段好震，馮媛媛，吳鳳霞，李童童， 王雅婻 ，王士強(qiáng)

（1.天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；2.上海交通大學(xué)海洋學(xué)院，上海 200030)

氮(N)和磷(P)是重要的生源要素，海水中硝酸鹽和磷酸鹽的濃度是決定浮游植物生物量和海洋初級生產(chǎn)力分布的主要環(huán)境因子，在某些海域二者可限制浮游植物生長[1]。氮、磷在維持浮游植物群落的生長速率、代謝速率和光合作用方面起著重要作用[2]。氮元素參與合成藻細(xì)胞葉綠素、核酸和蛋白質(zhì)，缺乏氮元素會減少細(xì)胞光合色素(如葉綠素、反應(yīng)中心色素、輔助色素等)的合成，限制光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心蛋白的合成[3]，進(jìn)而影響藻細(xì)胞對光能的吸收和轉(zhuǎn)換效率。氮限制會導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)參與碳同化反應(yīng)的Rubisco 酶含量的下降和酶活性的降低[4]，從而降低藻細(xì)胞的光合固碳能力，光合作用和細(xì)胞生長均受到抑制[5]。研究表明，在缺氮條件下培養(yǎng)海洋硅藻偽矮海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)、圓篩藻(Coscinodiscus sp.)與赫氏顆石藻(Emiliania huxleyi)，其葉綠素a 含量以及光系統(tǒng)Ⅱ的光化學(xué)效率均顯著降低[6]。磷元素是參與合成腺苷二磷酸、腺苷三磷酸等高能磷酸化合物的重要基本元素，是藻細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜磷脂、核酸和蛋白質(zhì)的重要組成部分，在細(xì)胞膜構(gòu)造、細(xì)胞代謝活動和信號傳輸方面都起著關(guān)鍵作用[7]。另外，磷元素也參與藻細(xì)胞的光合作用，磷限制不僅會影響藻細(xì)胞吸收光能、卡爾文循環(huán)等過程，而且對光合作用過程中一些關(guān)鍵性酶的活性也有重要影響[7]。東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)與中肋骨條藻(Skeletonema costatum)在低磷條件下葉綠素含量下降，光合效率也相應(yīng)降低[8]。同時(shí)，在缺磷條件下，藻細(xì)胞中大量的蛋白質(zhì)則會水解成氨基酸，參與堿性磷酸酶的合成[9]。營養(yǎng)鹽限制會導(dǎo)致浮游植物沉降速率的升高，如海鏈藻(Thalassiosira sp.)與中肋骨條藻在衰亡期(藻細(xì)胞大量死亡，數(shù)量減少)的沉降速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于指數(shù)生長期的沉降速率[10-11]。

近幾十年來，近岸水體富營養(yǎng)化成了重要的環(huán)境問題，它會引發(fā)有害藻華，損害海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康?！?000 年中國海洋環(huán)境質(zhì)量公報(bào)》指出，我國近岸海域普遍受到無機(jī)氮、磷酸鹽、油類以及重金屬的污染[12]，其中東海海域沿岸氮、磷含量分別為生長閾值的3 倍和2 倍[13]。富營養(yǎng)化引起的藻華也可導(dǎo)致大量有機(jī)物快速沉降到海底并被微生物分解，快速消耗氧氣而引起海水出現(xiàn)低氧問題[14]。在營養(yǎng)鹽濃度發(fā)生變化的同時(shí)，近海氮、磷營養(yǎng)鹽的比例在某些海域也發(fā)生了顯著變化，如近十年來渤海海域的溶解無機(jī)磷含量較低，溶解無機(jī)氮含量顯著升高[15]，偏離了傳統(tǒng)的化學(xué)計(jì)量學(xué)比值[16]。海水營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的變化也可對海洋浮游植物的生理過程產(chǎn)生影響，并改變浮游植物的胞內(nèi)元素組成[17]。不同種類的浮游植物生長及代謝過程對氮、磷營養(yǎng)鹽的需求也存在差異，因此氮磷比的變化可以改變浮游植物的種群結(jié)構(gòu)，影響海洋上層食物網(wǎng)[18]，對水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)力有一定的影響[19]。

