陳 莉,司徒秋晨,韋 靜,呂宏祥Δ

1.南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院檢驗科,江蘇南京 211100;2.南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院檢驗科,江蘇南京 211100

生長刺激表達基因2蛋白(ST2)又稱為白細胞介素(IL)1受體樣1(ILR1-L1),屬于ILR1-L1家族[1]。該蛋白含有4種亞型,其中兩種較為明顯,分別為跨膜受體(ST2L)和可溶性ST2(sST2)[2]。研究已證實sST2的表達與分泌主要來源于全身的內(nèi)皮細胞[3],同時在心、肺、腎以及T淋巴細胞中均有表達[4];此外,在機體局部炎癥損傷時同樣能夠刺激細胞分泌sST2。已有研究表明,sST2作為炎癥介質(zhì)參與心血管疾病[5]以及內(nèi)分泌疾病[6]的發(fā)生,但是具體調(diào)控機制還未明確。自然殺傷(NK)細胞是人體免疫至關(guān)重要的細胞毒性淋巴細胞,在抗病毒感染和抗腫瘤中發(fā)揮著重要作用[7]。有研究發(fā)現(xiàn),NK細胞功能與血糖水平之間存在相關(guān)性[8],但2型糖尿病(T2DM)患者的NK細胞分布和功能狀態(tài)是否發(fā)生改變尚不清楚。B細胞介導的免疫反應參與多種疾病的發(fā)展進程,在T2DM患者中B細胞可以通過產(chǎn)生IL-6和TNF-α等促炎性細胞因子來調(diào)節(jié)炎癥反應[9],但B細胞反應的差異是否有助于解釋肥胖患者的糖尿病發(fā)病機制尚不清楚。sST2、NK細胞、B細胞三者在T2DM中的相關(guān)性少見報道。本研究擬探討sST2、NK細胞、B細胞在T2DM患者中的水平及相關(guān)性,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年10-12月在南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院住院治療的50例T2DM患者作為T2DM組,其中男30例、女20例,平均(53.70±1.795)歲;另選取同期在該院體檢的30例健康體檢者(血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、心臟彩超、血糖、糖化血紅蛋白等檢查均無異常)作為對照組,其中男16例、女14例,平均(59.50±2.610)歲。T2DM組與對照組性別、年齡比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 Jet-iStar 3000免疫分析儀(中翰盛泰醫(yī)療器械有限公司);貝克曼FC500流式細胞儀和自動酶聯(lián)免疫分析儀[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司];sST2檢測試劑盒(中翰盛泰醫(yī)療器械有限公司)、CYTO-STAT tetra CHROME CD45/CD4/CD8/CD3 T細胞與CD45/CD56/CD19/CD3 NK/B細胞(美國貝克曼庫爾特有限公司);人Th1/Th2/Th17亞群檢測試劑盒(江西賽基生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1標本收集 收集所有研究對象外周靜脈血2 mL,靜置10～20 min,3 000 r/min離心15 min后收集上層血清并置于-80 ℃冰箱保存待測,避免反復凍融。

1.3.2收集資料 收集T2DM組和對照組糖化血紅蛋白(HbA1c)、葡萄糖(Glu)以及餐后1 h血糖(Glu-1 h)的數(shù)據(jù)。

1.3.3運用免疫熒光干式定量法檢測血清中sST2水平 取血清標本50 μL加入檢測緩沖液管中,充分混勻。隨后吸取混勻液100 μL垂直滴加至反應板的加樣孔中,待反應10 min后快速檢測sST2水平。sST2正常范圍為0～35 ng/mL。

1.3.4采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測外周血中淋巴細胞亞群以及NK細胞、B細胞比例 采集外周血標本并取100 μL加入流式管中,分別加入10 μL CD45/CD4/CD8/CD3以及CD45/CD56/CD19/CD3流式抗體,渦旋振蕩后常溫避光孵育15～20 min;反應時間結(jié)束后加入500 μL溶血素OptiLyse-C,渦旋振蕩充分混勻,常溫避光孵育10 min;加入100 μL生理鹽水,再次渦旋振蕩,常溫避光孵育10 min;將Flow-Count振蕩混勻10 s,取100 μL混勻液上機檢測。淋巴細胞正常范圍為20%～40%,B細胞正常范圍為5%～18%,NK細胞正常范圍為7%～40%。

1.3.5采用流式熒光法檢測血清炎癥因子水平 按照實驗要求設(shè)置好標準品管以及標本管。首先,標準品管中加入25 μL梯度稀釋的標準品,標本管中加入25 μL的待測樣品;其次,在所有管中加入25 μL的熒光檢測試劑,充分混勻后,室溫避光孵育2.5 h;隨后,在各反應孔中加入1 mL PBS溶液,200×g離心5 min后棄上清液;最后,各反應孔中加入100 μL PBS,上機檢測IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組HbA1c、Glu、Glu-1 h水平比較 T2DM組患者HbA1c、Glu以及Glu-1 h水平均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組HbA1c、Glu、Glu-1 h水平比較

2.2兩組血清sST2水平比較 T2DM組血清sST2水平為(17.08±1.32)ng/mL,明顯高于對照組的(11.50±0.77)ng/mL,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.07,P<0.05)。見圖1。

