杜建濤李 靖韓 非田 禹王 兵

(1.北京泰克美高新技術(shù)有限公司,北京 100160; 2.泰克美生物科技(喀左)有限公司,遼寧 喀左 122306)

隨著我國(guó)生豬養(yǎng)殖規(guī)?；M(jìn)程加快,越來(lái)越多的豬場(chǎng)糞污需要被集中處理。 無(wú)害化及資源化處理豬場(chǎng)糞水是我國(guó)政策鼓勵(lì)方向,也是養(yǎng)殖業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的途徑[1]。 豬場(chǎng)糞污常見(jiàn)的處理方式是將糞污進(jìn)行固液分離,糞液經(jīng)過(guò)厭氧發(fā)酵處理實(shí)現(xiàn)無(wú)害化后進(jìn)行儲(chǔ)存和資源化利用,糞渣則經(jīng)過(guò)堆漚形成有機(jī)肥或有機(jī)營(yíng)養(yǎng)土還田[2]。 糞液在厭氧處理過(guò)程中,糞污中有機(jī)污染物降解產(chǎn)生甲烷等氣體,而氮、磷、鉀等成份幾乎不變。 因此,豬場(chǎng)糞污沼液是一種含有豐富營(yíng)養(yǎng)和厭氧微生物的液體。研究表明,沼液廣泛應(yīng)用于灌溉、病蟲(chóng)害防治、浸種等方面,能夠有效提高農(nóng)作物產(chǎn)量、提高農(nóng)產(chǎn)品中有效成分的含量,減少病蟲(chóng)害等[3]。 也有研究表明使用沼液對(duì)土壤的改良具有一定效果[4]。

土壤中微生物是土壤的重要組成部分,其生物量、微生物種類(lèi)、組成等是衡量土壤質(zhì)量、土壤肥力和土壤健康與否的重要指標(biāo)[5]。 微生物菌群的組成和分布會(huì)直接影響土壤碳、氮循環(huán)及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和代謝[6]。

沼液還田會(huì)對(duì)土壤的營(yíng)養(yǎng)成分、理化性質(zhì)、機(jī)械組成、微生物菌群等產(chǎn)生一定的影響,進(jìn)而影響種植在土地上的作物的產(chǎn)量、品質(zhì)等方面[7]。 基于以上研究,本研究通過(guò)連續(xù)3 年的青儲(chǔ)玉米田沼液還田試驗(yàn),研究沼液還田對(duì)土壤養(yǎng)分、理化指標(biāo)及微生物菌群變化,以期為規(guī)模化豬場(chǎng)糞污科學(xué)、安全的資源化利用和化肥替代提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

青儲(chǔ)玉米地位于內(nèi)蒙古烏蘭察布市興和縣打拉基廟村,屬中溫帶大陸性季風(fēng)半干旱氣候,灘川地,平均溫度4.2 ℃,年積溫2 300 ℃,年降雨400 mm 左右,年平均蒸發(fā)量為2 036.8 mm,為年降雨量的5 倍。 青儲(chǔ)玉米試驗(yàn)田種植為一年一季,初始土壤類(lèi)型為沙壤土。 土壤初始有機(jī)質(zhì)16.7 g/kg、全氮0.93 g/kg、全磷0.8 g/kg、有效磷16.8 mg/kg、速效鉀59 mg/kg、全鹽量0.7 g/kg、pH 值為8.11。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)沼液來(lái)自?xún)?nèi)蒙古烏蘭察布大北農(nóng)農(nóng)牧食品有限公司興和分公司母豬場(chǎng)的儲(chǔ)存塘。 豬場(chǎng)糞污以水泡糞方式收集后,經(jīng)過(guò)固液分離、厭氧發(fā)酵和儲(chǔ)存塘處理實(shí)現(xiàn)無(wú)害化。 還田沼液COD 3 520 mg/L、總氮940 mg/L、全磷21.4 mg/L、氨氮837 mg/L、全鉀728 mg/L、全鹽量4 180 mg/L、pH 值8.0。 沼液通過(guò)預(yù)埋管道輸送至青儲(chǔ)玉米地。

