徐國佳,蔣欣,夏濱,斯陸勤,黃建耿,李丹,張永軍

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院,石河子 832003;2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,石河子 832008;3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,武漢 430030;4.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430022;5.北京大學(xué)深圳醫(yī)院藥學(xué)部,深圳 518000;6.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院,石河子 832099)

托伐普坦(tolvaptan,TVP)是由大冢制藥株式會社研發(fā)的首個新型口服非肽類選擇性抗利尿激素V2受體拮抗劑,2009年美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)用于高容性和等容性低鈉血癥的治療,包括充血性心力衰竭、肝硬化和不適當(dāng)抗利尿激素綜合征等引起的過量水潴留[1,2]。與傳統(tǒng)利尿劑不同,托伐普坦通過競爭性阻斷精氨酸抗利尿激素與腎臟集合管上的抗利尿激素V2受體結(jié)合,抑制水通道蛋白2的激活,從而使V2受體介導(dǎo)的腎臟水重吸收降低,增加游離水的排泄而不損失電解質(zhì)或腎功能惡化,從而達到降低容量負荷且有效糾正低鈉血癥[3]。此外,美國、日本等國家除了上述適應(yīng)證外還被批準(zhǔn)用于常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)的治療。然而,美國FDA發(fā)布托伐普坦在治療ADPKD患者過程中存在潛在的致命肝損傷的風(fēng)險[4]。

托伐普坦在體內(nèi)主要通過肝臟中CYP3A4代謝酶進行生物轉(zhuǎn)化,可降解形成多種結(jié)構(gòu)相似的代謝物,如氧化、羥基化和羧基化等代謝產(chǎn)物。托伐普坦口服后可迅速從腸道吸收,絕對生物利用度約56%,與血漿蛋白結(jié)合率高達98%,其清除主要發(fā)生在糞便中,僅<1%以原型從腎臟排泄[5]。目前,關(guān)于托伐普坦的研究主要集中在托伐普坦在血漿中含量測定方面,例如HOSHIKAWA等[6]和JIANG等[7]采用LC-MS/MS法測定了人血漿中的托伐普坦及2或5種代謝物的含量;FURUKAWA等[8]也通過LC-MS/MS測定了大鼠血清中托伐普坦及其9種I相代謝物的藥動學(xué)。然而,關(guān)于托伐普坦代謝物的定性分析幾乎沒有報道,僅MAZZARINO等[9]通過構(gòu)建人肝微粒體與各種代謝酶共孵育模型從體外闡述托伐普坦的I相和II相代謝譜,分離和鑒定出20種托伐普坦代謝物。筆者未檢索到體內(nèi)托伐普坦代謝物譜研究報道,托伐普坦的體內(nèi)代謝過程亟需進一步研究。

近年來,高分辨質(zhì)譜由于具有快速、靈敏、專屬的特點,可廣泛篩查出預(yù)期和未預(yù)期的微量代謝物,極大地提升了代謝產(chǎn)物鑒定效率,已成為藥物化學(xué)成分及其體內(nèi)代謝過程研究的利器[10]。例如,超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatograph-quadrupole-exactive orbitrap high-resolution mass spectrometry,UFLC-Q-exactive orbitrap MS)技術(shù),具有高分辨率、高選擇性、高準(zhǔn)確度和精確的結(jié)構(gòu)表征,即使在沒有對照品的情況下,對復(fù)雜基質(zhì)中的微量代謝產(chǎn)物和非目標(biāo)物的分析和鑒定均有良好效果[11]。因此,本研究作者采用UFLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù),系統(tǒng)分析大鼠血漿、尿液和糞便中托伐普坦的代謝產(chǎn)物,探究托伐普坦在大鼠體內(nèi)的代謝途徑,以期為探究托伐普坦的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 托伐普坦原料藥(含量≥99%)由武漢友聯(lián)述康醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供;聚維酮K29/32和羥丙甲基纖維素分別購于美國國際特品公司和上海振興化工有限公司;甲醇和乙腈(色譜級)購于美國Fisher Scientific公司;其他常用分析純規(guī)格試劑購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

UFLC超快速液相色譜(日本Shimadzu公司);Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);MDF-U53V低溫保存箱(日本SANYO公司);MS105DU 型電子天平(美國Mettler Toledo公司,感量:0.01 mg);SPD1010真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1托伐普坦對照品溶液 精密稱取托伐普坦原料藥,用甲醇溶解得到1 mg·mL-1托伐普坦儲備液后,再用50%甲醇逐級稀釋為100 ng·mL-1的對照品溶液,用于UFLC-Q-Exactive Orbitrap分析。

