敬昊東,馮莉,王朝莉,李麗,謝勇恩,胡為民,楊健,敬保遷

(川北醫(yī)學院免疫學與分子生物學研究室,四川 南充 637000)

人體內許多重要功能分子通過調節(jié)表達方式來調控細胞增殖和分化,介導細胞與細胞間,或細胞與細胞外基質間的相互作用等,維持機體不同組織正常發(fā)育分化,若表達失調,可促進腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉移[1]。識別和深入研究不同種類癌癥組織間差異表達的功能分子或癌癥組織與相應癌旁組織間差異表達的功能分子,不僅有利于闡釋相關癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移的分子機制,而且可尋找到相應的干預或治療措施。

本課題組之前采用抑制性消減雜交技術從整個轉錄組水平比較食管鱗狀細胞癌組織與相應癌旁粘膜組織間差異表達的基因,發(fā)現(xiàn)食管癌旁粘膜組織中組織蛋白酶抑制劑胱抑素B(cystatin B,CSTB)基因發(fā)生表達,而食管鱗狀細胞癌組織中CSTB基因則不發(fā)生表達[2]。由于CSTB在維持機體正常細胞的增殖、分化、及組織形成等中發(fā)揮重要作用,近年研究[3-4]表明:腫瘤內CSTB表達失調嚴重影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,通過CSTB作用的添加或拮抗可發(fā)展腫瘤治療方法。但直至目前,仍未見同時觀察并比較人體內不同類型腫瘤或體外培養(yǎng)腫瘤細胞內CSTB表達的實驗報道,不能系統(tǒng)闡釋不同正常組織或腫瘤內CSTB的表達特征,及評價人體內各種不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展與CSTB表達變化間的關系。本研究擬觀察和比較不同癌癥組織、癌旁組織和癌細胞株內CSTB的表達特征,為進一步研究不同類型腫瘤治療和療效考核中CSTB的意義提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及組織

食管低分化鱗狀細胞癌、食管中分化鱗狀細胞癌、食管高分化鱗狀細胞癌、食管腺癌及相應癌旁粘膜的手術切除組織系在患者及家屬知情同意下,由川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科采集自食管癌患者。

實體癌及相應癌旁組織石蠟樣本。其中15例食管鱗狀細胞癌與相應癌旁組織,10例喉鱗狀細胞癌與相應癌旁組織,22例胃腺癌與相應癌旁組織,12例肺鱗狀細胞癌與相應癌旁組織,20例肝細胞癌與相應癌旁組織,12例結腸腺癌與相應癌旁組織及17例膀胱移行細胞癌與相應癌旁組織,均由川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科提供。

食管鱗狀細胞癌Eca109細胞株、胃腺癌SGC7901細胞株、肝癌Hep G2細胞株及肺鱗狀細胞癌YTLMC-90細胞株系本研究室保存。

1.2 試劑

抗CSTB單克隆抗體與抗β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),羊抗鼠IgG抗體及NBT/BCIP(美國Promega公司),蛋白質定量試劑盒(美國Bio Rad公司),SABC法免疫組化染色試劑盒(福建邁新公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)

將食管鱗狀細胞癌Eca109細胞株、胃腺癌SGC7901細胞株、肺鱗狀細胞癌YTLMC-90細胞株及肝細胞癌HepG2細胞株以含青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 U/mL)及10%小牛血清的RPMI 1640復合培養(yǎng)液在37 ℃,5% CO2,飽和濕度下擴增培養(yǎng)。

1.4 Western blot

將收集的食管癌患者手術切除的癌組織及癌旁粘膜組織,分別以蛋白質裂解液[8 mol/L尿素、4% CHAPS、40 mmol/L三羥甲基氨基甲烷、65 mmol/L二硫蘇糖醇和10 mmol/L苯甲磺酰氟(PMSF)]室溫下裂解,并用蛋白質定量試劑盒,參照使用說明測定各樣品蛋白質濃度。然后,取等量的不同類型食管癌病人癌組織與癌旁粘膜組織蛋白質,進行SDS-PAGE電泳,電轉移方法將凝膠中蛋白質原位轉移至硝酸纖維濾膜上,3%脫脂奶粉封閉1 h后,分別以抗CSTB單克隆抗體、抗β-actin單克隆抗體為一抗(工作濃度為1∶1 000),堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG為二抗(工作濃度為1∶5 000)進行識別,NBT/BCIP為底物進行顯色。各免疫識別均進行3次獨立重復實驗。免疫識別圖像用PDQuest1.0計算機軟件進行編輯后,比較不同類型及分化程度的食管癌病人間、食管癌患者癌組織與相應癌旁粘膜組織間CSTB表達的變化。

