劉雨彤,黃勇,毛洪運,張童,崔杰,李夢雨,候蓉,鄭云楓,華永慶,4

(1.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學藥學院,南京 210023;3.貴州廣濟堂健康藥業(yè)有限公司,貴陽 550000;4.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,南京 210023)

鹿膠為鹿科動物馬鹿C.elaphus及梅花鹿C.nippon的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。鹿膠作為補益藥使用已有千年歷史,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就稱之為上品。《本草綱目》中記載鹿 皮“補氣;澀精;斂瘡”?！端拇ㄖ兴幹尽分杏涊d鹿皮“能補氣,澀虛滑。治婦女白帶,血崩不止,腎虛滑精;涂一切瘡”。《北京市中藥炮制規(guī)范》中描述“鹿皮膠味咸,性溫,歸肝、腎經(jīng),補氣,澀虛精,強筋健骨”?！顿F州省中藥、民族藥飲片標準》中敘述“鹿皮膠性偏于溫,既能補陽,又可滋陰補血、止血,同樣適用于血虛證、出血證”。

鹿皮在歷史記載中皆為上等之品,其資源有限,使得其逐漸退出熬膠主流原料的舞臺[1]。近年來隨著鹿養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展[2],鹿皮、鹿角、鹿血等多種鹿制品重新走入大眾視野?；趥鹘y(tǒng)用法,鹿膠的應(yīng)用最為廣泛。研究表明,鹿膠可改善多種血虛動物模型的血虛癥狀[3-4]。目前對于采用驢皮熬制的阿膠的研究較為豐富,提高免疫力、補血止血和抗疲勞[5]、抗衰老[6]等作用被普遍認可。而傳統(tǒng)認為更為名貴的膠類中藥鹿膠,其是否具有類似的補益作用,以及是否更具特點仍缺乏研究支撐。

斑馬魚自20世紀90年代引入我國實驗室,現(xiàn)已成為研究中藥整體功效的新興模式生物之一。斑馬魚具有個體小、易飼養(yǎng)、生殖能力強等特點,與人類基因的相似度可達70%[7],且斑馬魚的血液、骨骼等系統(tǒng)及生理功能方面與人體存在眾多共同特點?；诎唏R魚造模方便、易于觀察等特點,本研究采用斑馬魚疾病模型對鹿皮膠的補血、抗骨質(zhì)疏松和抗衰老作用進行探索,為鹿膠的應(yīng)用提供支撐。

1 材料與方法

1.1實驗動物與儀器試劑

1.1.1實驗動物 3個月齡斑馬魚AB品系,購自于南京堯順禹生物技術(shù)有限公司。斑馬魚飼養(yǎng)條件:晝夜節(jié)律為晝：夜=14 h：10 h;溫度(28±0.5)℃。飼養(yǎng)環(huán)境嚴格按照《江蘇省地方標準 實驗用斑馬魚飼育技術(shù)條件》。實驗流程嚴格按照《實驗動物管理與使用指南》執(zhí)行。斑馬魚適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后可以交配產(chǎn)卵,產(chǎn)卵當天收集斑馬魚受精卵。

1.1.2儀器與試劑 鹿膠,批號:2018103,購自貴州廣濟堂藥業(yè)有限公司;阿膠,批號:1510012,購自山東東阿阿膠股份有限公司;草甘膦(glyphosate,Gly),批號:20200317B,購自山東三農(nóng)生物科技有限公司;Bcl-2抗體,貨號:ab32124,購自Abcam公司;GAPDH,貨號:10494-1-P,購自美國proteiontech;動物基因組DNA快速抽提試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,貨號:D0065S、P0015L,購自上海碧云天生物有限公司;中性樹脂,批號:70120150,Biosharp;鏈霉蛋白酶E,批號:721J041,購自北京索萊寶科技有限公司;二甲亞砜(dinethylsulfoxide,DMSO),批號:C12804515,購自上海麥克林生化科技有限公司;潑尼松龍(prednisolone,Pred)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、吖啶橙、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、鈣黃綠素,批號:T20J7H9291、S51140、R20290、A12D11H134386、K22A9C68341,均購自上海源葉生物有限公司;RNA isolater Tolal RNA Extraction Reagent、HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix,貨號:R401-01-AA、R223-01、Q111-02,均購自南京諾唯贊生物科技有限公司;引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)(型號:ZF-104),南京一樹梨花生物科技有限公司;人工氣候培養(yǎng)箱(型號:RGL-P160B),合肥達斯卡特生物科技有限公司;體視熒光顯微鏡(型號:M205FA),德國Leica公司;實時熒光定量PCR儀(型號:QuantStudio 6 Flex),Applied Biosystems;多功能酶標儀(型號:Synergy2),Bio-Tek;臺式冷凍離心機(型號:54178),eppendorf公司;電泳儀(型號:mini-protean powerpack basic)、數(shù)字化凝膠成像工作站(型號:ChemiDocTMXRS+),美國BIO-RAD公司。