硅藻貢獻(xiàn)了40%左右的海洋初級生產(chǎn)力，占全球初級生產(chǎn)力的20%，是海洋生物碳泵的主要組成部分[20-22]。在近岸海域，硅藻作為海洋浮游生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢種群，是多種食物網(wǎng)的基礎(chǔ)，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的能量流動與物質(zhì)循環(huán)中起著重要作用[23-24]。由于近年來人類活動導(dǎo)致氮、磷元素失衡，浮游植物受營養(yǎng)鹽限制加劇，所以研究不同營養(yǎng)鹽條件對優(yōu)勢硅藻沉降速率及其生理狀態(tài)的影響顯得尤為重要，此類研究有利于進(jìn)一步了解碳輸出及缺氧區(qū)形成的過程。為了研究氮、磷營養(yǎng)鹽比例變化對近海硅藻的生理效應(yīng)及其對硅藻相關(guān)碳匯的影響，本研究分別采用半連續(xù)培養(yǎng)和一次性培養(yǎng)的方式，對近岸優(yōu)勢硅藻海鏈藻在不同氮磷比及氮、磷營養(yǎng)鹽濃度的條件下進(jìn)行模擬培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，并分析其在不同氮磷比、不同生長階段的生理生化指標(biāo)及沉降速率，以期為進(jìn)一步認(rèn)知近岸水體富營養(yǎng)化背景下營養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)變化的生態(tài)效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種選擇及保種培養(yǎng)條件

本研究選取硅藻優(yōu)勢物種中心綱海鏈藻(Thalassiosira sp.)作為研究對象，藻種保存于天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院海洋生物地球化學(xué)實(shí)驗(yàn)室藻種庫的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)。恒溫光照培養(yǎng)箱保種條件為：溫度15 ℃、光照強(qiáng)度150～180μmol/(m2·s)、光暗周期比為12 h/12 h，磷酸鹽、硝酸鹽、硅酸鹽、微量營養(yǎng)元素和維生素按照f/2 培養(yǎng)基[25]中的用量進(jìn)行添加。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置的環(huán)境因子為磷酸鹽濃度和硝酸鹽濃度。溫度設(shè)置為20 ℃，光照強(qiáng)度設(shè)置為100μmol/(m2·s)，光暗周期比為12 h/12 h。磷酸鹽實(shí)驗(yàn)共設(shè)置0.6、0.8、3、6、16μmol/L 5 個處理組(對應(yīng)氮磷比依次為146.6∶1、110∶1、29.3∶1、14.7∶1、5.5∶1)。硝酸鹽實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5、10、20、48、96μmol/L 5 個處理組(對應(yīng)氮磷比依次為1.6∶1、3.1∶1、6.3∶1、15∶1、30∶1)。除控制變量之外的其他元素均按照f/20 培養(yǎng)基中的用量[24]添加，每個處理組設(shè)置3個平行樣。在實(shí)驗(yàn)中采用人工海水[26]配制培養(yǎng)基，使培養(yǎng)體系中營養(yǎng)鹽濃度準(zhǔn)確。最后，取指數(shù)生長期的藻種接種至500 mL Nalgene 培養(yǎng)瓶中，初始細(xì)胞豐度1.0×104mL-1，在由加熱棒及HC-1000BH 型冷暖水機(jī)(中國海利)控溫的20 ℃恒溫水槽中進(jìn)行培養(yǎng)。

半連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，為使藻細(xì)胞豐度與培養(yǎng)體系中營養(yǎng)鹽濃度保持相對恒定，每天用新配制的培養(yǎng)基稀釋藻液。每天取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以監(jiān)測藻細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)至其生長速率達(dá)到穩(wěn)態(tài)(生長速率變化小于10%的時(shí)間超過5 d)[27]后進(jìn)行最終收樣，收樣參數(shù)為葉綠素a(Chl-a)質(zhì)量濃度、生物硅(BSi)濃度、顆粒有機(jī)磷(POP)濃度、顆粒有機(jī)碳(POC)含量、顆粒有機(jī)氮(PON)含量、細(xì)胞沉降速率、蛋白質(zhì)含量及碳水化合物含量。