1.2.2托伐普坦固體分散體溶液 以1：2比例精密稱取托伐普坦原料藥和聚維酮K29/32,用無水乙醇充分溶解,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到托伐普坦固體分散體。精密稱取托伐普坦固體分散體粉末溶于羥丙甲纖維素溶液(1%)配成6 mg·mL-1托伐普坦固體分散體溶液。

1.2.3動物給藥及樣本處理 6～8周齡成年Sprague Dawley大鼠,體質(zhì)量(200±20 g),6只,購于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物中心。將大鼠置于代謝籠中,控制溫度為(25±2) ℃、光照(12 h光/暗周期)飼養(yǎng)1周,自由飲水,給藥前禁食12 h。按60 mg·kg-1灌胃給藥托伐普坦固體分散體溶液后,分別收集0、1、3、6 h的血液及0～24 h的尿液和糞便。

糞便自然干燥研磨成粉末,用乙腈超聲溶解,然后分別合并各時間點的血液、尿液和均質(zhì)化后的糞便,加入乙腈(1：5)沉淀蛋白,4 ℃,15 000 r·min-1離心10 min后,取上清液于45 ℃條件下?lián)]干,然后再加入50%甲醇復(fù)溶100 μL,離心后上清液用于檢測。

1.2.4檢測條件 色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18Column(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,Waters Co.,Milford,MA,USA);流動相A:水(含0.1% 甲酸),流動相B:乙腈(含0.1%甲酸);柱溫:40 ℃;梯度洗脫程序如下:0.01～12.00 min 30%→40% B;12.00～18.00 min 40%→70% B;18.00～18.01 min 70%→95% B;18.01～20.00 min 95% B;20.00～20.01 min 90%→30% B;20.01～22.00 min 30% B;流速:0.3 mL·min-1;進樣體積:10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式監(jiān)測;毛細管溫度:320 ℃;電噴霧電壓:4 500 V;輔助氣流速:10 arb;掃尾氣流速:3 arb;鞘氣流速:35 arb;碰撞能量:10/15/25 V;掃描范圍:m/z50～1 000 Da(全掃)。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 采用Xcalibur 2.0版軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司)采集和處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)精確分子質(zhì)量、元素組成、二級碎片離子、保留時間和可能發(fā)生反應(yīng)信息篩選出潛在代謝物,用Chemdraw 19.0中的Clog P值對異構(gòu)體進行了表征,Clog P較高的代謝物通常保留時間較長[12]。然后,與之前發(fā)表的文獻[9]進行比較,分析鑒定出以前未檢測到的新代謝物。

2 結(jié)果

2.1托伐普坦質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 在ESI正離子模式下,托伐普坦的碎片離子和裂解模式信息,如圖1所示。托伐普坦保留時間為14.49 min,母離子[M+H]+為m/z449.1621(C26H25ClN2O3),二級質(zhì)譜碎片中m/z252處有最高響應(yīng)豐度,這是苯并氮雜環(huán)和其余部位之間的酰胺鍵斷裂,導(dǎo)致形成豐度最高的碎片離子m/z252。在更高碰撞能下,m/z119處也檢測到對應(yīng)于甲基苯甲酰胺部位裂解的碎片離子。

圖1 托伐普坦的碎片離子和裂解模式信息Fig.1 Fragmentation ion and fragmentation pattern information of tolvaptan

2.2托伐普坦體內(nèi)代謝物分析 對大鼠給藥前后的血漿、尿液和糞便進行正離子模式下分析,結(jié)合精確分子質(zhì)量、保留時間、二級碎片離子、Clog P值等參數(shù),共初步鑒定出35種代謝物,代謝產(chǎn)物提取離子流色譜圖見圖2,具體質(zhì)譜信息見表1。

表1 托伐普坦在大鼠血漿、尿液、糞便中的代謝產(chǎn)物Tab.1 Metabolites of tolvaptan in plasma,urine and feces of rat

圖2 托伐普坦代謝產(chǎn)物提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of tolvaptan metabolites