1.2實驗方法

1.2.1分組及給藥 Gly誘導斑馬魚紅細胞異常實驗使用3月齡成魚,分為6組:空白對照組、模型對照組(100 μmol·L-1Gly)、阿膠組(0.1 mg·mL-1)和鹿膠小、中、大劑量組(0.05、0.1、0.2 mg·mL-1),每組10尾。實驗前2 d停止喂食,模型對照組予以模擬海水配置的100 μmol·L-1Gly溶液,各藥物組在予以Gly造模的同時給與藥物,給藥48 h。

MTX誘導斑馬魚幼魚造血異常實驗使用2 dpf斑馬魚,組別設(shè)置與Gly實驗相同,模型對照組給予600 μg·mL-1MTX,每組20尾,給藥組在給予模型藥的同時給予對應(yīng)濃度的藥物,給藥24 h。

Pred誘導斑馬魚骨形成抑制實驗使用健康的3 dpf斑馬魚,分為6組:空白對照組(0.2%DMSO)、模型對照組(25 μmol·L-1Pred)、阿膠組(0.04 mg·mL-1)、鹿膠小、中、大劑量組(0.01、0.02、0.04 mg·mL-1),置于6孔板中,每孔給予3 mL培養(yǎng)基。從3 dpf開始,空白對照組換為含有0.2%DMSO的胚胎培養(yǎng)基,模型對照組及其他給藥組換為含0.2%DMSO的25 μmol·L-1Pred的胚胎培養(yǎng)基。從5 dpf開始給藥,空白對照組和模型對照組繼續(xù)給予對應(yīng)的胚胎培養(yǎng)基不變,各給藥組在給予模型藥的同時給予對應(yīng)濃度的藥物。每天半數(shù)換液,連續(xù)給藥4 d。

DBP誘導斑馬魚眼部細胞凋亡實驗選取健康的30 hpf斑馬魚胚胎,隨機分為6組:空白對照組、模型對照組(10 μmol·L-1DBP)、阿膠組(0.5 mg·mL-1)、鹿膠小、中、大劑量組(0.02、0.1、0.5 mg·mL-1),每組20尾。模型對照組給予10 μmol·L-1DBP,各給藥組在給予DBP的基礎(chǔ)上分別給予對應(yīng)濃度的藥物,置于6孔板中,體系3 mL,培養(yǎng)18 h。

1.2.2姬姆薩染色實驗 斑馬魚成魚經(jīng)給藥后,麻醉斷尾取血。斑馬魚尾鰭向前約1/6處剪斷,將血迅速在玻片上推開,甲醇固定5 min。固定結(jié)束后,傾去甲醇,姬姆薩染色15 min,三蒸水沖洗30 s。載玻片自然風干后,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察斑馬魚紅細胞形態(tài)。

1.2.3鈣黃綠素染色實驗 將9 dpf的斑馬魚置于培養(yǎng)基中靜置1 h,0.2%鈣黃綠素(pH值=7)溶液避光孵育1 h,培養(yǎng)基漂洗3次,再次靜置1 h。用0.04 g·L-1三卡因?qū)Π唏R魚進行麻醉,于體視熒光顯微鏡下成像。

1.2.4吖啶橙染色實驗 給藥18 h后,吸盡胚胎培養(yǎng)基,加入0.5 g·L-1鏈酶蛋白酶E溶液置于人工氣候箱中脫膜15 min。當觀察到胚胎多數(shù)已脫去其卵膜時,加入胚胎培養(yǎng)液終止脫膜。漂洗2次,吸盡胚胎培養(yǎng)液,給予5 mg·L-1的AO染色溶液避光染色1 h。染色結(jié)束后漂洗3次,用0.04 g·L-1MS-222麻醉胚胎5 min,吸取幼魚置于載玻片中央,于體視熒光顯微鏡下觀察凋亡眼部細胞并攝相。

