樊葉,李超,汪志兵

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院·南京市第一醫(yī)院消化科,江蘇 南京 210006)

腸癌是常見的消化道惡性實體瘤之一,2016年全球癌癥發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計顯示,我國等發(fā)展中國家腸癌的發(fā)病率逐年上升,成為僅次于胃癌和肺癌的第三大癌癥[1]。早期腸癌癥狀不明顯,檢出率較低,有數(shù)據(jù)[2]表明,約25%的患者在確診時已處于晚期,錯過了根治性手術(shù)切除的最佳治療時機,同時因腸癌的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率較高,放射療法和化學(xué)療法效果也不佳,且存在嚴(yán)重的毒副作用[3],導(dǎo)致患者預(yù)后較差。貝伐珠單抗是近些年來新發(fā)現(xiàn)的對于腸癌有較好療效的人源化單克隆抗體,通過靶向血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)并抑制其生物活性[4],顯著抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移,在腸癌等實體瘤中發(fā)揮重要的抑制作用。VEGF是調(diào)節(jié)血管新生和血管生成動態(tài)平衡的高度特異性分子[5],與血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)共同作用,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程[6],影響腸癌等多種惡性腫瘤疾病進(jìn)展。然而,目前尚不清楚貝伐珠單抗是否可以直接通過調(diào)控VEGF/VEGFR信號通路影響腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等細(xì)胞周期?；诖?本研究擬通過VEGF/VEGFR途徑探究貝伐珠單抗對腸癌細(xì)胞生物學(xué)的影響,并初步了解其作用機制。

1 方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人腸癌細(xì)胞系SW480購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫,與含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)液混合,置于改良的無糖RPMI-1640培養(yǎng)基中,保持37 ℃的溫度和5%的CO2濃度進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),每隔3 d更換1次完全新鮮的培養(yǎng)基,待細(xì)胞融合至80%以0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2 藥物處理

采用不同濃度(0、25、50、100、200 μg/mL)的貝伐珠單抗(上海羅氏制藥有限公司)處理人腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞,37 ℃的溫度和5%的CO2濃度下培養(yǎng)48 h,收集處理后的含藥SW480細(xì)胞,檢測其增殖、遷移、侵襲、凋亡水平。

1.3 細(xì)胞活力檢測

采用CCK8計數(shù)試劑盒檢測細(xì)胞活力,取經(jīng)過上述不同濃度的貝伐珠單抗處理后的各組SW480細(xì)胞,按5×103個/孔的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)48 h后加入CCK8溶液,每孔各10 μL,嚴(yán)格按照說明書要求操作。共同培養(yǎng)2 h,采用酶標(biāo)儀(山東競道光電科技有限公司)分別檢測不同時間(0、24、48、72 h)下波長為450 nm處各組細(xì)胞的吸光度值,實驗重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測

采用Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力,取對數(shù)生長期的上述各組細(xì)胞,Transwell上室用Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行包被或不進(jìn)行任何操作,然后將細(xì)胞按照2×104個/孔放入Transwell上室中,另加600 μL含有胎牛血清的培養(yǎng)液于Transwell下室中,37 ℃的溫度和5%的CO2濃度下培養(yǎng)12 h,移除上室細(xì)胞,采用4%的多聚甲醛固定Transwell下室中的細(xì)胞,再用0.1%的結(jié)晶紫染色,倒置熒光顯微鏡(南京貝登醫(yī)療股份有限公司)下觀察由上室穿過Transwell濾膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù),分析細(xì)胞遷移和侵襲情況,實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

取不同濃度的貝伐珠單抗處理后的各組SW480細(xì)胞,采用Annexin V-FITC雙染法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。將各組細(xì)胞按照2×106個/孔接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h后采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞3次,經(jīng)洗滌過的細(xì)胞重懸于150 μL Binding Buffer結(jié)合緩沖液中,向緩沖區(qū)的細(xì)胞懸液中滴加10 μL的Annexin V-FITC試劑以及5 μL碘化丙啶染色液,輕搖離心管使其充分混合,2～8 ℃下避光孵育15 min,采用AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒(武漢普諾賽生命科技有限公司)說明書檢測各組細(xì)胞凋亡水平,實驗重復(fù)3次。

