鄭倩雯 楊雁靈 王亞云

（1）空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科，西安 710032；2）空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，教學(xué)實驗中心，神經(jīng)系統(tǒng)疾病線粒體機制研究實驗室，西安 710032）

線粒體（mitochondria）是絕大多數(shù)細(xì)胞的生物能量合成裝置，通過氧化磷酸化（oxidative phosphorylation， OXPHOS） 產(chǎn) 生 三 磷 酸 腺 苷（adenosin triplosphate，ATP）為細(xì)胞供能。同時，線粒體還在脂肪酸生物合成、細(xì)胞鈣的緩沖、活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生及氧化應(yīng)激（oxidative stress）中發(fā)揮重要作用［1-2］。既往研究表明，線粒體形態(tài)或功能異常參與多種臨床疾病，包括心血管系統(tǒng)疾?。ㄐ募》蚀蟆⒐跔顒用}粥樣硬化、心肌梗死等）［3-4］、代謝疾?。ㄌ悄虿　⒎逝值龋?-7］、惡性腫瘤（肝癌、肺癌、腸癌等）［8-10］和泌尿系統(tǒng)疾?。I衰、腎炎）［11］等。其中，線粒體異常對神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷格外令人關(guān)注，究其原因在于腦對線粒體的高度依賴性。

腦是體內(nèi)耗氧量最大器官，其基本生物學(xué)功能包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放及突觸可塑性等，而以上活動均需依賴大量ATP 分子［12］。研究表明，人的單個皮層神經(jīng)元每秒耗能多達(dá)47億個ATP分子［13］，興奮性（谷氨酸能）神經(jīng)元消耗大腦80%～85%的ATP，而抑制性神經(jīng)元和其他細(xì)胞消耗其余15%～17%的ATP［14］。在神經(jīng)元的突觸前和突觸后結(jié)構(gòu)、軸突起始段、郎飛結(jié)節(jié)點以及生長錐等高耗能區(qū)，其對ATP的實時足量供應(yīng)提出了更加苛刻的要求。與此同時，在ATP 產(chǎn)生方面，神經(jīng)元具有與其他體細(xì)胞截然不同的特點，即其所需93%ATP分子來源于線粒體有氧呼吸的三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle），也稱檸檬酸循環(huán)（citric acid cycle）或Krebs 循環(huán)，僅有7%ATP 分子來源于不依賴線粒體的胞質(zhì)有氧糖酵解過程（aerobic glycolysis）。不僅如此，線粒體還通過調(diào)控鈣離子穩(wěn)態(tài)、參與細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)氧化應(yīng)激等機制，發(fā)揮調(diào)控神經(jīng)元突觸可塑性的重要作用。由此可見，線粒體的穩(wěn)定性已成為神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要基礎(chǔ)，而線粒體的形態(tài)或功能異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)傳遞異常，最終引起多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病［15-16］。大量研究表明，帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、亨 廷 頓 氏 ?。℉untington’s disease，HD）、中風(fēng)（stroke）和創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBⅠ）［17-19］等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展均與線粒體結(jié)構(gòu)與功能障礙密切相關(guān)，通過恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)以糾正神經(jīng)系統(tǒng)功能異常已成為前沿研究及臨床治療的熱點問題。

1 靶向線粒體治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的5種主要策略

目前，靶向線粒體治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的策略主要涉及以下5個方面（表1）：a.基于線粒體氧化應(yīng)激致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機制，使用對抗線粒體氧化應(yīng)激或增強抗氧化應(yīng)激的藥物［20-24］，如MitoQ和十二烷酸（decanonic acid）等，用于治療AD 和肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）；b.基于線粒體過分裂增多致線粒體損傷進(jìn)而引起神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡的機制，使用抑制線粒體分裂或融合的藥物［25-26］，如Mdivi-1 等，用于治療AD 和PD；c.基于線粒體產(chǎn)生不足導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷而使用增加線粒體產(chǎn)生的藥物［27-28］，如三環(huán)吡酮和線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)拮抗劑1（dynamin-related protein antagonist 1）等，治療AD 和HD；d.使用線粒體保護(hù)分子［29-33］，如致酮分子（ketogenic molecules）BHB （d-β-hydroxybutyrate） 直接治療AD、PD、ALS； e.使 用 胰 島 素 增 敏 劑 （insulin sensitizers）［34-35］二甲雙胍（metformin）促進(jìn)線粒體功能恢復(fù)以及促進(jìn)腦能量生成，從而治療AD和HD。