1.2.5qRT-PCR檢測實驗 使用Trizol提取RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。按照試劑盒說明書,構(gòu)成20 μL反應(yīng)體系進行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后以GAPDH作為內(nèi)參,按照2-相對定量計算公式得到相對定量結(jié)果。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6Western blotging檢測實驗 給藥18 h后,脫膜并提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,加入SDS-PAGE上樣緩沖液變性。使用10%PAGE膠電泳分離蛋白,分離后的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,5%BSA封閉1 h,加入Bcl-2和GAPDH抗體孵育過夜,HRP標記的二抗室溫孵育1 h,ECL發(fā)光法顯影成像。

1.2.7圖片采集及數(shù)據(jù)處理 Gly實驗采用明美軟件進行圖片采集,鈣黃綠素染色實驗和吖啶橙染色實驗采用徠卡顯微鏡成像軟件進行采集圖像。利用Image Pro Plus軟件對圖片進行處理并獲取數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1鹿膠對Gly誘導的斑馬魚紅細胞損傷模型的影響 姬姆薩染色實驗表明,經(jīng)Gly處理后紅細胞出現(xiàn)微核、細胞核變寬和空泡現(xiàn)象(圖1)。與空白對照組相比,Gly組紅細胞核異常率顯著增加,細胞核面積顯著變小,細胞核長度顯著變短(P<0.01)(圖2)。與Gly組相比,阿膠組和鹿膠小中大劑量組核異常率顯著降低(圖2),鹿膠中劑量可顯著改善細胞核面積,阿膠組和鹿膠中小劑量組細胞核長度顯著改善(P<0.01)(圖2)。

A.正常形態(tài),形態(tài)橢圓,核位于細胞中央;B.微核;C.細胞核變寬;D.核內(nèi)空泡。圖1 Gly造模后斑馬魚紅細胞形態(tài)(×400) A.normal form,oval shape,nucleus in the centre of the cell;B.micronucleus;C.widening of the nucleus;D.vacuole in the nucles.Fig.1 Morphology of zebrafish erythrocytes after Gly moulding(×400)

A.斑馬魚紅細胞核異常率(n=10);B.斑馬魚紅細胞核面積與細胞核長度的統(tǒng)計(n>10 000)。①與空白對照組比較,t=-4.846～17.499,P<0.01;②與Gly組比較,t=-24.007～4.426,P<0.01。圖2 鹿膠對Gly誘導的斑馬魚紅細胞損傷的影響A.zebrafish erythrocyte nuclear abnormality rate (n=10);B.statistics of zebrafish erythrocyte nuclear area and nucleus length(n>10 000).①compared with blank control group,t=-4.846-17.499,P<0.01;②compared with Gly group,t=-24.007-4.426,P<0.01.Fig.2 Effect of Cervi Colla on Gly-induced erythrocyte damage in

2.2鹿膠對MTX誘導的斑馬魚幼魚造血功能損傷的作用 與空白對照組相比,MTX組斑馬魚幼魚造血因子GATA1和SCL表達顯著降低,表明造模成功(P<0.05,P<0.01)。與MTX組相比,阿膠組,鹿膠小、中、大劑量組GATA1和SCL的表達升高,表明鹿膠可促進斑馬魚幼魚造血功能(P<0.05)(圖3)。

A.鹿膠對斑馬魚幼魚GATA1表達的影響;B.鹿膠對斑馬魚幼魚SCL表達的影響;①與空白對照組比較,t=3.046,P<0.01;②與MTX組比較,t=-9.050～2.404,P<0.05;③與空白對照組比較,t=5.464,P<0.05。圖3 鹿膠對MTX誘導的斑馬魚幼魚造血功能損傷的影響A.effect of Cervi Colla on GATA1 expression in juvenile zebrafish;B.effect of Cervi Colla on SCL expression in juvenile zebrafish;①compared with blank control group,t=3.046,P<0.01;②compared with MTX group,t=-9.050～2.404,P<0.05;③Compared with blank control group,t=5.464,P<0.05.Fig.3 Effect of Cervi Colla on MTX-induced hematopoietic impairment in juvenile zebrafish