M1(tR=1.63 min)和M2(tR=2.06 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z347.115 9和m/z347.115 2,推測其分子式為C18H19ClN2O3。二級質(zhì)譜碎片中m/z252處沒有代表性的碎片離子,而m/z134處有最高響應(yīng)豐度,可能是由二級碎片m/z252中甲基苯甲酰胺部位水解所得;根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰推測苯并氮雜環(huán)還可能發(fā)生羥基化,可推測其為托伐普坦的酰胺鍵水解及羥基化產(chǎn)物。

M3(tR=2.14 min),M4(tR=2.66 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z389.125 9和m/z389.126 0,推測其分子式為C20H21ClN2O4。比酰胺鍵水解羥基化代謝物(M1和M2)高出42 Da,在m/z176、196、347處存在碎片離子,m/z176可能是在特征碎片離子m/z134上發(fā)生乙?；?推測兩者均為托伐普坦的酰胺鍵水解羥基化乙?；x物。

M5(tR=2.73 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z363.110 2,推測其分子式為C18H19ClN2O4。比托伐普坦酰胺鍵水解代謝物(M8)高32 Da。m/z134、212處存在碎片離子,表示甲基苯甲酰胺部位的水解和苯并氮雜環(huán)上有修飾。32 Da的差異可能是由于兩個羥基的存在或苯并氮雜環(huán)的水解羧基化所致,由于保留時間和文獻中報告的數(shù)據(jù),第二種解釋似乎更有可能[8,13],推測其為托伐普坦的酰胺鍵水解及苯并氮雜環(huán)水解羧基化代謝物。

M6(tR=2.74 min)和M7(tR=3.32 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z345.099 5和m/z345.099 9,推測其分子式為C18H17ClN2O3。比酰胺鍵水解及羥基化代謝物(M1和M2)少2 Da,且在m/z134處存在碎片離子,推測兩者均為托伐普坦的酰胺鍵水解羥基化脫氫代謝物。

M8(tR=3.33 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z331.120 3,推測其分子式為C18H19ClN2O2。在m/z134(而不是m/z252)處存在碎片離子,表示甲基苯甲酰胺部位發(fā)生水解,推測其為托伐普坦的酰胺鍵水解代謝物。M9(tR=3.85 min)、M12(tR=4.59 min)、M15(tR=4.85 min)和M28(tR=10.76 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z481.153 2、m/z481.152 7、m/z481.152 2和m/z481.151 5,推測其分子式為C26H25ClN2O5。比托伐普坦高32 Da,可能發(fā)生二羥基化。M9,M12和M15在m/z178、196、268處存在碎片離子信息,表明苯并氮雜環(huán)和甲基苯甲酰胺部位都有可能發(fā)生羥基化;而M28在m/z119、252處存在碎片離子,表明僅在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生修飾,由于該代謝物的保留時間高于羥基化代謝物,因此推測其可能在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生水解和羧化。

M10(tR=3.96 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z343.084 4,推測其分子式為C18H15ClN2O3,比酰胺鍵水解羥基化脫氫代謝物(M6、M7)低2 Da,推測其為托伐普坦的酰胺鍵水解羥基化二脫氫代謝物。

M11(tR=4.05 min)、M16(tR=4.99 min)、M20(tR=6.02 min)和M34(tR=16.49 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z479.137 1,m/z479.1363,m/z479.138 9和m/z479.136 7,推測其分子式為C26H23ClN2O5。M11、M16在m/z178、266、461處有碎片信息,推測在甲基苯甲酰胺部位發(fā)生羥基化脫氫且苯并氮雜環(huán)上也可能發(fā)生羥基化;M20中的碎片離子m/z268可能是在甲基苯甲酰胺部位發(fā)生羥基化,而碎片離子m/z345可能是甲基苯甲酰胺部位發(fā)生水解后且苯并氮雜環(huán)上發(fā)生羥基化脫氫,因此推測M20為二羥基化二脫氫代謝物;M34有m/z119、252特征碎片離子,推測僅在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生修飾,可能為羥基取代或發(fā)生羧化脫氫,結(jié)合保留時間考慮,M34可能是苯并氮雜環(huán)水解且發(fā)生羧化脫氫代謝物。

M13(tR=4.62 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z641.188 9,推測其分子式為C32H33ClN2O10。在m/z180、268、444、465處存在碎片離子,m/z465比母離子少176 Da,推測是母離子丟失一份葡萄糖醛酸基,綜合m/z268、444碎片離子信息,可能在m/z252特征結(jié)構(gòu)上發(fā)生羥基化和葡萄糖醛酸化。因此,推測其為托伐普坦的羥基化脫氫葡萄糖醛酸化代謝物。