Table 1 Five strategies of mitochondria-targeted treatment for neurological diseases表1 靶向線粒體治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的5種主要策略

2 線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展

與此同時， 線粒體移植（mitochondrial transplantation）通過補充健康線粒體修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)被認(rèn)為在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有巨大潛能，受到越來越大的關(guān)注。線粒體移植是將外源性健康線粒體以直接或間接方式移植進(jìn)入受損機體，通過改善神經(jīng)系統(tǒng)呼吸功能進(jìn)而修補受損神經(jīng)系統(tǒng)，最終達(dá)到改善和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的目的。線粒體移植最早并非用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病。1982 年，Clark 和Shay［36］首次嘗試從對兩種抗生素（氯霉素和埃夫拉肽素）具有抗藥性的細(xì)胞中純化線粒體，然后將其與對此兩種抗生素不具有抗藥性的細(xì)胞共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體細(xì)胞獲得了對以上兩種抗生素的耐藥性，由此開啟了利用線粒體移植治療各類疾病的新篇章。迄今為止，關(guān)于線粒體移植治療臨床疾病的最具震撼性研究是2017 年，美國波士頓兒童醫(yī)院首次對5 名依賴體外膜氧合支持（extracorporeal membrane oxygenation support，ECMO 支持）的嚴(yán)重心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion injury）患兒，將其自體腹直肌分離提純線粒體進(jìn)行心臟直接注射［37］，術(shù)后2名患兒先后死亡，但是3名患兒成功脫離ECMO并生存良好。

本文系統(tǒng)回顧了PUBMED 上正式報道的線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的所有研究，共搜索到26篇密切相關(guān)參考文獻(xiàn)（圖1）。

Fig.1 Major research reports and history of mitochondrial transplantation in the treatment of neurological disorders圖1 線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要研究報道及歷程

根據(jù)在體與體外兩種水平將以上線粒體移植研究分為兩大類型。

2.1 線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的在體研究

2.1.1 線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的類型

目前報道線粒體在體移植能夠有效治療的神經(jīng)系統(tǒng)模型包括11 種（表2）：大腦中動脈閉塞腦缺血再灌注模型［38-42］、局灶性腦缺血模型［43］、創(chuàng)傷性腦損傷模型［44-45］、精神分裂癥模型［46-47］、抑郁癥模型［48］、糖尿病認(rèn)知功能障礙模型［49］、PD 模型［50］、老年小鼠［51-53］、膿毒癥模型［54］、神經(jīng)擠壓模型［55-56］及脊髓損傷模型［57-59］。由此可見，線粒體移植報道最多的領(lǐng)域是缺血及損傷類動物模型?？紤]推測當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生缺血或損傷時，動物局部應(yīng)對危機的大量系統(tǒng)開始啟動應(yīng)激以展開自我保護(hù)程序，此時原有的線粒體數(shù)量已經(jīng)不能滿足腦和脊髓迅速增加的緊急需求，因此出現(xiàn)線粒體能量合成不足、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、神經(jīng)元突觸可塑性受損，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)無法有效糾正能量危機，最終引起神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)全面中斷。此時早期給予外源性線粒體補充，能夠快速有效糾正線粒體數(shù)量不足與功能缺陷，特別對能量合成、鈣穩(wěn)態(tài)，以及突觸可塑性具有重要的改善作用，最終通過挽救神經(jīng)系統(tǒng)的能量危機，使神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)重要功能。

Table 2 Research of mitochondrial transplantation in the treatment of neurological diseases in vivo表2 線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的在體研究

文獻(xiàn)還可見線粒體移植能夠治療精神類疾病或者認(rèn)知障礙類疾病動物模型?？紤]到這些模型的制備也是用化學(xué)藥物所誘導(dǎo)的情況，因此推測，線粒體移植治療這類疾病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)也同樣在于原有線粒體數(shù)量不能滿足中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后大規(guī)模增加的能量需求，此時給予外源性線粒體能夠解決該主要矛盾，從而產(chǎn)生有效結(jié)果。