2.3鹿膠對Pred誘導的斑馬魚骨形成抑制的改善作用 鈣黃綠素染色結(jié)果如圖4所示,與空白對照組比較,Pred組斑馬魚幼魚第一椎骨面積顯著降低,表明Pred誘導的斑馬魚幼魚骨形成抑制模型造模成功(P<0.05)。與Pred組相比,鹿膠小中大劑量組均可促進斑馬魚幼魚第一椎骨形成,具有顯著差異,且第一椎骨面積呈現(xiàn)劑量依賴性,表明鹿膠可改善Pred誘導的斑馬魚幼魚骨形成抑制,具有健骨功效(P<0.01)。

①與空白對照組比較,t=6.053,P<0.05;②與Pred組比較,t=-7.664～-4.614,P<0.01。圖4 鹿膠對Pred誘導的斑馬魚幼魚骨形成抑制的影響①compared to blank control group,t=6.053,P<0.05;②compared to Pred group,t=-7.664--4.614,P<0.01.Fig.4 Effect of Cervi Colla on Pred-induced inhibition of bone formation in juvenile

PCR結(jié)果表明,與空白對照組相比,Pred組ALP和Runx2a表達顯著降低。與Pred組比較,鹿膠低中高劑量組均可使ALP、Runx2a表達增加,且中高劑量組促進作用最為顯著(P<0.05,P<0.01)(圖5 AB)。結(jié)果表明鹿膠可促進骨形成中關(guān)鍵基因表達,發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

A.鹿膠對斑馬魚幼魚ALP表達的影響;B.鹿膠對斑馬魚幼魚Runx2a表達的影響。①與空白對照組比較,t=6.330～8.728,P<0.05;②與Pred組比較,t=-17.634～-3.803,P<0.05;③與Pred組比較,t=-7.447,P<0.01。圖5 鹿膠對斑馬魚幼成骨相關(guān)基因表達的影響A.effect of Cervi Colla on ALP expression in juvenile zebrafish;B.effect of Cervi Colla on Runx2a expression in juvenile zebrafish.①compared with blank control group,t=6.330-8.728,P<0.05;②compared with Pred group,t=-17.634--3.803,P<0.05;③compared with the group,t=-7.447,P<0.01.Fig.5 Effect of Cervi Colla on the expression of osteogenesis-related genes in juvenile

2.4鹿膠對DBP誘導的眼部細胞凋亡模型斑馬魚的作用 吖啶橙染色結(jié)果如圖6所示,與空白對照組相比,DBP組斑馬魚幼魚眼部凋亡細胞數(shù)顯著增加,表明DBP誘導的斑馬魚幼魚眼部凋亡模型造模成功(P<0.01)。與DBP組相比,阿膠組和鹿膠小中大劑量均可明顯改善斑馬魚幼魚眼部凋亡細胞數(shù),且鹿膠組眼部凋亡數(shù)呈現(xiàn)劑量依賴性,表明鹿膠具有抗斑馬魚幼魚眼部凋亡作用(P<0.01)。

①與空白對照組比較,t=-4.655,P<0.01;②與DBP組比較,t=3.986～5.456,P<0.01。圖6 鹿膠對DBP誘導的斑馬魚幼魚眼部凋亡的影響①compared to blank control group,t=-4.655,P<0.01;②compared to DBP group,t=3.986-5.456,P<0.01.Fig.6 Effect of Cervi Colla on DBP-induced ocular apoptosis in juvenile

Western blotting結(jié)果如圖7所示,與空白對照組相比,DBP組Bcl-2的表達顯著降低(P<0.01)。與DBP組相比,給予鹿膠后,Bcl-2的表達呈現(xiàn)劑量依賴性上升,且大劑量組具有顯著差異(P<0.01)。PCR結(jié)果如圖8所示,與空白對照組相比,DBP組線粒體DNA拷貝數(shù)顯著降低(P<0.01)。給予不同濃度的鹿膠后,線粒體DNA拷貝數(shù)增加,中高劑量組促進作用具有顯著差異(P<0.01)。表明鹿膠可通過增加線粒體DNA拷貝數(shù)改善斑馬魚幼魚的細胞凋亡。

①與空白對照組比較,t=9.364,P<0.01;②與DBP組比較,t=-19.582～-3.864,P<0.01。圖7 鹿膠促進抗凋亡因子Bcl-2的表達①compared to blank control group,t=9.364,P<0.01;②compared to DBP group,t=-19.582--3.864,P<0.01.Fig.7 Cervi Colla promoted the expression of the anti-apoptotic factor Bcl-2