半連續(xù)培養(yǎng)結(jié)束后，將采樣剩余藻種按初始細(xì)胞豐度1×104mL-1轉(zhuǎn)移至500 mL Nalgene 培養(yǎng)瓶中進(jìn)行不同營養(yǎng)鹽梯度的一次性培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。每天進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，隔天取樣測定細(xì)胞沉降速率。

1.3 樣品分析

1.3.1 藻細(xì)胞計(jì)數(shù)和葉綠素a 濃度的測定

取1 mL 培養(yǎng)藻液置于1.5 mL 的離心管中，添加6 μL 魯格氏(Lugol’s)試劑進(jìn)行固定，避光保存在4℃冰柜中，用0.1 mL 微藻計(jì)數(shù)框在CH20BIMF200 型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)下進(jìn)行計(jì)數(shù)。另取2 mL藻液，暗處理20 min 后用Turner 熒光儀(美國Trilogy)測定其活體熒光值。通過式(1)計(jì)算生長速率。

式中：μ 為生長速率，d-1；N2和N1分別指t2(收樣當(dāng)天)和t1(收樣前一天)時(shí)的活體熒光值。

用隔膜真空泵將一定體積的樣品在較低壓強(qiáng)下(＜0.04 MPa)過濾至GF/F 膜(美國Whatman)上，加入5 mL 體積分?jǐn)?shù)90%的丙酮水溶液，在-20 ℃環(huán)境中避光萃取24 h，以體積分?jǐn)?shù)90%的丙酮水溶液作為空白，用Turner 熒光儀(美國Trilogy)進(jìn)行測定，根據(jù)過濾體積計(jì)算Chl-a 的最終質(zhì)量濃度(μg/L)。

1.3.2 元素組成分析

顆粒有機(jī)磷(POP)含量的測定采用鉬酸鹽測定法[28]。用隔膜真空泵將一定量的樣品過濾到經(jīng)馬弗爐灼燒(450 ℃，4 h)后的GF/F 膜(美國Whatman)上，再以相同體積海水培養(yǎng)基作為空白樣。用2 mL 0.17 mol/L Na2SO4溶液對含有樣品的濾膜進(jìn)行淋洗并抽濾。將濾膜轉(zhuǎn)移至20 mL 已經(jīng)灼燒過的樣品瓶中，加入2 mL 0.017 mol/L MgSO4溶液，蓋上鋁箔紙，置于60 ℃烘箱中烘干。分析前，將樣品置于450℃馬弗爐中灼燒2 h，冷卻后加入5 mL 0.2 mol/L 的HCl 溶液，然后置于90 ℃烘箱中干燥30 min，冷卻至室溫后加入0.5 mL 顯色劑混合均勻，等待10～20 min，用UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)在885 nm 波長處測定樣品的吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及過濾體積計(jì)算POP 濃度(μmol/L)。

生物硅(BSi)使用Brzezinski 等[29]的顯色法進(jìn)行樣品分析。將一定體積藻液過濾至孔徑為0.6μm 的聚碳酸酯濾膜(美國Millipore)上，在60 ℃烘箱中烘干后室溫保存。

將一定體積藻液過濾至經(jīng)馬弗爐灼燒(450 ℃，4 h)過的GF/F 膜(美國Whatman)上，裝入灼燒過的鋁箔紙袋，經(jīng)60 ℃的烘箱烘干后，采用ECS4010 型CHN 元素分析儀(意大利Costech)測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及過濾體積計(jì)算顆粒有機(jī)碳(POC)[30]及顆粒有機(jī)氮(PON)含量(μmol/L)。

1.3.3 蛋白質(zhì)和碳水化合物含量的測定

蛋白質(zhì)含量的測定：將一定體積藻液過濾到0.6μm 聚碳酸酯濾膜(美國Millipore)上，保存在-80℃冰箱中。將樣品溶解在Milli-Q 水中，再將1 mL 藻液與4 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液充分混合，放置5 min，用UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)在595 nm 波長處測定樣品吸光度，并以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及過濾體積計(jì)算蛋白質(zhì)含量(μg/mL)。