目前尚未見線粒體移植治療AD、HD 的研究報道，這與這兩類疾病已經(jīng)有明確線粒體參與機制的現(xiàn)狀相矛盾。這一方面可能在于線粒體移植研究僅在有限的實驗室開展實施，另一方面可能在于目前使用的AD 和HD 小鼠模型多為轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)能量危機可能出現(xiàn)于最早期，之后由于無有效緩解途徑從而發(fā)生了更為復(fù)雜的次級災(zāi)害。也就意味著，如果能夠在早期利用線粒體移植可能還有挽救神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機會，而到疾病成熟階段再單純使用補充線粒體的辦法可能已經(jīng)無法糾正神經(jīng)系統(tǒng)廣泛的功能異常。令人遺憾的是，目前尚無法獲得線粒體移植的時間窗口，因此，推測未來在該領(lǐng)域的嘗試也將非常艱難。

2.1.2 線粒體移植的方式

根據(jù)移植線粒體的來源可將以上研究中采用的線粒體移植方式分為直接移植和間接移植兩種。直接移植是指移植的是線粒體本身，間接移植是指移植攜帶線粒體的其他載體。用于直接移植的線粒體來源包括3種，分別是各細(xì)胞系、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及同種異體組織。其中，組織來源線粒體取自于骨骼肌、胎盤、肝臟、腦、血小板等5 種類型。在體研究中僅有1 例采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［58］作為線粒體載體實施移植。以上線粒體直接移植能夠發(fā)揮有效治療作用的結(jié)果充分證實，具有獨立雙層膜結(jié)構(gòu)的線粒體可不需要特殊載體或細(xì)胞攜帶而作為單獨功能性單元進(jìn)行移植操作，這為未來線粒體移植治療各類型疾病提供了實驗室依據(jù)。同時，來源相異的線粒體可以發(fā)揮相似治療效應(yīng)的結(jié)果也提示，未來進(jìn)行線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病時，線粒體來源是否來自于神經(jīng)系統(tǒng)這一點不需進(jìn)行重點關(guān)注，而更應(yīng)關(guān)注于移植使用的線粒體的數(shù)量是否足夠以及結(jié)構(gòu)是否均一。

從目前結(jié)果判斷，胎盤來源的線粒體可能在人類線粒體移植中具有最重要意義。2022 年12 月Minovia 公司和以色列舍巴醫(yī)療中心的研究人員合作［60］，在Science Translational Medicine發(fā)表了一篇封面論文。該研究首先將胎盤來源健康線粒體移植到單個大規(guī)模線粒體DNA 缺失綜合征（SLSMD）患兒的CD34+造血干細(xì)胞，進(jìn)行線粒體擴增，然后將擴增的造血干細(xì)胞回輸給患兒。單個大規(guī)模線粒體DNA缺失綜合征（SLSMD）會導(dǎo)致多種毀滅性疾病，包括Pearson 綜合征（PS）和Kearns-Sayre綜合征（KSS），這些線粒體疾病是散發(fā)的，目前尚無法治愈，并最終導(dǎo)致患者死亡。前者通常在嬰兒期發(fā)病，并導(dǎo)致一半患者死于嬰兒期或兒童期，而幸存者通常會發(fā)展為后者，成為一種進(jìn)行性多系統(tǒng)疾病，伴隨著視力、聽力障礙、心臟疾病、胃腸道障礙、癡呆、肌肉無力，直至死亡。而在該項研究中，6 名接受治療的患兒中，4 名患兒的外周血異質(zhì)性下降，所有6名患兒在治療后6～12 個月時外周血細(xì)胞線粒體DNA 含量的增加，2名患兒在治療后有氧功能改善，治療前體重非常低的6名患兒中有5名體重增加；而且這項治療具有良好的安全性和耐受性。結(jié)合該項報道及現(xiàn)有研究結(jié)果推測，胎盤來源線粒體移植可能是未來線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的首選策略。