1.5 免疫組化法

參考免疫組化染色試劑盒的使用說明,取的各癌組織及相應癌旁組織石蠟切片,在家用高壓鍋內以Tris-EDTA 緩沖液(10 mM 三羥甲基氨基甲烷,1 mmol/L EDTA 溶液,0.05% Tween 20,pH 9.0)熱誘導抗原表位修復3 min;體外培養(yǎng)癌細胞株制成細胞爬片。將上述處理后的標本片置于37 ℃的濕盒中,以10%小牛血清封閉30 min后,滴加抗CSTB單克隆抗體(工作濃度為1∶500),于4 ℃過夜,PBS洗洗滌(3 min×3),滴加生物素化羊抗鼠IgG,于37 ℃作用15 min,再用PBS洗滌(5 min×3)。各標本片分別滴加SABC試劑與DAB顯色試劑,室溫顯色后,蒸餾水洗滌,再經(jīng)鐵蘇木素輕度復染后,脫水,透明,封片。各標本的免疫識別均進行3次獨立重復實驗。結果由專業(yè)臨床病理診斷醫(yī)師對各免疫識別標本片進行判讀,比較不同類型實體癌病人的癌組織與相應癌旁粘膜組織間,及體內癌組織與體外培養(yǎng)的相應癌細胞株間CSTB表達的變化。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用Prism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以[n(%)]表示,組間比較采用Fisher確切概率法檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 食管癌組織與癌旁粘膜組織內CSTB的表達

與β-actin對照比較,食管低分化鱗狀細胞癌組織、中分化鱗狀細胞癌組織及高分化鱗狀細胞癌組織均不表達CSTB,但相應癌旁粘膜組織則表達CSTB,而食管腺癌組織及其癌旁粘膜組織均不表達CSTB。見圖1。

2.2 不同類型實體癌組織及癌旁組織內CSTB的表達與分布

所有食管鱗狀細胞癌、喉鱗狀細胞癌及胃腺癌患者的癌旁粘膜組織均高表達CSTB。在喉粘膜和食管粘膜中,僅表面角化層及緊鄰的多邊形細胞大量表達CSTB,而基底層細胞及鄰近的多邊形細胞則不表達(圖2A,圖2C)。胃腺癌的癌旁胃粘膜中,僅胃底腺細胞大量表達CSTB(圖2E),而表層單層柱狀上皮細胞不表達CSTB。另外,在95%肝細胞癌患者的癌旁組織中,CSTB呈灶性表達(圖2I),這些區(qū)域內存在炎性細胞浸潤,在無炎性細胞浸潤區(qū)域的肝組織則不表達CSTB。而肺鱗狀細胞癌旁肺組織、結腸腺癌旁結腸粘膜及膀胱移行細胞癌旁粘膜組織不表達或低表達CSTB(圖2G,圖2K,圖2M)。

比較不同類型實體癌患者癌旁組織組織與癌組織內CSTB的表達率,結果發(fā)現(xiàn)不同類型實體癌組織內CSTB的表達率呈多樣性變化(表1)。(1)食管鱗狀細胞癌和喉鱗狀細胞癌組織表達CSTB發(fā)生顯著下調(P<0.05)。僅40%食管鱗狀細胞癌患者的癌組織表達CSTB(圖2B)。同樣,僅40%喉鱗狀細胞癌患者的癌組織表達CSTB(圖2D)。(2)胃腺癌表達CSTB發(fā)生顯著下調(P<0.05)。僅50%胃腺癌患者的癌組織中有殘存胃底腺細胞表達CSTB(圖2F)。(3)肺鱗狀細胞癌、結腸腺癌和膀胱移行細胞癌表達CSTB發(fā)生顯著上調(P<0.05)。有50%肺鱗狀細胞癌患者的癌組織表達CSTB,41.7%結腸腺癌患者的癌組織表達CSTB,及64.7%膀胱移行細胞癌患者的癌組織表達CSTB(圖2H,圖2L,圖2N)。(4)90%肝細胞癌患者的癌組織表達CSTB(圖2J),而相應患者癌旁組織亦表達CSTB,兩者間的表達率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表1 Cystatin B在不同腫瘤組織內的表達[n(%)]

2.3 不同類型體外培養(yǎng)癌細胞內CSTB的表達

不同種類的體外培養(yǎng)癌細胞株經(jīng)抗CSTB單克隆抗體免疫組化染色和鐵蘇木素復染,結果顯示食管鱗狀細胞癌Eca109細胞株、肺鱗狀細胞癌細胞株YTLMC-90及肝細胞癌HepG2細胞株均大量表達CSTB(圖3A,圖3B,圖3D),而胃腺癌SGC7901細胞株則低表達CSTB(圖3C)。

