黃國(guó)梁，吳曉妮，鄒榮華，李倩倩，葛家振，宋國(guó)棟，鄭福英*，藺國(guó)珍*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是鴨漿膜炎的病原[1]，也可感染鴨的腦組織導(dǎo)致腦膜炎，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，發(fā)病鴨表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀。目前關(guān)于該菌如何導(dǎo)致鴨腦膜炎的致病機(jī)制尚不清楚。

細(xì)菌導(dǎo)致宿主發(fā)生腦膜炎，首先要突破宿主的血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）。BBB主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Brain microvascular endothelial cells，BMECs）、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和基膜構(gòu)成，可以控制腦實(shí)質(zhì)和血液循環(huán)之間的物質(zhì)交換，阻止病原微生物和毒素入侵腦組織[2]。研究表明，BMECs是研究細(xì)菌突破BBB的經(jīng)典模式細(xì)胞，以宿主的BMECs作為體外細(xì)胞模型，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)與細(xì)菌侵襲BBB相關(guān)的毒力因子?；诖?，本研究分離培養(yǎng)鴨BMECs原代細(xì)胞并將其永生化，得到永生化鴨BMECs，為研究RA入侵鴨腦組織的相關(guān)毒力因子及其致病機(jī)制提供體外細(xì)胞系。

機(jī)體組織來(lái)源的細(xì)胞在體外環(huán)境條件下培養(yǎng)可分裂增殖，經(jīng)過(guò)有限次傳代后，體外環(huán)境培養(yǎng)的細(xì)胞就會(huì)停止增殖，發(fā)生衰老和死亡，這種現(xiàn)象稱之為海弗利克極限（Hayflick limit）[3]。細(xì)胞經(jīng)過(guò)自發(fā)的或受外界因素的影響突破限制，從而具有無(wú)限增殖能力的過(guò)程稱為細(xì)胞永生化。原代細(xì)胞因?yàn)镠ayflick limit無(wú)法在體外長(zhǎng)期保持內(nèi)皮細(xì)胞的活性，因此建立永生化鴨BMECs能為研究RA的致病機(jī)理提供一個(gè)穩(wěn)定的BBB模型。

本試驗(yàn)采用胰酶消化法從鴨胚腦組織中分離BMECs，并通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選的方法對(duì)BMECs進(jìn)行轉(zhuǎn)染和篩選，同時(shí)采用細(xì)胞免疫熒光染色的方法分別對(duì)原代BMECs和永生化細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色觀察和鑒定，以期獲得高純度BMECs及其永生化細(xì)胞系。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

櫻桃谷受精鴨蛋10枚，購(gòu)自江蘇圣安農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

胎牛血清（1414426）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，1734858）購(gòu)自Gibico公司；內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（PriMed-iCell-001）購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；多聚甲醛（PFA，P1110）、DAPI（C0060）、Triton X-100（T8200）、山羊血清（S9070）均購(gòu)自Solarbio公司；vWF（11778-1-AP）、Goat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 488（SA00006-2）均購(gòu)自proteintech公司；Fluoromount-G熒光封片劑（0100-01）購(gòu)自SourthernBiotech公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（430639）購(gòu)自Coming公司；血球計(jì)數(shù)板（Neubauer improved）購(gòu)自Marienfeld公司；24孔板專用細(xì)胞爬片（YA0350）購(gòu)自Solarbio公司；細(xì)胞培養(yǎng)孔板（WHB-24）購(gòu)自上海臥宏生物科技有限公司；生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；熒光倒置顯微鏡（Nikon，日本）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher，美國(guó)）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電熱恒溫震蕩水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 櫻桃谷鴨BMECs分離培養(yǎng)

取孵育20 d櫻桃谷鴨胚1個(gè)，在生物安全柜中無(wú)菌分離鴨胚大腦皮質(zhì)，去除腦膜后用PBS沖洗3次，再用無(wú)菌眼科剪將沖洗干凈的大腦皮質(zhì)剪成1 cm3大小的組織塊，置于培養(yǎng)瓶中，加入2 mL內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，確保組織塊不懸浮，倒置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，然后將培養(yǎng)瓶正置。待組織塊周?chē)L(zhǎng)的細(xì)胞融合成片即可去除組織塊，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，重新鋪瓶，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿瓶底約80%，得到原代鴨BMECs。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