線粒體移植入體內(nèi)的方式包括6種（表2）：動脈注射（頸內(nèi)動脈和股動脈）、腦室注射、靜脈注射、玻璃體注射、神經(jīng)外膜注射、脊髓注射。注射的次數(shù)不一，有單次注射，也有連續(xù)注射多次。注射的線粒體含量不一，以線粒體蛋白質(zhì)為計數(shù)單位的注射劑量報道中最小100 μg絕對量或1 mg/kg相對量，最大750 μg絕對量或5 mg/kg相對量。以線粒體數(shù)量為計數(shù)單位的注射劑量大約1×106～1×107。以上結(jié)果可見，腦室內(nèi)注射一般進(jìn)行一次即可見效，而血管內(nèi)注射通常需要多次注射才能起效。說明，線粒體從循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)需要耗時更長，中間損耗情況更為嚴(yán)重。這為未來線粒體移植的具體策略提供了思路。

線粒體移植后發(fā)揮治療或者改善效果的時程在報道中差異很大，短的有2 h，長的有90 d。移植后的效果均為減輕動物的疾病程度（表2）。研究多用線粒體探針MitoTracker 驗證線粒體是否進(jìn)入體內(nèi)（表2）。部分研究證實了線粒體功能的好轉(zhuǎn)（表2）?？紤]到線粒體移植產(chǎn)生效果的證據(jù)是神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激得到緩解、能量合成得到補充、神經(jīng)元突觸傳遞得到改善，而這些指標(biāo)的恢復(fù)或者改善都需要神經(jīng)系統(tǒng)運行穩(wěn)定后才能夠顯示出來，因此推測，線粒體移植到達(dá)靶區(qū)后，可能立即發(fā)揮能量合成、調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)以及穩(wěn)定突觸可塑性的功能。如果此時原有線粒體傷亡較小，新移植線粒體的補給就可以完全糾正原有損傷，結(jié)果表現(xiàn)為發(fā)揮效應(yīng)；若此時原有線粒體傷亡較大，新移植線粒體的補給尚不能完全糾正原有損傷，結(jié)果表現(xiàn)為尚未發(fā)揮效應(yīng)。對于后一種情況，推測隨著時間推移，新移植線粒體可通過分裂以產(chǎn)生新鮮線粒體，或通過與受損較輕線粒體融合以產(chǎn)生新鮮線粒體，最終通過數(shù)量充分的正常線粒體的補充，最終發(fā)揮緩解疾病的效應(yīng)。因此，未來研究中，應(yīng)加強對線粒體移植后早、中、晚期等不同階段線粒體動力學(xué)、線粒體發(fā)生相關(guān)分子群的檢測，勾勒出移植線粒體在體內(nèi)的修復(fù)路徑與分子事件，從而為精準(zhǔn)實施線粒體移植提供分子工具。

同時，以上結(jié)果提示，線粒體移植在體治療的實驗方案尚存在較大分歧，后續(xù)關(guān)于線粒體質(zhì)量控制等方案的規(guī)范化探索將成為重要的研究方向。

油田注水開發(fā)到了高含水期，由于油藏壓力的變化、注采井網(wǎng)的變化和不同區(qū)域不同方向注采程度的變化，導(dǎo)致了油藏儲層物性和油氣水三相流體飽和度發(fā)生變化，剩余油分布呈現(xiàn)總體零散局部富集的特征。油田開發(fā)表現(xiàn)為單井產(chǎn)量逐步降低，含水快速升高，開發(fā)成本上升，效益下降。

2.2 線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究

目前有3篇研究報道了線粒體移植對體外培養(yǎng)神經(jīng)元的保護(hù)效應(yīng)。將源自大鼠新鮮大腦提取的突觸小體作為線粒體傳遞系統(tǒng)與CCCP或魚藤酮處理的LAN5 細(xì)胞系共培養(yǎng)［61］，JC-1 探針結(jié)合流式細(xì)胞儀證實細(xì)胞線粒體膜電位水平恢復(fù)；將源自間充質(zhì)干細(xì)胞的提取線粒體與小鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)［62］，能夠改善氧化應(yīng)激致神經(jīng)元損傷；將源自人肝癌細(xì)胞提取的線粒體與人神經(jīng)瘤母細(xì)胞系共培養(yǎng)［63］，能夠改善MPP＋致神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷。

以上體外研究結(jié)合在體研究證實，線粒體移植能夠有效阻斷各種應(yīng)激所致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的節(jié)奏，有望為神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)贏得寶貴的時間。