試驗(yàn)前將土地地勢(shì)平整,選用種植習(xí)慣和管理方式一致的整塊地劃分為15 塊等面積區(qū)域,每塊區(qū)域長(zhǎng)20 m,寬10 m。 按照等量氮磷鉀施肥的原則設(shè)置5 組試驗(yàn)處理,分別是:空白對(duì)照組(CK)、化肥組(C1)、沼液與化肥1 ∶1 組(C2)、沼液與化肥4 ∶1 組(C3)和沼液組(C4)。 每個(gè)試驗(yàn)組(不同處理組)間設(shè)置了0.5 m 的隔離帶,每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。 基于青儲(chǔ)玉米氮磷鉀年需求量,在播種前10～15 d,按照總氮量25 kg/667m2、磷16 kg、鉀10 kg 比例對(duì)試驗(yàn)組進(jìn)行沼液和(或)化肥添加。 其中,氮肥的來(lái)源為尿素,磷肥采用過(guò)磷酸鈣,鉀肥則采用氯化鉀。 在青儲(chǔ)玉米生長(zhǎng)至11 ～12 片葉期追施沼液或尿素,按照各試驗(yàn)區(qū)域和試驗(yàn)方案計(jì)算各試驗(yàn)區(qū)所需的沼液用量,沼液或肥采用隨水灌溉的方式進(jìn)行施肥。

1.3 樣品采集及分析方法

在青儲(chǔ)玉米采收期進(jìn)行土壤樣品采集。 在各處理每個(gè)重復(fù)地塊分別以“S”形多點(diǎn)混合法采集5 處土壤10 ～20 cm 土樣,隨后將5 組、3 重復(fù)取樣點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行混合后,均勻分成兩份。 一份風(fēng)干后,用于檢測(cè)理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)[8～10],另一份置入封口袋中于-20 ℃低溫保存,用于檢測(cè)微生物指標(biāo)。

土壤機(jī)械組成檢測(cè)方式依據(jù)《LY/T 1225-1999 森林土壤顆粒組成(機(jī)械組成)的測(cè)定》,并按照美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)土壤質(zhì)地分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)土壤粒徑進(jìn)行分級(jí):黏粒(＜2 μm)、粉粒(2～50 μm)、極細(xì)砂粒(50 ～100 μm)、細(xì)砂粒(100～250 μm)、中砂粒(250～500 μm)、粗砂粒(500～1 000 μm)、極粗砂粒(1 000～2 000 μm)[11]。

微生物菌群法利用16S rRNA 測(cè)序方法:將土壤微生物樣本對(duì)其指定區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、文庫(kù)制備、文庫(kù)質(zhì)檢、定量,使用設(shè)定的TAG 序列進(jìn)行樣本區(qū)分。

采用Illumina Hiseq 2500 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,Hiseq/Miseq 測(cè)序得到的PE reads 根據(jù)overlap 關(guān)系,將測(cè)序所得的雙端序列拼接、過(guò)濾等得到優(yōu)化序列,基于優(yōu)化序列進(jìn)行OTU 聚類(lèi)分析和多樣指數(shù)分析。 將得到的OTU 聚類(lèi)分析結(jié)果,采用在線(xiàn)制圖工具,制成VENN 圖(網(wǎng)址http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013 和Origin 2021 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化

根據(jù)土壤的各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)化學(xué)指標(biāo)和土壤的機(jī)械結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果,如表1 所示。 施用不同比例化肥沼液均改變了土壤的理化指標(biāo)。 施用不同比例化肥沼液后,土壤中的有機(jī)質(zhì)由初始16.7 g/kg 提高至28.1 g/kg,其中C4 組有機(jī)質(zhì)含量增加了68.3%。 除CK 之外,土壤中的全氮的含量為C3＞C4＞C2＞C1,全磷則為C3＞C2＞C4＞C1,全氮和全氮含量在本試驗(yàn)中,與施肥處理方式關(guān)系不大,且不同處理之間差異不顯著。 不同的是,不同處理的速效鉀和有效磷含量與沼液的添加量呈正相關(guān)。 土壤中的可溶性全鹽量隨著沼液的添加增加呈現(xiàn)逐漸累積的現(xiàn)象。 與CK偏堿性土壤相比,施用沼液的各處理pH 呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),且沼液在施肥過(guò)程中所占比例越高,土壤pH 越低,其中全部施用沼液處理C4 的pH 為7.73。