碳水化合物含量的測定：將一定體積藻液過濾至0.6μm 聚碳酸酯濾膜(美國Millipore)上，加入5 mL 0.05 mol/L H2SO4溶液，60 ℃水浴加熱30 min；冷卻后向裝有2 mL 藻液的20 mL 玻璃瓶中加0.05 mL 80%苯酚水溶液，再迅速加入5 mL 濃硫酸，靜置30 min 進(jìn)行顯色(顯色效果不好可延長時(shí)間)，顏色穩(wěn)定后用UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)在485 nm 波長處測定樣品吸光度，并以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[31]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及過濾體積計(jì)算碳水化合物含量(μg/mL)。

1.3.4 沉降速率

浮游植物沉降速率的測定采用SETCOL 沉降柱測量法[32]。將高33 cm、體積420 mL 的沉降柱垂直固定于支架上，夾住3 個出水口，把均勻混合的藻液倒入密封良好的沉降柱中，恒溫下避光靜置3 h，按順序從上、中、下層取樣，測定Chl-a 濃度，最后根據(jù)式(2)計(jì)算沉降速率。

式中：ψ為沉降速率，m/d；Bs為沉降柱下層生物量，μg/L；Bt為沉降柱總生物量，μg/L；l 為沉降柱高度，cm；t 為沉降時(shí)間，h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本文數(shù)據(jù)均采用Graphpad prism 作圖軟件進(jìn)行分析，對每個處理組的3 個平行樣進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，通過米氏方程對生長速率進(jìn)行擬合，采用單因子方差分析(one-way ANOVA)與t 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長速率

海鏈藻在不同磷酸鹽(控制硝酸鹽濃度為88μmol/L)和不同硝酸鹽(控制磷酸鹽濃度為3.2μmol/L)濃度下的生長速率結(jié)果如圖1 所示，圖中紅線是通過米氏方程擬合得到的。

圖1 海鏈藻在不同磷酸鹽和硝酸鹽濃度下的生長速率Fig.1 Growth rates of Thalassiosira sp.under different phosphate and nitrate concentrations

兩組實(shí)驗(yàn)中海鏈藻生長速率隨兩組營養(yǎng)鹽的濃度變化呈現(xiàn)相似的趨勢，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著營養(yǎng)鹽濃度升高，海鏈藻生長速率呈逐漸升高的趨勢，分別在磷酸鹽濃度為 6μmol/L、硝酸鹽濃度為48μmol/L 條件下趨近飽和。磷酸鹽和硝酸鹽半飽和常數(shù)(Km)分別為0.26μmol/L 和15.12μmol/L。兩個實(shí)驗(yàn)中海鏈藻的最大生長速率分別為 1.05 d-1和1.02 d-1，無顯著差異。

2.2 葉綠素a與生物大分子含量

海鏈藻在不同磷酸鹽濃度下和不同硝酸鹽濃度下的胞內(nèi)葉綠素a、碳水化合物和蛋白質(zhì)含量如圖2所示。

圖2 海鏈藻在不同磷酸鹽濃度和不同硝酸鹽濃度下的胞內(nèi)葉綠素a、碳水化合物和蛋白質(zhì)含量Fig.2 Cellular Chl-a，carbohydrate and protein contents of Thalassiosira sp.under different phosphate and nitrateconcentrations

隨著磷酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)葉綠素含量逐漸升高，兩者基本呈線性關(guān)系，胞內(nèi)葉綠素含量在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最低，在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最高。隨著硝酸鹽濃度升高，海鏈藻胞內(nèi)葉綠素含量先升高后略有降低，且胞內(nèi)葉綠素含量于硝酸鹽濃度為48μmol/L 時(shí)最高，在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最低。

隨著磷酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)碳水化合物含量逐漸降低，且在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最高，在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最低，前者的胞內(nèi)碳水化合物含量較后者增加了154.6%。隨著硝酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)碳水化合物含量逐漸降低，且在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)含量最高，在硝酸鹽濃度為96μmol/L 時(shí)最低，前者的胞內(nèi)碳水化合物含量較后者增加了81.77%。