①與空白對照組比較,t=23.059,P<0.01;②與DBP組比較,t=-13.506～-5.922,P<0.01。圖8 鹿膠對DBP誘導的斑馬魚幼魚的線粒體拷貝數(shù)的影響①compared to blank control group,t=23.059,P<0.01;②compared to DBP group,t=-13.506--5.922,P<0.01.Fig.7 Effect of Cervi Colla on DBP-induced mitochondrial copy number in juvenile

3 討論

膠類中藥是以動物的皮、角等原料制成的固體膠,味甘、性平,具有滋陰、補血、止血、潤燥等功效,臨床用于血虛、陰虛和出血等證,在古方中大多與其他藥物配伍使用,多為補虛的要藥[8]。研究表明,膠類中藥對血液系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病有較好的補益作用。血虛證是血液虧虛、臟腑百脈失養(yǎng)而表現(xiàn)全身虛弱的證候,是臨床中的常見病癥,其發(fā)生多由生血乏源、失血過多等引起。阿膠等膠類中藥可通過促進紅細胞生成的關(guān)鍵因子生成等方面促進造血功能,改善血虛癥狀,發(fā)揮補益作用。本研究采用Gly誘導斑馬魚成魚紅細胞損傷模型,探究鹿膠對Gly造成的紅細胞損傷的緩解作用。研究表明,Gly會誘發(fā)斑馬魚外周血紅細胞的遺傳損傷[9]。本研究實驗結(jié)果表明,鹿膠可改善Gly造成的斑馬魚紅細胞形態(tài)變化,其改善血虛作用可能與減少紅細胞損傷有關(guān)。MTX作為一種抗腫瘤藥物,可造成斑馬魚紅細胞造血功能損傷。斑馬魚與人類造血過程近似,其造血過程分為原始造血和定向造血[10]。SCL基因在原始造血中調(diào)控造血功能[11],GATA-1是調(diào)控紅細胞發(fā)育的主要因子[12]。本研究實驗結(jié)果表明,鹿膠可提高造血因子SCL、GATA-1的表達,通過調(diào)節(jié)造血中關(guān)鍵基因表達改善斑馬魚造血功能。血虛的形成可能與多種因素相關(guān),鹿膠改善紅細胞形態(tài)和促進造血因子基因表達作用可能是其補血功效的現(xiàn)代藥理學基礎(chǔ),其作用的詳細機制仍需進一步研究。

骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)中歸為“骨痿、骨痹”,其病機以腎虛為主、脾虛為輔[13]。其治法以補腎健脾為代表。

本研究采用Pred誘導斑馬魚幼魚骨形成抑制模型,探究鹿膠抗骨質(zhì)疏松的補益作用。糖皮質(zhì)激素長期使用可引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生,ALP和轉(zhuǎn)錄因子Runx2在骨形成中發(fā)揮重要作用。實驗結(jié)果表明,鹿膠可顯著改善Pred導致的斑馬魚骨形成抑制,促進成骨相關(guān)基因ALP、Runx2a的表達。鹿膠可通過促進骨形成中關(guān)鍵因子的基因表達,發(fā)揮強筋健骨功效。

衰老是細胞和機體水平發(fā)生的功能退化的過程[14]?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗分姓J為衰老與腎虛密切相關(guān)。腎為先天之本,腎精氣虧虛容易導致心、肝、脾、肺虛。本研究采用DBP誘導斑馬魚幼魚眼部凋亡模型,探究鹿膠抗細胞凋亡的補益作用。DBP可誘導斑馬魚眼部細胞凋亡[15-16]。Bcl-2是抗凋亡蛋白,可抑制發(fā)育過程中的細胞凋亡[17]。本研究表明,鹿膠可顯著降低DBP誘導的斑馬魚幼魚眼部凋亡細胞數(shù),促進抗凋亡蛋白Bcl-2和線粒體DNA的表達。本研究提示,鹿膠可能通過促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達發(fā)揮抗衰老作用。

本研究利用多種斑馬魚模型探究鹿膠補益作用,結(jié)果表明其具有較好的補血、健骨、抗衰老等補益作用,為其廣泛應(yīng)用和深入研究提供依據(jù)。