李艷英，郭敏群，魏宏偉，王洪成，楊秀偉

1 北京盈科瑞創(chuàng)新醫(yī)藥股份有限公司，北京 102200； 2 北京大學(xué)，北京 102200；3 盈科瑞（天津）創(chuàng)新醫(yī)藥研究有限公司，天津 300000

左金方出自《丹溪心法》，由黃連、吳茱萸兩味藥材組成，以疏肝清肝、苦寒的黃連為君藥，使肝氣條達(dá)且不上沖犯胃，佐以少量性味辛熱的吳茱萸，辛開(kāi)苦降、相反相成［1］。目前，左金方主要用于治療消化系統(tǒng)疾病，如幽門桿菌感染、消化性潰瘍等［2］。除此之外，臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，用左金方或加減配伍，或調(diào)整黃連、吳茱萸的用量比例，或與其他藥物聯(lián)合使用，能廣泛治療消化道疾病以外的屬“肝經(jīng)火旺”證的諸多疾病，如失眠、高脂血癥、高血壓、眩暈、巔頂痛、脅痛、乳房疼痛、牙痛、妊娠期嘔吐、睪丸腫痛、尿毒癥、梅核氣、小兒臍炎等［3］。

吳茱萸來(lái)源于蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang 的干 燥近成熟果實(shí)［4］。研究表明，吳茱萸含有生物堿、苦味素、揮發(fā)油、黃酮等成分，其中生物堿和苦味素為其主要有效成分［5］。產(chǎn)地來(lái)源和采收時(shí)期不同易出現(xiàn)藥材質(zhì)量差異，直接影響方劑的藥效。本研究建立吳茱萸UPLC 指紋圖譜并進(jìn)行主成分分析，結(jié)合有效成分含量測(cè)定評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地吳茱萸的整體質(zhì)量，探討影響吳茱萸藥材質(zhì)量的因素，為左金方中吳茱萸藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試藥及試劑檸檬苦素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110800-201406，規(guī)格：20 mg，純度99.91%）；吳茱萸堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110802-201409，規(guī)格：20 mg，純度99.7%）；吳茱萸次堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110801-201608，規(guī)格：20 mg，純度99.4%）；去氫吳茱萸堿對(duì)照品（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：5451，規(guī)格：20 mg，純度99.8%）。乙腈為質(zhì)譜級(jí)（賽默飛公司）；甲醇為色譜級(jí)（天津賽孚瑞有限公司）；三氟乙酸為分析純（shanghai titian scientific 公司）；水為屈臣氏蒸餾水；鹽酸為分析級(jí)（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）；乙醇為分析純（北京化工廠）。

吳茱萸樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1，經(jīng)盈科瑞（天津）創(chuàng)新醫(yī)藥研究有限公司中藥資源研究中心主任何燕峰鑒定均為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實(shí)。17批吳茱萸藥材分別編號(hào)為S1～S17。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器Infinity 1290 Ⅱ型超高效液相色譜儀（UPLC）連接G6530C 型四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（安捷倫公司）；S6000 型高效液相色譜儀（華譜科儀科技公司）；MS-204TS 型梅特勒-托利多儀器公司（萬(wàn)分之一）電子分析天平；XPE-105 型梅特勒-托利多儀器公司（十萬(wàn)分之一）電子分析天平；WT3002CF 型常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司（百分之一）電子分析天平；KQ-800DB 型昆山市超聲儀器有限公司超聲清洗器。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜

2.1.1 色譜條件 采用Ultimate UHPLC AQ-C18色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01%三氟乙酸水溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫（0～25 min，5%～11% A；25～35 min，11% A；35～50 min，11%～13% A；50～60 min，13%～20% A；60～70 min，20%～55% A；70～75 min，55%～90% A；75～80 min，90% A）；流速0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量1 μL［6］。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取去氫吳茱萸堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.21 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液100 mL，超聲處理（功率320 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 測(cè)定法 分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各1 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，即得。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 空白試驗(yàn) 取甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液注入超高效液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明空白溶劑無(wú)色譜峰，對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.1.5.2 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)S11 批的吳茱萸樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，以去氫吳茱萸為參照峰（S 峰）計(jì)算各主要特征峰（可指認(rèn)的色譜峰）的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果供試品指紋圖譜呈現(xiàn)與參照物色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，并呈現(xiàn)14 個(gè)主要色譜峰，其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 分別為≤0.23%和4.72%，表明儀器精密度良好。