隨著磷酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量逐漸升高，且在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最低，在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最高，后者的胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量較前者增加了123.5%。隨著硝酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量逐漸升高，且在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最低，在硝酸鹽濃度為96μmol/L 時(shí)高，后者的胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量較前者增加了近2 倍。

2.3 細(xì)胞元素含量

海鏈藻在不同磷酸鹽濃度和不同硝酸鹽濃度下的胞內(nèi)BSi、POP、POC、PON 含量如圖3 所示。

圖3 海鏈藻在不同磷酸鹽濃度下和不同硝酸鹽濃度下的胞內(nèi)BSi、POP、POC、PON含量Fig.3 Cellular BSi，POP，POC and PON contents of Thalassiosira sp.under different phosphate and nitrate concentrations

隨著磷酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)生物硅含量逐漸降低，且在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最高，在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最低，前者較后者增加了50.79%。隨著硝酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)生物硅含量先降低后略有升高，在硝酸鹽濃度為5μmol/L時(shí)含量最高，在硝酸鹽濃度為48μmol/L 時(shí)最低。隨著磷酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)磷含量逐漸升高，且在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最低，在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最高，后者較前者增加了74.14%。隨著硝酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)磷含量總體上呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，且在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最高，在硝酸鹽濃度為96μmol/L 時(shí)最低，前者較后者增加了104.24%。

隨著磷酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)碳含量先降低后略有升高，且在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L時(shí)最高，在磷酸鹽濃度為6μmol/L 時(shí)最低，前者較后者增加了44.86%。隨著硝酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)碳含量大致呈上升趨勢，且在硝酸鹽濃度為96μmol/L時(shí)最高，在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最低。

隨著磷酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)氮含量逐漸降低，且在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最高，在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最低，前者較后者增加了170.92%。隨著硝酸鹽濃度的升高，海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)氮含量呈逐漸上升趨勢，且在硝酸鹽濃度為96μmol/L 時(shí)最高，在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最低，前者較后者增加了198.89%。

2.4 胞內(nèi)元素比

海鏈藻在不同磷酸鹽濃度和不同硝酸鹽濃度下的胞內(nèi)元素比如圖4 所示。

圖4 海鏈藻在不同磷酸鹽濃度下和不同硝酸鹽濃度下的胞內(nèi)元素比Fig.4 Cellular element ratio of Thalassiosira sp.under different phosphate and nitrate concentrations

不同營養(yǎng)鹽條件對海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)碳與顆粒有機(jī)氮的物質(zhì)的量之比〔n(C)/n(N)〕有顯著影響(P＜0.05)。在磷酸鹽實(shí)驗(yàn)中，n(C)/n(N)隨著磷酸鹽濃度的升高而升高，且在磷酸鹽濃度為16μmol/L時(shí)最高(6.58±0.75)，在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最低(3.28±0.37)，前者比后者高100.61%。在硝酸鹽實(shí)驗(yàn)中，n(C)/n(N)隨著硝酸鹽濃度的升高大致呈現(xiàn)降低趨勢，且在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最高(12.12±4.23)，在硝酸鹽濃度為48μmol/L 時(shí)最低(6.37±0.48)，前者比后者高90.27%。

不同營養(yǎng)鹽條件對海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)碳與顆粒有機(jī)磷的物質(zhì)的量之比〔n(C)/n(P)〕的影響不同(P＜0.05)。在磷酸鹽實(shí)驗(yàn)中，n(C)/n(P)隨著磷酸鹽濃度的升高而降低，且在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最高(105.42±4.07)，在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最低(46.11±6.34)，前者比后者高128.63%。在硝酸鹽實(shí)驗(yàn)中，n(C)/n(P)隨著硝酸鹽濃度的升高呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，且在硝酸鹽濃度為96μmol/L 時(shí)最高(98.26±5.94)，在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最低(29.08±8.55)，前者比后者高237.90%。