M14(tR=4.67 min)、M19(tR=6.02 min)、M21(tR=8.29 min)、M23(tR=6.72 min)和M25(tR=7.32 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z477.121 3、m/z477.120 9、m/z477.121 0、m/z477.121 1和m/z477.120 7,推測其分子式為C26H21ClN2O5,這些代謝物在m/z133、210、266處都有碎片信息,表明在甲基苯甲酰胺部位發(fā)生羥基化脫氫且苯并氮雜環(huán)上也可能發(fā)生羥基化脫氫,推測它們?yōu)橥蟹テ仗苟u基化二脫氫代謝物。

M17(tR=5.06 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z329.104 8,推測其分子式為C18H17ClN2O2,M17比酰胺鍵水解代謝物(M8)低2 Da,推測其為托伐普坦酰胺鍵水解及苯并氮雜環(huán)上羥基脫氫代謝物。

M18(tR=5.34 min)、M29(tR=10.85 min)和M30(tR=12.54 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z463.141 7、m/z463.141 4和m/z463.141 4,推測其分子式為C26H23ClN2O4。M18在m/z135、266處有碎片離子,表明僅在甲基苯甲酰胺部位上發(fā)生羥基化脫氫;M29和M30在m/z119、252、445處收集到較強信號,表明甲基苯甲酰胺部位上沒有發(fā)生取代,可能在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生羥基化脫氫。

M22(tR=7.29 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z361.094 9,推測其分子式為C18H17ClN2O4,比酰胺鍵水解裂解苯并氮雜環(huán)羧化代謝物(M5)低2 Da,推測其為托伐普坦的酰胺鍵水解裂解苯丙氮雜環(huán)羧化脫氫代謝物。

M24(tR=7.77 min)、M26(tR=9.14 min)、M27(tR=9.46 min)和M35(tR=16.57 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z465.157 5、m/z465.157 1、m/z465.157 2和m/z465.157 5,推測其分子式為C26H25ClN2O4,比托伐普坦多16 Da,推測這些化合物可能是托伐普坦發(fā)生羥基化。M24、M26和M35在m/z178、196、252處存在特征性碎片離子,表明苯并氮雜環(huán)上發(fā)生羥基化;而M27在m/z211、252、447處存在碎片離子,表明僅在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生修飾,根據(jù)文獻和保留時間,推測其為托伐普坦苯并氮雜環(huán)發(fā)生水解及脫氫代謝物。

M31(tR=14.25 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z461.125 9,推測其分子式為C26H21ClN2O4,比托伐普坦羥基化代謝物少4 Da,在m/z119、252處存在特征碎片離子,推測其為托伐普坦的苯并氮雜環(huán)上發(fā)生羥基化二脫氫代謝物。

M32(tR=14.43 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z431.151 8,推測其分子式為C26H23ClN2O2,碎片離子m/z119、252為特征碎片離子,m/z178(非m/z180)可能是苯并氮雜環(huán)上的羥基脫水,推測其為托伐普坦脫水代謝物。

M33(tR=16.00 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z447.146 9,推測其分子式為C26H23ClN2O3,比托伐普坦少2 Da,沒有m/z135、268碎片信息,只檢測到m/z119、178、252碎片信息,表明僅苯丙氮雜環(huán)上的羥基發(fā)生了氧化,推測其為托伐普坦羥基氧化代謝物。

2.3托伐普坦的體內(nèi)代謝途徑分析 從大鼠血漿、尿液和糞便中共鑒定出35個代謝物,推測其相關(guān)的代謝途徑見圖3。通過與前期研究結(jié)果比對[9],代謝物M1、M2、M5、M8、M17、M22、M24、M26、M27、M28、M33、M34、M35為已發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物,另外22種化合物為本研究新發(fā)現(xiàn)的托伐普坦代謝物。

A.羥基化;B.羧基化;C.酰胺鍵水解;D.脫氫;E.雜環(huán)水解;F.脫水;G.乙?；?H.葡萄糖醛酸化。圖3 托伐普坦代謝途徑總結(jié) A.hydroxylation;B.carboxylation;C.amide bond hydrolysis;D.dehydrogenation;E.heterocyclic hydrolysis;F.dehydration;G.acetylation;H.glucuronidation.Fig.3 Summary of tolvaptan metabolic pathways