2.1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)S11 批次的吳茱萸樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在供試品溶液制備后的0、3、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以去氫吳茱萸堿為參照峰（S 峰），計(jì)算各主要特征峰（可指認(rèn)的色譜峰）的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果表明，14 個(gè)主要特征峰其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別≤1.02%和4.50%，表明24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份編號(hào)S13批次的吳茱萸樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成6 份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，以去氫吳茱萸堿為參照峰（S 峰），計(jì)算各主要特征峰（可指認(rèn)的色譜峰）的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果表明，14 個(gè)主要特征峰其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別≤1.24%和4.84%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.6 指紋圖譜方法的建立

2.1.6.1 共有峰的標(biāo)定 取表1 中的17 個(gè)批次的吳茱萸樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備成34 份供試品溶液（每批制備兩份平行樣），分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)2012 年版”軟件進(jìn)行分析，以17批吳茱萸藥材UPLC圖譜色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，選擇17批（34份）吳茱萸指紋圖譜中穩(wěn)定性較好、響應(yīng)值適宜的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定了14個(gè)峰共有峰。見(jiàn)圖1。

圖1 17批吳茱萸藥材指紋圖譜

2.1.6.2 參照物的選擇及對(duì)照指紋圖譜的建立 去氫吳茱萸堿色譜峰吸收強(qiáng)度及保留時(shí)間適中，響應(yīng)穩(wěn)定，達(dá)到基線分離，故選擇去氫吳茱萸堿為參照峰，標(biāo)記為S 峰，同時(shí)將去氫吳茱萸堿對(duì)照品作為參照物，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)，以17批吳茱萸UPLC圖譜色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，形成共有模式圖，并建立對(duì)照?qǐng)D譜。見(jiàn)圖2。

圖2 吳茱萸指紋圖譜共有模式

2.1.6.3 相似度的計(jì)算 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)，以共有峰對(duì)17 批供試品與對(duì)照指紋圖譜的相似度進(jìn)行計(jì)算。相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 17批吳茱萸藥材相似度分析結(jié)果

結(jié)果：17 個(gè)批次吳茱萸藥材指紋圖譜輪廓基本一致，相似度在0.821～0.976 之間，表明不同來(lái)源的吳茱萸藥材指紋圖譜輪廓基本一致，化學(xué)成分種類基本一致，S3、S5、S8、S10、S13、S17 批次的相似度低于0.90，其余批次相似度高于0.90。

2.1.6.4 共有峰的指認(rèn) 通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，對(duì)14 個(gè)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，確認(rèn)峰9（S）為去氫吳茱萸堿，峰10 為吳茱萸堿，峰11 為吳茱萸次堿。其余為質(zhì)譜分析指認(rèn)。流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%甲酸水（B），梯度等其它色譜條件同指紋方法“2.1.1”項(xiàng)下質(zhì)譜檢測(cè)分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，霧化氣壓力35 psi，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細(xì)管電壓4000 V（正模式）和3500 V（負(fù)模式）。一級(jí)質(zhì)譜選用MS模式，質(zhì)量掃描范圍100～1300 m/z。二級(jí)質(zhì)譜選用Auto-MS/MS 模式，碰撞電壓為10、20、30 V。所 得LC-MS 數(shù) 據(jù) 由Agilent Mass-Hunter（B.08.00）軟件采集［6］。數(shù)據(jù)處理采用Agilent 軟件Qualitative Navigator（B.08.00）和Qualitative Workflows（B.08.00），14 個(gè)化合物質(zhì)譜分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 吳茱萸指紋圖譜化學(xué)成分的MS/MS分析

2.1.6.5 指紋圖譜的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析 為了更加直觀地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地吳茱萸藥材的質(zhì)量，采用SIMCA 13.0，以14個(gè)共有峰為變量對(duì)17批吳茱萸藥材進(jìn)行PCA分析，以主成分特征值大于1為提取原則，本研究提取了3 個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)98.5%，表明該3 個(gè)主成分能代表14 個(gè)共有峰在17 批樣品中的98.5%的信息，見(jiàn)表4。以主成分1、主成分2的得分分別為橫、縱坐標(biāo)，生成17批藥材的主成分得分圖，見(jiàn)圖3。17 批樣品主要分為兩類，其中外觀顏色為褐色的、成熟度較高的S3、S5、S8、S10、S13、S17 樣品投影點(diǎn)聚集在一起；其余外觀顏色為暗黃綠色及暗黃綠色至褐色、成熟度較低的S1、S2、S4、S6、S7、S9、S11、S12、S14、S15、S16 樣品投影點(diǎn)聚在一起，與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果一致，推斷吳茱萸藥材顏色深淺與藥材質(zhì)量存在一定的關(guān)聯(lián)性。