不同營養(yǎng)鹽條件對海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)氮與顆粒有機(jī)磷的物質(zhì)的量之比〔n(N)/n(P)〕的影響不同(P＜0.05)。在磷酸鹽實(shí)驗(yàn)中，n(N)/n(P)隨著磷酸鹽濃度的升高而降低，且在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最高(32.52±5.01)，在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最低(7.08±1.35)，前者比后者高359.32%。在硝酸鹽實(shí)驗(yàn)中，n(N)/n(P)隨著硝酸鹽濃度的升高而升高，且在硝酸鹽濃度為96μmol/L 時(shí)最高(14.97±1.71)，在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最低(2.43±0.20)，前者比后者高516.05%。

不同營養(yǎng)鹽條件對海鏈藻胞內(nèi)顆粒有機(jī)碳與生物硅的物質(zhì)的量之比〔n(C)/n(Si)〕的影響不同(P＜0.05)。在磷酸鹽實(shí)驗(yàn)中，n(C)/n(Si)隨著磷酸鹽濃度的升高大致呈升高趨勢，且在磷酸鹽濃度為16μmol/L 時(shí)最高(7.49±1.32)，在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)最低(6.65±0.38)，前者比后者高12.63%。在硝酸鹽實(shí)驗(yàn)中，n(C)/n(Si)隨著硝酸鹽濃度的升高而升高，且在硝酸鹽濃度為96μmol/L 時(shí)最高(10.37±0.72)，在硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí)最低(3.10±0.90)，前者比后者高234.52%。

2.5 沉降速率

海鏈藻在不同磷酸鹽濃度和不同硝酸鹽濃度下的半連續(xù)培養(yǎng)沉降速率、一次性培養(yǎng)細(xì)胞豐度和一次性培養(yǎng)沉降速率分別如圖5、圖6 所示。

圖5 海鏈藻在不同磷酸鹽濃度下的半連續(xù)培養(yǎng)沉降速率、一次性培養(yǎng)細(xì)胞豐度和一次性培養(yǎng)沉降速率Fig.5 Sinking rates in the semi-continuous incubation，cell abundances in the batch culture and sinking rates in the batch culture of Thalassiosira sp.under different phosphate concentrations

圖6 海鏈藻在不同硝酸鹽濃度下的半連續(xù)培養(yǎng)沉降速率、一次性培養(yǎng)細(xì)胞豐度和一次性培養(yǎng)沉降速率Fig.6 Sinking rates in the semi-continuous incubation，cell abundances in the batch culture and sinking rates in the batch culture of Thalassiosira sp.under different nitrate concentrations

隨兩種營養(yǎng)鹽濃度的升高，海鏈藻的沉降速率均呈現(xiàn)降低的趨勢，分別于磷酸鹽濃度為0.6μmol/L〔(0.69±0.03)m/d〕和硝酸鹽濃度為 5μmol/L〔(0.77±0.02)m/d〕時(shí)最高。磷酸鹽實(shí)驗(yàn)中，磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 時(shí)的沉降速率較16μmol/L 時(shí)升高82.92%(P＜0.05)；硝酸鹽實(shí)驗(yàn)中，硝酸鹽濃度為5μmol/L 時(shí) 的 沉 降 速 率 較 96μmol/L 時(shí) 升 高157.30%(P＜0.05)。

在為期4 d 的一次性培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，海鏈藻在指數(shù)生長期的沉降速率總體小于0.9 m/d，在磷酸鹽濃度為0.6μmol/L 的條件下，第2 天細(xì)胞豐度顯著衰退，在0.8μmol/L、3μmol/L 條件下，于第3 天到達(dá)衰退期，而在6μmol/L、16μmol/L 下，衰退期始于第4天。海鏈藻在硝酸鹽濃度為5μmol/L、10μmol/L 的條件下，于第3 天到達(dá)衰退期，在硝酸鹽濃度為48μmol/L、96μmol/L 的條件下，于第4 天開始衰退。

指數(shù)生長期(第1 天)的沉降速率最低，隨著細(xì)胞生長逐步到達(dá)衰退期，沉降速率隨之顯著升高，而在營養(yǎng)鹽本底值最低條件下達(dá)到最高，平臺期沉降速率約是指數(shù)生長期的1.2 倍，衰退期沉降速率約是指數(shù)生長期的2 倍。