注:與對照組相比,*P<0.01。圖1 兩組血清sST2水平比較

2.3兩組血清炎癥因子水平比較 T2DM組血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2和圖2。

注:與對照組相比,*P<0.05; **P<0.01。圖2 兩組血清炎癥因子水平比較

表2 兩組血清炎癥因子水平比較

2.4兩組外周血淋巴細胞、NK細胞以及B細胞比例比較 T2DM組外周血淋巴細胞、NK細胞(CD45+CD3-CD19-CD56+)以及B細胞(CD45+CD3-CD56-CD19+)所占比例均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3和圖3。

表3 兩組外周血淋巴細胞、NK細胞以及B細胞比例比較

2.5T2DM患者血清sST2水平與NK細胞、B細胞比例的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,T2DM患者血清sST2水平與外周血B細胞比例(r=-0.40,P<0.01)、NK細胞比例(r=-0.29,P<0.05)呈負相關(guān);T2DM患者外周血B細胞比例與NK細胞比例呈正相關(guān)(r=0.34,P<0.05)。見圖4。

圖4 T2DM組患者sST2水平及NK細胞、B細胞比例的相關(guān)性分析

3 討 論

糖尿病是一種代謝性疾病,其特征是血液中葡萄糖濃度高,隨著時間的推移會導致各種組織、器官損傷,如心臟、肝臟或腎臟。雖然糖尿病的臨床定義較為明確,但該疾病的病因仍然不清楚。長期以來,人們將糖尿病分為兩種類型:自身免疫性糖尿病即1型糖尿病(T1DM)和非自身免疫性糖尿病即T2DM。盡管T2DM與肥胖和非酒精性脂肪性肝病等代謝紊亂有明確關(guān)聯(lián)[10],但一直缺乏具體的方法或指標來預測哪些個體將會發(fā)展成為T2DM。目前的流行病學數(shù)據(jù)表明,T2DM患者伴有心血管并發(fā)癥的總體風險即使在調(diào)整了傳統(tǒng)危險因素后仍然是非糖尿病患者的2～4倍[11]。近年來研究表明sST2水平的增加與心血管疾病密切相關(guān),它可以參與組織、器官促炎與促纖維化的發(fā)展進程[5],這是否提示在T2DM疾病進程中sST2發(fā)揮至關(guān)重要的作用尚不明確。大多數(shù)關(guān)于肥胖、T2DM以及慢性炎癥的研究都集中于先天性免疫上,例如:單核/巨噬細胞的功能轉(zhuǎn)化通過分泌大量的炎癥介質(zhì)如IL-1β、IL-6等參與T2DM患者的組織損傷[10];T2DM患者外周血中存在大量Tim3+NK細胞的功能障礙,進而導致對感染性疾病的易感性增加[12]。但適應性免疫反應在這種情況下也同樣發(fā)揮著病理學作用,例如:T2DM患者外周血B細胞通過產(chǎn)生IL-6和TNF-α 等促炎性細胞因子來調(diào)節(jié)炎癥反應,并促進促炎T淋巴細胞的功能[13-14]。

NK細胞是先天性免疫系統(tǒng)中的細胞毒性淋巴細胞,在機體抗腫瘤免疫反應和細胞內(nèi)病原體感染的早期控制中起關(guān)鍵作用[15]。NK細胞作為先天免疫的一部分,可對廣泛的危險信號做出反應,NK細胞的功能變化受到化學信使(包括細胞因子)的影響,激活后的NK細胞可以通過受體介導的相互作用和(或)釋放細胞毒性顆粒直接誘導靶細胞死亡[16]。NK細胞還可以通過釋放促炎性細胞因子如IFN-γ進一步增強固有免疫反應并啟動適應性免疫[17]。與T細胞、B細胞不同,NK細胞通過識別非自身細胞而表現(xiàn)出廣泛的腫瘤細胞毒性,在無須事先免疫的情況下自發(fā)地破壞靶細胞并且不受任何主要組織相容性復合體(MHC)的限制[17]。已有研究表明T2DM患者NK細胞功能障礙會增強其對腫瘤的易感性[18];也有報道稱T2DM患者外周血中的NK細胞與血糖控制密切相關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)在T2DM患者外周血中NK細胞比例明顯下調(diào),但同時伴隨有sST2水平增加,這可能提示sST2參與調(diào)控NK細胞的功能變化。

B細胞介導的免疫反應是保護性抗體和抗原提呈細胞的來源,也是抵御暴露于表面的外源性病原體的第一道防線。當自我耐受功能受損時,自身反應性B細胞產(chǎn)生自身抗體和促炎性細胞因子,導致自身免疫性疾病的發(fā)生。近期許多研究已經(jīng)評估了B細胞中代謝途徑的重要性,證明了它們在控制自身免疫和維持免疫穩(wěn)態(tài)中的作用[19]。已有研究表明,在糖尿病受試者中,B細胞適應性反應受損并且分泌較高水平的IL-6和TNF-α引起過度的炎癥反應[9]。本研究發(fā)現(xiàn),在T2DM患者外周血中B細胞比例下調(diào)且與NK細胞比例呈正相關(guān)。由此說明,B細胞與NK細胞協(xié)同參與T2DM進展,但具體影響機制尚不明確。

綜上所述,T2DM患者血清sST2水平上調(diào),NK細胞與B細胞比例減低,并且sST2水平與NK細胞、B細胞比例呈負相關(guān),而NK細胞比例與B細胞比例呈正相關(guān)。在接下來的研究中將進一步探討sST2在T2DM疾病進展中是否負向調(diào)控NK細胞與B細胞,以及NK細胞與B細胞在T2DM發(fā)展進程中的相互調(diào)控機制,為T2DM患者的治療提供新的思路。