用倒置顯微鏡對(duì)培養(yǎng)的原代櫻桃谷鴨BMECs進(jìn)行觀察，并拍照記錄。

2.3 免疫熒光染色

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1 mL，加入原代鴨BMECs 2×104個(gè)/孔，培養(yǎng)48 h。細(xì)胞鋪滿玻璃片約80%后，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4 ℃環(huán)境下固定30 min。用PBS洗3次，每次5 min。將玻片吸干水分后用配制好的封閉液（0.5% Trition X-100與PBS按1∶1混合后再加入10%牛血清白蛋白）室溫封閉2 h。吸去封閉液后實(shí)驗(yàn)孔滴加1∶200兔抗鴨血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）抗體，對(duì)照孔加入等量PBS代替一抗，置于4 ℃孵育過(guò)夜；PBS洗細(xì)胞爬片3次，每次5 min；室溫避光加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L），孵育2 h，用PBS清洗爬片3次，每次5 min。吸干水分后滴加1∶1 000稀釋后的DAPI染液避光染色5 min，用PBS清洗爬片3次，每次5 min。吸干液體后加入Fluoromount-G熒光封片劑進(jìn)行封片，置于熒光倒置顯微鏡下觀察采集圖片信息。

2.4 鴨BMECs永生化細(xì)胞系的建立

2.4.1 慢病毒轉(zhuǎn)染鴨BMECs 將原代鴨BMECs接種6孔板（1×105個(gè)/孔），置于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)基加入新鮮內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，并加入20 μL SV40過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，更換新鮮內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后傳代至T25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4.2 嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞 將轉(zhuǎn)染后的鴨BMECs接種24孔板（5×104個(gè)/孔），加入適量?jī)?nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基孵育過(guò)夜。次日棄舊培養(yǎng)基，加入含嘌呤霉素（2 μg/mL）的篩選培養(yǎng)基適量，孵育過(guò)夜。重復(fù)上述步驟3～5 d，陰性對(duì)照細(xì)胞加入不含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待陰性對(duì)照細(xì)胞全部死亡后，將存活的陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)至T25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4.3 永生化細(xì)胞系鑒定 挑選經(jīng)嘌呤霉素轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)狀況良好、形態(tài)穩(wěn)定的陽(yáng)性鴨BMECs進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代12代。選取P12鴨BMECs培養(yǎng)，分別對(duì)培養(yǎng)1 d、2 d、3 d的鴨BMECs進(jìn)行免疫熒光染色，并在熒光倒置顯微鏡下觀察采集圖片信息，應(yīng)用Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 鴨原代BMECs分離培養(yǎng)和鑒定

按照2.1所述方法，成功從櫻桃谷鴨胚腦組織中分離出鴨BMECs，光學(xué)顯微鏡200×視野下可見(jiàn)細(xì)胞間融合成片，呈現(xiàn)典型單層、鋪路石樣鑲嵌式排列（圖1A）。經(jīng)免疫熒光染色，觀察到細(xì)胞可特異表達(dá)鴨vWF，說(shuō)明成功分離并培養(yǎng)出鴨原代BMECs（圖1B）。

圖1 原代鴨BMECs的鑒定

3.2 鴨BMECs永生化細(xì)胞系培養(yǎng)和鑒定

挑選經(jīng)嘌呤霉素轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)狀況良好、形態(tài)穩(wěn)定的陽(yáng)性鴨BMECs進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代12代，細(xì)胞增殖一直比較旺盛，沒(méi)有生長(zhǎng)停滯。P12鴨BMECs如圖2A所示，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況極好，細(xì)胞間隙變小，胞質(zhì)緊密連接。對(duì)P12鴨BMECs進(jìn)行免疫熒光染色，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光，vWF相關(guān)抗原陽(yáng)性表達(dá)（圖2B）。以上結(jié)果說(shuō)明永生化鴨BMECs細(xì)胞系培養(yǎng)成功。

P12鴨BMECs培養(yǎng)1 d、2 d、3 d后進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示vWF陽(yáng)性表達(dá)（圖3A），應(yīng)用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度，繪制統(tǒng)計(jì)圖。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，vWF表達(dá)差異不顯著，vWF在不同培養(yǎng)天數(shù)P12鴨BMECs中穩(wěn)定表達(dá)（圖3B）。