3 討 論

在氮、磷營養(yǎng)鹽限制的條件下，海鏈藻胞內(nèi)葉綠素a、蛋白質(zhì)含量受到了顯著影響，其主要原因是營養(yǎng)鹽缺乏限制了它們的合成[8]。但與硝酸鹽限制相比，本實(shí)驗(yàn)中低磷酸鹽濃度對海鏈藻生長速率的削弱程度低于硝酸鹽限制。氮和磷是植物的必需營養(yǎng)元素，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和代謝，并且在細(xì)胞的整個生命周期中都扮演著非常重要的角色。已有研究表明，氮、磷等營養(yǎng)元素在浮游植物的生物膜形成和核酸組成等方面至關(guān)重要[33]。在本實(shí)驗(yàn)中，低磷抑制POP 的合成，低氮反而促進(jìn)POP 的合成。低氮和低磷都顯著促進(jìn)碳水化合物的合成，減少蛋白質(zhì)的合成，可能是生長速率較低條件能推動碳水化合物的合成，而某些蛋白質(zhì)合成受到抑制[3,34]。低磷和低氮條件都增加沉降速率，低氮對其影響更加顯著，這是由于低氮條件比低磷條件胞內(nèi)生物硅含量更多，而蛋白質(zhì)含量則相反。

人類活動加速了全球變化，在過去的幾十年間，人類活動除了造成大氣中二氧化碳濃度快速升高之外，向生物圈釋放出的活性氮遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于磷的輸入，從而顯著改變了地表的氮磷比[33]，受陸源徑流輸入變化和海洋生物分解轉(zhuǎn)化的影響，近海海域磷限制成為一種常見現(xiàn)象[35]。氮磷比失衡會改變浮游植物的元素組成，影響其自身蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的含量[36-37]，最終影響其生長。不同種類浮游植物利用氮和磷的方式不同，氮磷比失衡可能會改變一些浮游植物的優(yōu)勢地位，進(jìn)而影響整個群落結(jié)構(gòu)[38]。氮磷比失衡還會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，引發(fā)水華等問題。

在本研究中，營養(yǎng)鹽限制顯著提升沉降速率。浮游植物光合作用產(chǎn)生的有機(jī)碳通過食物鏈和食物網(wǎng)在上層水體中循環(huán)，死亡后以有機(jī)物碎屑方式沉降至海底[39-40]，浮游植物在全球海洋碳循環(huán)中具有重要作用。浮游植物直接沉降是海洋有機(jī)碳沉降過程的中心環(huán)節(jié)[41]，研究浮游植物碳沉降過程對理解該海域生物地球化學(xué)循環(huán)效率、低氧區(qū)形成等生態(tài)環(huán)境問題具有重要意義，比如對群落而言，缺氧雖然提高了沿海浮游植物的初級生產(chǎn)力[42]，但是藻種向潛在有害類群轉(zhuǎn)移[43]。對個體而言，有學(xué)者研究結(jié)果表明缺氧增加了威氏海鏈藻的光合作用能力和生長速率[42]，但是也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)缺氧顯著抑制中肋骨條藻生長并對其生理活動產(chǎn)生負(fù)面影響[44]。浮游植物通過光合作用固定有機(jī)碳，通過沉降速率影響碳循環(huán)[45]。浮游植物通過光合作用產(chǎn)生顆粒有機(jī)碳，再通過各種食物網(wǎng)，最終死亡的生物體或有機(jī)碎屑在重力作用下沉降，一般稱為生物泵過程。浮游植物沉降作為海洋生物泵的重要組成部分，在海洋碳循環(huán)中占有重要地位。上層的碳輸入到底層，有利于碳的埋藏(碳匯)。本文研究表明，高氮磷比和低氮磷比均會顯著增加海鏈藻的沉降速率；海鏈藻不同生長階段的沉降速率不同，在指數(shù)生長期最小，在衰退期達(dá)到最大，營養(yǎng)鹽本底值最低處理組沉降速率最大，這可能是由于藻細(xì)胞中脂質(zhì)[46]含量隨生長周期變化影響藻細(xì)胞密度，最終影響浮游植物的沉降速率。在藻細(xì)胞衰退階段，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物等有機(jī)物逐漸分解，形成膠體，膠體吸附附近分子后質(zhì)量增加；此外，細(xì)胞內(nèi)氣體不斷釋放，減小浮力，增加藻細(xì)胞沉降速率。穩(wěn)態(tài)水體(或者水華開始形成時(shí))生態(tài)系統(tǒng)處于相對平衡狀態(tài)，而水華衰退期則以特定物種為主導(dǎo)，物種多樣性大幅降低，生態(tài)平衡被打破[47]。因此，研究藻華衰退期和穩(wěn)態(tài)水體在群落組成、營養(yǎng)鹽含量等方面的差異[48]，對維持水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有重要生態(tài)學(xué)意義。