3 討論

人體內組織蛋白酶抑制劑通過對組織蛋白酶的抑制,密切影響機體內蛋白質降解、免疫等系列生理過程,對維護機體健康和生命至關重要。若組織蛋白酶抑制劑表達失調不僅影響機體正常生長發(fā)育,而且參與風濕病、腫瘤及壞死性炎癥等的發(fā)生發(fā)展[5]。組織蛋白酶抑制劑家族中的CSTB可抑制木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B,H,L,S的生物活性。本研究發(fā)現(xiàn),在多種組織中,CSTB廣泛地分布于細胞漿和細胞核,及分泌到細胞外,預示它的作用不僅發(fā)生在細胞內,也可發(fā)生在細胞外。在細胞漿中,CSTB通過增強線粒體膜穩(wěn)定性,避免蛋白酶泄漏[6],減少氧化應激反應,抑制凋亡、鐵死亡[7];減少炎性細胞因子產生[8],炎性小體形成,抑制焦亡發(fā)生[9-10];增強細胞自噬功能,清除錯誤蛋白[11-12],維護細胞的正常生命代謝活性。在細胞核中,CSTB 通過抑制組織蛋白酶對組蛋白、轉錄因子CUX1等的降解,調節(jié)細胞周期和細胞壽命[13-14]。在細胞外,CSTB可抑制相關組織蛋白酶對細胞間質中彈力蛋白等的降解[3],有利于細胞增殖、組織形成。說明CSTB從多個方面影響人細胞的生物學行為[15]。

本研究證實,在成人階段,CSTB的表達具有組織特異性。正常成人喉、食道中上段粘膜及胃底腺可表達CSTB,其它如結腸粘膜、膀胱粘膜、肝及肺組織中低表達或不表達。說明CSTB屬人體正常分化表達蛋白,在不同性質的正常細胞內的表達存在差異。并且,先前R?s?nen等[16]發(fā)現(xiàn)在人胚胎粘膜組織發(fā)育過程中,第9周時鱗狀上皮細胞層內基底細胞等開始表達CSTB,16周時達到最高水平,并一直存在于成熟的胎兒、嬰兒和成人鱗狀上皮組織內。而在皮膚發(fā)育過程中,11周時開始表達CSTB,17周以上時表達減少,超過26周時皮膚內完全消失。Lu等[17]證實在雌激素誘導的子宮蛻膜化過程中,當成纖維細胞分化為成熟的蛻膜上皮細胞后開始表達CSTB,并刺激血管生成,Abdulkhalikova等[18]研究證實肥胖婦女減肥后可引起子宮內膜退化,CSTB表達增高,本研究亦證實在成人食管和喉粘膜中僅分化中晚期細胞表達CSTB。說明在機體相關組織或細胞中CSTB的表達受分化發(fā)育壓力的調節(jié)。本研究證實癌旁肝組織中,存在炎癥促進CSTB表達現(xiàn)象。同時,發(fā)現(xiàn)人食管鱗狀細胞癌組織等不表達或低表達CSTB,但體外人工培養(yǎng)的食管鱗狀細胞癌Eca109細胞株等則大量表達CSTB,預示特定腫瘤細胞內CSTB的表達受炎癥或營養(yǎng)等因素影響會發(fā)生變化。致體外培養(yǎng)的相關癌細胞株與患者體內癌細胞的生物學行為有可能不一致,相關體外實驗結果難以反映體內真實情況。

本研究證實人體實體癌組織表達CSTB存在失調現(xiàn)象。癌喉鱗狀細胞癌、食管鱗狀細胞癌及胃腺癌組織CSTB的表達顯著下調,預示相關癌細胞發(fā)生在分化發(fā)育早期,腫瘤微環(huán)境中的相關組織蛋白酶缺乏CSTB抑制,相關細胞分裂速度較快[19],易向周邊侵襲,并經(jīng)淋巴結轉移[20-21],部分癌組織表達CSTB,可能與局部炎癥,或細胞密度過大,營養(yǎng)匱乏致相關癌細胞衰退有關;胃腺癌旁粘膜固有層中胃底腺細胞可大量表達CSTB,胃癌組織中隨胃底腺細胞減少,致胃癌組織表達CSTB下調,體外培養(yǎng)的相關胃癌細胞株也僅表達的低水平的CSTB,說明胃腺癌主要發(fā)生在胃底腺細胞未成熟階段;肺鱗狀細胞癌、膀胱移行細胞癌及結腸腺癌組織CSTB的表達顯著上調,可能與癌組織局部炎癥等有關;肝癌旁炎性灶、肝癌組織及體外培養(yǎng)肝癌細胞株均高表達CSTB,可能與炎癥相關。由于CSTB為多功能分子,既具有抗炎作用,但又可增強癌細胞活性和壽命[22],促進組織血管生成[17],預示可增強相關癌細胞耐藥性[23]。若通過CSTB作用的添加或拮抗方式來研發(fā)相關腫瘤治療方法,必須依據(jù)特定腫瘤CSTB的表達特征、對相關腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體影響等進行綜合考慮。