3 線粒體移植治療疾病的生物學(xué)機制

無論是線粒體直接移植還是以突觸體或星形膠質(zhì)細(xì)胞作為載體的間接移植，無論是經(jīng)腦內(nèi)注射還是經(jīng)靜脈/動脈注射，健康線粒體最終要發(fā)揮效應(yīng)都需要其能夠進(jìn)入到受損神經(jīng)元內(nèi)部，即神經(jīng)元能夠“吞噬”健康線粒體。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)線粒體進(jìn)入細(xì)胞的兩種生物學(xué)機制（表3）：隧道納米管（tunneling nanotubes， TNTs） 和 細(xì) 胞 外 囊 泡（extracellular vesicles，EVs）。

Tabel 3 Biological mechanisms of mitochondrial transplantation表3 線粒體移植的生物學(xué)機制

3.1 隧道納米管（TNTs）

TNTs 特指直徑在50～200 nm 的狹細(xì)通道，以肌動蛋白為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，呈現(xiàn)絲狀伸展，可發(fā)自于細(xì)胞、線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各種膜性結(jié)構(gòu)。線粒體TNTs 是線粒體發(fā)出的纖細(xì)管狀結(jié)構(gòu)，可與毗鄰線粒體形成物理性接觸，允許多種分子進(jìn)行單向或雙向傳輸，以單向為主［66］。目前觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞來源的線粒體可經(jīng)TNTs 進(jìn)入氣道上皮細(xì)胞［67］，還可見心肌細(xì)胞來源線粒體經(jīng)TNTs 進(jìn)入內(nèi)皮祖細(xì)胞［68］，以及神經(jīng)元內(nèi)線粒體經(jīng)TNTs轉(zhuǎn)移到星形膠質(zhì)細(xì)胞［69］。以TNTs為橋梁的線粒體移植被證明可以改善多個線粒體活性參數(shù)，包括ATP水平、線粒體膜電位、線粒體耗氧量?；赥NTs 的線粒體移植在缺血再灌注損傷［70］、腎小管細(xì)胞分化［71］及腫瘤［72］中得到了證實。目前認(rèn)為，細(xì)胞外蛋白S100A4［73］及其受體高級糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end product，RAGE）、黏連蛋白connexin 43（Cx43）［74］、線粒體 受 體 蛋 白1 （mitochondrial receptor protein，Miro1）等［75］分子以及Ras不依賴的鳥嘌呤核苷酸交換因子（Ras-independent guanine nucleotide exchange factor for RalA GTPase，RalGPS2）-Akt-PDK1等［76］通路參與了TNTs的形成與維持。

3.2 細(xì)胞外囊泡（EVs）

EVs是由細(xì)胞釋放到外部環(huán)境的膜性囊泡，其內(nèi)部含有蛋白質(zhì)、脂類和核苷酸，參與細(xì)胞間通訊。根據(jù)直徑大小不同將EVs 分為3 類：直徑30～100 nm 的外泌體（exosomes），直徑100 nm～1 μm的微泡（microvesicles）以及直徑1～2 μm的凋亡小體（apoptotic body）［65］。有報道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的線粒體通過外泌體促進(jìn)線粒體生物生成進(jìn)而改善骨關(guān)節(jié)炎［77］。Spees 等［78］首次應(yīng)用熒光標(biāo)記法觀察到人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌含有線粒體的微泡到培養(yǎng)液中，被受體細(xì)胞吞噬；另有證據(jù)表明，受損細(xì)胞從微泡中獲得功能性線粒體［79-80］。目前關(guān)于凋亡小體參與線粒體移植尚未見報道。

無論是通過隧道納米管機制還是通過細(xì)胞外囊泡機制，外源性線粒體要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部都必然會發(fā)生胞膜與線粒體外膜的接觸，接觸后的線粒體還要與胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生解離后才能成為胞質(zhì)內(nèi)獨立單元，而在以上接觸與解離生物學(xué)事件中是否存在特異性分子的相互識別目前尚無定論，這也將成為未來該領(lǐng)域的研究熱點與前沿。

4 線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病尚需解決的關(guān)鍵問題

4.1 線粒體來源

前已述及，目前報道的用于線粒體移植的線粒體來源非常豐富，包括細(xì)胞系、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及同種異體組織，組織來源包括骨骼肌、胎盤、肝臟、腦、血小板等。說明在此方面尚無共識，更導(dǎo)致未來研究中對于評估線粒體移植的效應(yīng)方面缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，這是急需解決的關(guān)鍵問題之一。前已述及，胎盤來源線粒體可能在臨床應(yīng)用中具有重大潛力。