托伐普坦吸收入血后,在血液中檢測到23種代謝物,尿液中檢測到26種代謝物,糞便中檢測到30種代謝物。托伐普坦在血液、尿液和糞便中主要以羥基化、羧基化、水解、脫氫以及上述反應(yīng)組合的形式存在,而乙?；Y(jié)合產(chǎn)物只在尿液和糞便中檢測到,葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物只在尿液中檢測到。

3 討論

本研究采用UFLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS系統(tǒng)聯(lián)合Xcalibur 2.0版數(shù)據(jù)分析軟件,對托伐普坦在大鼠血漿、尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物進行全面鑒定與分析,結(jié)合相關(guān)文獻以及各代謝物的保留時間、精確相對分子質(zhì)量和特征碎片離子分析,共鑒定出35種代謝物,其中在血漿中檢測到23種,尿液中檢測到26種、糞便中檢測到30種,為托伐普坦的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究表明,托伐普坦在大鼠體內(nèi)的半衰期為1.6～2.5 h[8]。為了保證在實驗過程中收集更多的代謝產(chǎn)物,血漿樣品的收集時間點選定為0、1、3、6 h這4個時間點。藥物進入體內(nèi)后,在多種藥物代謝酶的生物轉(zhuǎn)化下,化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,由無藥理活性轉(zhuǎn)化為有藥理活性或毒性代謝物。CYP3A4和CYP3A5代謝酶為托伐普坦的主要代謝酶[9,14]。本研究發(fā)現(xiàn)托伐普坦在大鼠體內(nèi)經(jīng)過CYP3A4和CYP3A5代謝酶生成包括不同位置的羥基化、羧基化、水解、脫氫以及上述反應(yīng)組合的I相代謝物,然后通過血液循環(huán)運輸至各個組織發(fā)揮其藥理作用。有研究發(fā)現(xiàn)單羥基代謝物具有相對較弱的V2受體拮抗活性,可能有助于托伐普坦的利尿作用[15];而代謝物M34是在人血漿中檢測到濃度最高的托伐普坦代謝物,它無利尿作用,最近有報道發(fā)現(xiàn)代謝物M28和M34通過抑制肝臟轉(zhuǎn)運蛋白和膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白可能導(dǎo)致肝臟疾病[7,16]。本研究發(fā)現(xiàn),托伐普坦的II相代謝產(chǎn)物乙?；Y(jié)合產(chǎn)物只在尿液和糞便中檢測到,葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物只在尿液中檢測到,主要可能與乙酰化結(jié)合產(chǎn)物和葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物的高水溶性相關(guān)[17]。此外,由于葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物通過膽汁排泄后,容易被腸道菌群水解[18],這也可能是托伐普坦葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物只在尿液中檢測到的原因之一。

與MAZZARINO等[9]的體外研究相比,本研究從大鼠體內(nèi)鑒定出22種未報道的代謝物。值得注意的是,雖在體內(nèi)鑒定出II相代謝物,但托伐普坦在體內(nèi)的代謝主要以I相不同位置的羥基化、羧基化和開環(huán)裂解為主,這可能是托伐普坦生成具有較強水溶性代謝物主要從糞便中消除的一個原因。另外,托伐普坦是一個具有手性季碳中心的外消旋體,它的羥基化代謝物也具有手性。本研究建立了一種簡便、選擇性高的分析方法可以將同分異構(gòu)體較好地分開,但對于其確切的結(jié)構(gòu)還需借助手性柱才能確定具體結(jié)合位點。在分析鑒定過程中發(fā)現(xiàn)托伐普坦具有多組同分異構(gòu)體代謝產(chǎn)物,母體藥物本身結(jié)構(gòu)含有氯元素會產(chǎn)生同位素峰,在分離和鑒定過程中藥物代謝物通過高壓電離進入真空區(qū)域時可能發(fā)生離解,產(chǎn)生與藥物母體離子相同的源內(nèi)碎片以及相似的保留時間造成假陽性代謝物[19-20],因此,在分析鑒定過程中要特別注意利用保留時間和特征碎片離子信息來識別假陽性峰。

本實驗從體內(nèi)代謝過程的角度研究了托伐普坦在大鼠體內(nèi)的代謝情況,對托伐普坦在體內(nèi)的代謝途徑和代謝時的相互轉(zhuǎn)化進行了初步推測,為托伐普坦的藥效和毒性物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定的依據(jù),對保障托伐普坦臨床使用的安全性和有效性具有重要意義。