1.6 VEGF/VEGFR信號通路檢測

采用Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)VEGF/VEGFR信號通路的蛋白表達(dá),取經(jīng)不同濃度的貝伐珠單抗處理后的各組SW480細(xì)胞,移除培養(yǎng)基,PBS洗細(xì)胞1次,采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞后提取蛋白,BCA法檢測蛋白含量。將提取到的蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺恒溫下1 000 V電泳1 h后轉(zhuǎn)膜,室溫封閉2 h后加入VEGF、VEGFR1、VEGFR2和β-actin單克隆抗體(Abcam公司,稀釋比均為1∶2 000)室溫下孵育過夜,常規(guī)洗膜后與二抗(Abcam公司,稀釋比均為1∶1 000)室溫下孵育1 h,再次洗滌后以ECL發(fā)光試劑(湖南一諾唯真科技有限公司)顯影,Image J軟件掃描并測量感光條帶,分析以β-actin作為內(nèi)參時各組VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白的相對表達(dá),實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的貝伐珠單抗對腸癌細(xì)胞增殖的影響

貝伐珠單抗?jié)舛纫蕾囆缘匾种颇c癌細(xì)胞體外增殖(P<0.05)。見圖1。

2.2 不同濃度貝伐珠單抗對腸癌細(xì)胞遷移的影響

Transwell檢測各組細(xì)胞遷移水平,結(jié)果顯示,貝伐珠單抗?jié)舛纫蕾囆缘匾种颇c癌細(xì)胞體外遷移(P<0.05)。見圖2。

2.3 不同濃度貝伐珠單抗對腸癌細(xì)胞侵襲的影響

Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲水平,結(jié)果顯示,貝伐珠單抗?jié)舛纫蕾囆缘匾种颇c癌細(xì)胞體外侵襲(P<0.05)。見圖3。

2.4 不同濃度貝伐珠單抗對腸癌細(xì)胞凋亡的影響

AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒檢測各組細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,貝伐珠單抗顯著誘導(dǎo)了腸癌細(xì)胞的體外凋亡,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖4。

2.5 不同濃度的貝伐珠單抗對腸癌細(xì)胞內(nèi)VEGF/VEGFR信號通路的影響

Western blot檢測經(jīng)不同濃度的貝伐珠單抗處理后的各組腸癌細(xì)胞內(nèi)VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,隨著貝伐珠單抗?jié)舛鹊脑黾?VEGF的表達(dá)顯著下調(diào),VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖5。

3 討論

隨著基因技術(shù)的發(fā)展和對腸癌研究的不斷加深,有學(xué)者[7-8]提出,腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為受到轉(zhuǎn)化生長因子β1、VEGF等多種細(xì)胞因子的影響。VGEFR1和VEGFR2是VEGFR家族中的重要成員,其中VEGFR1在單核細(xì)胞等巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞膜中高表達(dá),參與細(xì)胞因子和趨化因子之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),刺激不同組織的炎癥反應(yīng)和非炎癥反應(yīng)[9],促進(jìn)腫瘤血管、淋巴管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。VEGFR2具有較強的酪氨酸激酶活性,在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá),產(chǎn)生主要和直接的血管生成信號[10]。有報道[11-12]稱,VEGF在肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá),抑制VEGF的表達(dá)可阻斷腫瘤新生血管生成,被認(rèn)為是多種癌癥的潛在免疫治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn),VEGF/VEGFR信號通路參與介導(dǎo)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡,為腸癌的臨床治療提供了新的分子靶點和理論依據(jù),這主要與VEGF與其受體家族中的VEGFR1和VEGFR2結(jié)合,可在惡性腫瘤疾病中參與細(xì)胞間的信號傳遞,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多種基因表達(dá),進(jìn)而影響疾病進(jìn)展有關(guān)[13]。

貝伐珠單抗是治療胰腺炎、結(jié)腸癌等癌癥的重要靶向藥物,發(fā)揮顯著抗腫瘤血管生成作用,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,抑制腸癌等癌癥的病情進(jìn)展[14]。本研究結(jié)果顯示,貝伐珠單抗可濃度依賴性地抑制人腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮顯著的抑癌效應(yīng)。進(jìn)一步的機制實驗也表明,貝伐珠單抗的抗腫瘤作用是通過抑制血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達(dá),上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR1/2來實現(xiàn)的。這與貝伐珠單抗特有的生物活性有關(guān),貝伐珠單抗可與VEGFR受體競爭性結(jié)合[15],上調(diào)VEGFR1、和VEGFR2的表達(dá),阻斷VEGF的活性,下調(diào)VEGF的表達(dá),抑制腫瘤新生血管和淋巴管生成[16],進(jìn)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,與Itatani等[17]的研究結(jié)果相符。

綜上,貝伐珠單抗通過下調(diào)VEGF,上調(diào)VEGFR1和VEGFR2的表達(dá),在體外顯著抑制腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且貝伐珠單抗的抗癌效應(yīng)隨著藥物濃度的增加而增強。