氮磷比對沉降速率產(chǎn)生影響。在本文的研究中，低硝酸鹽濃度對沉降速率的影響比低磷酸鹽濃度的大，低氮磷比對沉降速率影響大。在低氮磷比條件下，POP、BSi 含量明顯升高，生長速率、蛋白質(zhì)含量相對較低。生長速率低的條件下細(xì)胞體積會增大，胞內(nèi)碳水化合物增多，也會增大沉降速率。Rhee[49]的研究表明，藻細(xì)胞PON 含量在氮限制條件下略有降低，POP 貯存含量明顯升高；藻細(xì)胞POP 含量在磷限制條件下無顯著變化，而PON 含量略有增加[50]。在本研究和大多數(shù)前期研究中，氮缺乏會導(dǎo)致高碳氮比，而磷缺乏會導(dǎo)致高碳磷比和氮磷比[51-52]，n(PON)/n(POP)與氮磷比呈正相關(guān)。李鐵等[53]在對中肋骨條藻和新月菱形藻的營養(yǎng)限制研究中得出與之相似的結(jié)論，本文兩個實(shí)驗(yàn)的藻細(xì)胞內(nèi)POP 和PON 含量變化與前人研究結(jié)果相似。

沉降速率的變化會通過改變碳循環(huán)時(shí)間影響海洋碳循環(huán)，影響氮、磷、硅等營養(yǎng)要素的沉降和循環(huán)(如過高會導(dǎo)致營養(yǎng)鹽損失，影響和改變海洋中營養(yǎng)鹽的循環(huán)與分布以及浮游植物的生長)，進(jìn)而影響生物多樣性和食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)的發(fā)展[54]。

4 結(jié) 語

營養(yǎng)鹽限制影響胞內(nèi)生物硅、碳水化合物、蛋白質(zhì)等元素及物質(zhì)組成變化，相比于磷限制，氮限制對沉降速率的影響更強(qiáng)烈，在低磷酸鹽濃度、低硝酸鹽濃度下沉降速率最高，在氮磷比為1.6 時(shí)沉降速率最高。對比發(fā)現(xiàn)，在指數(shù)生長期和衰退期，由于藻細(xì)胞生理?xiàng)l件變化，所以內(nèi)部物質(zhì)也發(fā)生變化，如蛋白質(zhì)、碳水化合物分解釋放形成膠體，吸附周圍顆粒增加自身質(zhì)量和內(nèi)部氣泡釋放減小浮力，導(dǎo)致藻細(xì)胞在衰退期沉降速率大幅升高。

盡管本研究初步發(fā)現(xiàn)了海鏈藻對磷酸鹽濃度和硝酸鹽濃度變化的響應(yīng)差異，但是在本研究中并未結(jié)合現(xiàn)場觀測實(shí)驗(yàn)。因此，未來的研究還需多結(jié)合一些現(xiàn)場觀測實(shí)驗(yàn)。此外，未來的研究還需探討不同浮游植物種群、氮磷比對不同浮游植物及其種群結(jié)構(gòu)變化等，進(jìn)一步全面分析對碳沉降的影響以及對生物地球化學(xué)循環(huán)的影響。