4.2 線粒體移植方式及數(shù)量

前已述及，線粒體移植入體內(nèi)的方式包括：動脈注射、腦室注射、靜脈注射、玻璃體注射、神經(jīng)外膜注射、脊髓注射。注射次數(shù)包括有單次注射或多次注射。注射線粒體有以線粒體蛋白質(zhì)為計數(shù)單位，也有以線粒體密度為計數(shù)單位，且所用數(shù)量均無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。值得注意的是，2018 年在大鼠脊髓損傷線粒體移植研究中報道［57］，移植后的緩解效應(yīng)與移植的線粒體濃度之間存在顯著正相關(guān)性，即線粒體輸注越多，效果越好。因此提示，線粒體移植中采用的方式及線粒體數(shù)量是未來研究中急需解決的關(guān)鍵問題之一。前已述及，直接注射較間接移植效率更高，所需線粒體數(shù)量更為經(jīng)濟(jì)。

4.3 線粒體的儲存

線粒體雖然是一個具有雙層膜結(jié)構(gòu)的獨立細(xì)胞器，但其對刺激非常敏感，研究證實，線粒體儲存于冷藏或冷凍狀態(tài)超過1 h，其外膜和內(nèi)膜就會發(fā)生損傷［81］，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能及ATP 供應(yīng)能力顯著下降，甚至出現(xiàn)線粒體膜通透性及死亡。因此，進(jìn)行線粒體移植時安全有效保存線粒體就格外重要。Gnaiger等［82］認(rèn)為，將線粒體冷藏在以HEPES-蔗糖為基礎(chǔ)的緩沖液中可有效保證線粒體具有較好呼吸功能，且能夠維持24 h，但是最長不能超過2 d。有報道比較了將線粒體保存于4℃的進(jìn)行人體器官移植時使用的University of Wisconsin緩沖液與Eurocollins 緩沖液［83］，結(jié)果表明，在維持肝臟線粒體復(fù)合物ⅠⅠ的活性方面，University of Wisconsin 緩沖液優(yōu)于Eurocollins 緩沖液。Greiff等［84］觀察到將線粒體儲存于-65℃的10%二甲基亞砜（DMSO）中18 d或-65℃的10%甘油中15 d，線粒體氧化磷酸化能力能夠很好維持；Nukakla等［85］進(jìn)一步利用電鏡證實-65℃的10% DMSO 中的腦源性線粒體內(nèi)膜和外膜完整。未來有必要針對線粒體的儲存進(jìn)一步優(yōu)化方案。

4.4 免疫反應(yīng)

部分研究認(rèn)為不存在免疫反應(yīng)。支持該結(jié)論的研究包括：2017年波士頓兒童醫(yī)院團(tuán)隊［37］在實施患兒線粒體移植治療嚴(yán)重心臟病時，觀察了免疫反應(yīng)，未見移植后TNFα、ⅠL-6 和高敏感性C 反應(yīng)蛋白等炎癥標(biāo)志物升高，也未檢測到抗線粒體抗體；2017年，Kaza等［86］將自體線粒體移植到豬缺血再灌注模型后，將血清細(xì)胞因子水平作為移植后免疫反應(yīng)指標(biāo)，也未觀察到其升高；2019年，Ramirez-Barbieri等［87］將同種異體線粒體單次或多次注射入小鼠腹腔，未見炎性細(xì)胞因子升高。

但是，也存在相反觀點。2018 年，Pollara等［88］觀察到接受線粒體移植后小鼠體內(nèi)炎性因子增高；2019 年，Lin 等［89］報道線粒體可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，接受線粒體移植的小鼠心臟出現(xiàn)顯著免疫排斥反應(yīng)。

5 展 望

由于線粒體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病在不到十年的時間里取得了較大成效，并且其操作較為簡單，因此被認(rèn)為有巨大臨床應(yīng)用價值。本篇綜述預(yù)測，未來研究將陸續(xù)揭示線粒體移植中的線粒體質(zhì)量控制策略及其分子和細(xì)胞機制，并且將形成線粒體移植的臨床規(guī)范化診療方案。