圖3 P12鴨BMECs培養(yǎng)1 d、2 d、3 d鑒定結(jié)果

4 分析討論

鴨疫里默氏桿菌可突破鴨BBB進(jìn)入腦組織，導(dǎo)致鴨腦膜炎[4]，目前對(duì)該菌突破BBB的機(jī)制知之甚少。對(duì)這一機(jī)制開(kāi)展研究，首先要建立鴨BBB的體外細(xì)胞模型。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和基膜等共同構(gòu)成BBB，而B(niǎo)MECs是構(gòu)成BBB最主要的細(xì)胞，永生化的BMECs可作為BBB的體外細(xì)胞模型，目前已用于多種病原突破BBB的機(jī)制研究[5-7]。BMECs具有外周血管內(nèi)皮細(xì)胞的典型特點(diǎn)，內(nèi)皮細(xì)胞是一種單層扁平上皮，呈多邊形，細(xì)胞邊緣呈鋸齒狀，相互嵌合，形成了完整的血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)。目前，不同研究人員已經(jīng)針對(duì)人以及小鼠、大鼠、家兔和豬等多種動(dòng)物的BMECs建立了體外分離培養(yǎng)方法和BBB模型[8-11]。

分離出鴨BMECs并在離體環(huán)境下培養(yǎng)是體外建立BBB模型的前提條件。由于分離細(xì)胞的生理狀態(tài)不同，不同批次的細(xì)胞之間可能存在差異以及存在海弗利克極限（Hayflick limit），不能為后續(xù)研究提供穩(wěn)定的BBB模型，因此需構(gòu)建鴨BMECs的永生化細(xì)胞系。目前，人們已建立了多種細(xì)胞永生化的方法，包括：（1）端粒酶激活細(xì)胞永生化[12]。端粒酶能以自身的RNA為模板，延伸端粒或合成新的端粒DNA來(lái)維持端粒長(zhǎng)度，使細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)凋亡，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞永生化。（2）癌基因法[13]。一些原癌基因，如Myc66[14]、c-Jun[15]、vsrc和Mdm2[16]，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染可介導(dǎo)目的細(xì)胞永生化。c-Myc轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白通過(guò)誘導(dǎo)端粒酶mRNA快速表達(dá)，直接激活端粒酶活性，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入永生化[14]。（3）病毒轉(zhuǎn)染。很多病毒感染能夠誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，例如EB病毒[17]、人乳頭瘤病毒（HPV）[18]和猿猴病毒40（SV40）[19]。這些病毒感染其天然宿主細(xì)胞，能誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。本研究選用SV40病毒轉(zhuǎn)染原代鴨BMECs，然后利用含嘌呤霉素的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染后的鴨BMECs，能夠存活并生長(zhǎng)的細(xì)胞即為陽(yáng)性篩選株，挑取陽(yáng)性株細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并隨時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)。傳代培養(yǎng)第12代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在細(xì)胞瓶中單層致密生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形鑲嵌排列，細(xì)胞間隙小，保持著原代BMECs的生長(zhǎng)特性。

免疫熒光染色[20-21]是一種適用于鑒定細(xì)胞的檢測(cè)方法，依據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色的原理，采用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的分布進(jìn)行原位檢測(cè)。將培養(yǎng)處理后的細(xì)胞爬片固定、破膜、封閉后，加入一抗與抗原結(jié)合，再加入標(biāo)記有熒光素的二抗與一抗進(jìn)行反應(yīng)，最后通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行熒光拍攝來(lái)顯示細(xì)胞中靶蛋白的表達(dá)變化和定位[22]。血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）主要由血管的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，可作為一抗的特異性識(shí)別位點(diǎn)來(lái)識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞，再通過(guò)帶有免疫熒光的二抗與之結(jié)合，從而鑒定待測(cè)細(xì)胞是否是血管內(nèi)皮細(xì)胞。本試驗(yàn)針對(duì)細(xì)胞核和vWF進(jìn)行免疫熒光染色，染色結(jié)果通過(guò)Image J[23]軟件分析熒光強(qiáng)度，并利用Graphpad軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果顯示，原代鴨BMECs以及轉(zhuǎn)染成功后傳代培養(yǎng)的P12 BMECs均在胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光，即vWF相關(guān)抗原陽(yáng)性表達(dá)，且表達(dá)差異不顯著，說(shuō)明鴨原代和永生化BMECs培養(yǎng)成功。

本試驗(yàn)從鴨胚腦組織中分離和體外培養(yǎng)原代鴨BMECs，并通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。同時(shí)將SV40過(guò)表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染鴨原代BMECs，篩選陽(yáng)性表達(dá)株后進(jìn)行傳代培養(yǎng)12代以上，建立了永生化細(xì)胞系。