黃柏可入腎、膀胱經(jīng)，能清相火滋腎水，與蒼術配伍，既能清熱燥濕，又能從根源上防止?jié)裥靶律?。黃柏的化學成分包括多種生物堿，其中小檗堿是最主要成分［10］，小檗堿具有降血糖、降血脂、改善血流動力學、抗炎等多種作用，可通過改善腎臟肥大、腎小球硬化及萎縮、腎小球內(nèi)血管阻力、系膜擴張、炎癥浸潤等多種途徑改善DKD［11］。

通過構建蒼術-黃柏藥對治療DKD 的網(wǎng)絡圖，從中篩選出排名前3 的藥對，發(fā)現(xiàn)蒼術-黃柏藥對發(fā)揮主要作用的活性成分分別為槲皮素、漢黃芩素及β-谷甾醇。其中槲皮素是一種抗氧化劑黃酮醇，屬于類黃酮組，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用。DU 等［12］通過體內(nèi)和體外研究，均發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過激活Hippo 通路從而有效抑制腎小球系膜細胞增殖，改善腎功能。槲皮素還可通過激活AMPK 磷酸化和抑制腎臟中的固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1c，減輕糖尿病腎病大鼠因脂質沉積引起的組織血脂異常，從而防止腎臟疾病進展［13］。漢黃芩素具有多種生物學功能，包括抗炎、抗氧化、抗過敏、抗凋亡等，漢黃芩素可通過抑制NF-kB 和TGF-β1/Smad3 信號通路的激活，對DKD 發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用［14］。在順鉑誘導的急性腎損傷模型中，漢黃芩素能明顯抑制腎小管上皮細胞的壞死，并減少其凋亡，從而有效防止腎損傷和腎功能下降［15］。β-谷甾醇具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗氧化和抗糖尿病等多種藥理作用，在植物中含量豐富［16］。

通過構建蛋白互作網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)，蒼術-黃柏藥對治療DKD的主要核心靶點為JUN、MMP9、CXCL8、TNF、VEGFA、PTGS2、AKT1、IL-6 等。JUN 是 由c-Jun、JunB 及JunD 構成的一整個家族蛋白體系，JUN 可以與Fos 家族蛋白組成穩(wěn)定的二聚體AP-1，AP-1可以與某些調(diào)節(jié)細胞外基質（extracellular matrix，ECM）基因啟動子的特定序列結合，從而調(diào)控ECM 成分的轉錄和表達［17］。腎小球系膜細胞增殖可導致ECM的過量產(chǎn)生和積累，而ECM的進行性積累是糖尿病腎病早期的重要特征，可導致腎小球硬化［18］。MMP-9 的激活與蛋白尿密切相關，白蛋白超載可以觸發(fā)小管表達和分泌MMP-9，而MMP-9 的局部分泌增加可能通過促進腎小管基底膜的降解在腎病進展中發(fā)揮重要作用，導致糖尿病腎臟間質炎癥和纖維化反應［19］。腎小球足細胞是VEGFA 的主要來源，VEGFA 具有腎臟保護作用，當其表達下降時易引起腎臟病變［20］。炎癥反應可以加重腎臟損傷，IL-1b、IL-6 和TNF-α 等細胞因子被認為是炎癥的主要調(diào)節(jié)因子，并在DKD 的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用［21］。CXCL8 是一種典型的CXC趨化因子，能通過與細胞表面G蛋白偶聯(lián)受體（CXCR1和CXCR2）結合激活多個細胞內(nèi)信號通路，促進中性粒細胞的生成和激活，加劇腎臟炎癥反應［22］。

蒼術-黃柏藥對治療DKD 主要涉及PI3K-Akt、TNF、Toll 樣受體及HIF-1 等多條信號通路。PI3K/Akt 信號通路在細胞的生長、分化、增殖、凋亡及糖代謝等一系列活動中發(fā)揮著重要作用［23］，與DKD 足細胞凋亡［24］及自噬［25］均有密切關系。TNF 在各種免疫及炎癥反應過程中發(fā)揮著重要作用，而TNF-α是TNF 家族體系中首個被發(fā)現(xiàn)的蛋白，最初發(fā)現(xiàn)由活躍的巨噬細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞等免疫細胞產(chǎn)生，并參與全身炎癥反應［26］，后在腎臟的多種細胞如內(nèi)皮細胞、腎小球系膜細胞、腎小球和腎小管上皮細胞亦發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生TNF-α。TNF-α可以刺激腎小球系膜細胞產(chǎn)生氧自由基，從而使過氧化脂質代謝產(chǎn)物增多，造成細胞內(nèi)膜損傷，同時能刺激膠原的產(chǎn)生和成纖維細胞的增殖，加上糖基化膠原在血管壁的沉積，促使血管結構改變，最終導致DKD 等微血管病變［27］。TLR4是toll樣受體家族蛋白中的重要成員，主要分布于中性粒細胞和單核巨噬細胞中，在DKD 的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，尤其是炎癥反應。TLR4 在DKD 患者外周血中明顯升高［28］，通過抑制TLR4/NF-κB 通路可以減少炎癥反應、抑制細胞凋亡，減輕足細胞損傷［29］，減少腎纖維化程度［30］。慢性缺氧是包括DKD 在內(nèi)的各種慢性腎臟疾病進展的重要因素，而缺氧誘導因子1（HIF-1）在缺氧造成的一系列病理機制中起著重要作用。腎臟組織缺氧狀態(tài)下，HIF-1α 被激活，表達增加，一方面其可以通過HIF-1α/VEGF 通路促進新生血管生成，此外還可以上調(diào)EPO 基因表達，促進紅細胞生成，使機體適應缺氧狀態(tài)，減輕腎臟損傷［31］。

DKD 的發(fā)病機制目前尚不明確，遺傳因素、糖脂代謝異常、炎性反應、氧化應激、免疫反應、自噬等均被認為是導致疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素［32］，在腎臟病理表現(xiàn)上腎小球基底膜增厚、腎小球系膜擴張、腎小球結節(jié)樣改變及小動脈玻璃樣變等是DKD的特異性表現(xiàn)［33］。既往認為腎小球損傷是DKD的最早期表現(xiàn)，同時也是慢性腎臟病進展的罪魁禍首，而腎小管和間質損傷繼腎小球損傷之后出現(xiàn)。近些年來，新的觀點認為DKD在腎小球損傷出現(xiàn)之前即已出現(xiàn)腎小管的異常，且俱報道，腎小管萎縮和纖維化能更好預測慢性腎臟病的進展［34］。通過上述討論可以得知，蒼術-黃柏藥對能發(fā)揮抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗纖維化等多種功效，對腎臟病理的調(diào)節(jié)涉及系膜細胞增殖、腎小球硬化、腎小管損傷、間質纖維化等多方面，無論是在DKD早期發(fā)病還是病程進展過程均可產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法探討蒼術-黃柏藥對治療DKD，發(fā)現(xiàn)其具有多成分、多靶點、多途徑的特點，可以為進一步探討中藥藥對治療DKD 的作用機制提供依據(jù)。但本研究仍存在許多局限性，首先本研究是基于對各數(shù)據(jù)庫內(nèi)相關信息進行整合而成，其中可能存在數(shù)據(jù)庫信息錄用不全而造成本研究結果出現(xiàn)偏倚，其次，本研究結果缺乏實驗驗證，未來仍需進一步進行實驗以驗證其結果可靠性。