圖3 吳茱萸藥材樣品PCA分析得分圖

表4 特征值及方差分析

按PCA 分析結(jié)果將17 批吳茱萸藥材分為2組，成熟度高的果實(shí)標(biāo)記為紅色，成熟度較低的果實(shí)標(biāo)記為藍(lán)色，以峰面積為縱坐標(biāo)，峰的序號(hào)為橫坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖4。可以看出，成熟度較低的果實(shí)峰1、2、3、5、7、8 含量高于成熟度高的果實(shí)；而峰10、11、12、13、14 含量低于成熟度高的果實(shí)。由表3 可知，峰1、2、3、5、7、8 為酚酸類成分，峰10、11、12、13、14為生物堿成分。

圖4 17批吳茱萸樣品成分含量比較圖

2.2 吳茱萸堿、吳茱萸次堿及檸檬苦素的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年 版 的 方 法［4］，采 用ZORBA SB-C18色 譜 柱（4.6×250 mm，5.0 μm）；以［乙腈-四氫呋喃（25∶15）］-0.02%磷酸溶液（35∶65）為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取吳茱萸堿對(duì)照品、吳茱萸次堿對(duì)照品、檸檬苦素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含吳茱萸堿80 μg、吳茱萸次堿50 μg和檸檬苦素0.1 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 m，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理（功率300 W，頻率40 KHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 含量測(cè)定結(jié)果 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版吳茱萸藥材含量測(cè)定項(xiàng)下方法，對(duì)吳茱萸堿、吳茱萸次堿及檸檬苦素的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均符合規(guī)定，檸檬苦素含量范圍為0.50%～2.11%；吳茱萸堿含量范圍為0.09%～1.19%；吳茱萸次堿含量范圍為0.07%～0.61%；吳茱萸堿和吳茱萸次堿總含量范圍為0.16%～1.63%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)外觀顏色為暗黃綠色、顏色較淺的樣品檸檬苦素含量較高，吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量較低；而外觀顏色為褐色的、顏色較深的藥材吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量較高，檸檬苦素含量較低；外觀顏色為暗黃綠色至褐色的，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量、檸檬苦素的含量介于前兩者之間，說(shuō)明果實(shí)的成熟度對(duì)吳茱萸藥材生物堿含量有較大影響。見(jiàn)表5。

表5 吳茱萸藥材中3種成分的含量測(cè)定（%）

2.3 檢查項(xiàng)、浸出物含量測(cè)定根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版吳茱萸藥材檢查和浸出物項(xiàng)下方法對(duì)雜質(zhì)、水分、總灰分、浸出物含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均符合規(guī)定。

3 討論

吳茱萸產(chǎn)于江西、四川、湖南、湖北、陜西、浙江、廣西等地，主產(chǎn)于江西［7-10］。近幾年隨著市場(chǎng)價(jià)格的上漲，主要產(chǎn)區(qū)大面積擴(kuò)種，據(jù)統(tǒng)計(jì)2017年吳茱萸種植面積達(dá)到20萬(wàn)畝，預(yù)計(jì)2～3年后產(chǎn)量將突破30 000 噸。但由于地理位置、氣候條件、栽培條件、采收時(shí)間、環(huán)境及采收時(shí)間等因素而存在品質(zhì)差異。

通過(guò)對(duì)收集的吳茱萸藥材檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，收集的17 批吳茱萸藥材雜質(zhì)、水分、總灰分、二氧化硫、浸出物、檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版規(guī)定；17 個(gè)批次吳茱萸藥材指紋圖譜輪廓基本一致，相似度在0.821～0.976之間。進(jìn)一步結(jié)合17批吳茱萸藥材的指紋圖譜化合計(jì)量學(xué)分析結(jié)果和吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素含量測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)外觀為暗黃綠色、成熟度較低的批次中酚酸類及檸檬苦素含量較高，吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量較低；而外觀為暗黃綠褐色、成熟度較高的批次與之相反，這與此前文獻(xiàn)報(bào)道的果初期吳茱萸果實(shí)中的檸檬苦素含量達(dá)到峰值，但隨著果實(shí)成熟，其含量下降；而吳茱萸堿、吳茱萸次堿在果初期時(shí)含量較低，隨著果實(shí)成熟，逐漸上升至峰值［11-13］，與采收時(shí)期密切相關(guān)。酚酸類成分屬于化感物質(zhì)，溫度、紫外線、光照、雨霧等因素都可以影響酚酸類物質(zhì)的合成和代謝［14-15］，可能采收中后期開(kāi)始?xì)夂虻纫蛩貙?dǎo)致吳茱萸果實(shí)中酚酸類成分含量下降。因此在吳茱萸藥材采收時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注吳茱萸藥材果實(shí)的成熟度，控制好采收時(shí)期以保證藥材質(zhì)量的均一穩(wěn)定。