表1 不同處理土壤理化指標(biāo)Table1 Soil physical and chemical indexes at sampling sites

結(jié)果表明,在不同的處理下,土壤的機(jī)械組成有一定的變化,其中黏粒、粉粒、極細(xì)砂粒和細(xì)砂在土壤中比例在CK 組最高,為91.0%,C1 組最低,為48.1%,隨著沼液的加入和化肥添加比例降低,C2、C3 和C4 中比例呈遞增趨勢(shì),分別為56.7%、64.1%和70.1%。 極粗砂和粗砂的比例是C1 最高,CK 和C4 組最低。 土壤顆粒組成以黏土、細(xì)粉粒和細(xì)砂粒組成,為黏質(zhì)砂壤土,土壤黏粒和粉粒所占比例越大,土壤結(jié)構(gòu)越好。 因此在種植青儲(chǔ)玉米過(guò)程中,僅施用化肥會(huì)造成土壤顆粒變大,而沼液在施肥過(guò)程中的添加比例越高,對(duì)土壤結(jié)構(gòu)改善效果越明顯。

2.2 沼液還田后對(duì)微生物菌群的影響分析

2.2.1 微生物群落的多樣性分析

通過(guò)對(duì) Chao1 指數(shù)和Observed_species 指數(shù)反映土壤微生物的豐度;通過(guò)分別對(duì)Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)的計(jì)算可以統(tǒng)計(jì)出微生物的多樣性估計(jì),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 微生物的豐度和多樣性指數(shù)分析Table 2 Analysis of microbial abundance and diversity index

從表2 可以看出,青儲(chǔ)玉米田地5 個(gè)土壤樣品Shannon 指數(shù)介于9～11 之間,說(shuō)明土壤中微生物菌群具有極高的多樣性,有利于土壤微生態(tài)的穩(wěn)定,對(duì)土壤中的碳循環(huán)、單循環(huán)及促進(jìn)作物對(duì)礦物質(zhì)吸收和利用。 經(jīng)處理后的4 個(gè)樣品與對(duì)照組相比,Shonnon 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Simpon 指數(shù)都有不同程度的增長(zhǎng),說(shuō)明土壤經(jīng)過(guò)處理后,群落的豐富度得到提升,可能是由于沼液中有比較豐富多樣的微生物群落,改變了土壤中的微生物多樣性。 根據(jù)表2 數(shù)據(jù)顯示,土壤中沼液添加比例越高,土壤中群落的豐富度越高,表明沼液中的厭氧微生物不會(huì)造成土壤的微生態(tài)環(huán)境破壞。 5 個(gè)樣品中的Coverage 指數(shù)值接近1,說(shuō)明序列被測(cè)出的概率很高,測(cè)序準(zhǔn)度可靠。

2.2.2 微生物群落組成

按照97%序列相似水平,利用QIIME 軟件包中的Uclust 方法進(jìn)行對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行OTU 聚類(lèi)分析。 基于Silva 參考數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)每個(gè)樣品的OTUs 進(jìn)行物種分類(lèi)學(xué)(Taxonomy)注釋,按照“門(mén)、綱、目、科、屬、種”分類(lèi)各自含有的微生物類(lèi)群數(shù)如表3 所示。

表3 各分類(lèi)水平的微生物類(lèi)群統(tǒng)計(jì)Table 3 Microbial group statistics at different classification levels

統(tǒng)計(jì)所有樣本在門(mén)、綱、目、科、屬各層次上的分類(lèi)結(jié)果。 基于豐度前10 的物種采用累積柱狀圖比較樣本間的物種組成差異,進(jìn)行列表展示,樣本在門(mén)和綱層次的群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖2 所示。 圖中僅展示含量最多的前10 個(gè)物種在每個(gè)樣本中所占比例關(guān)系,同時(shí)也展示這些物種在樣品中所占比例,每個(gè)柱狀代表1 個(gè)樣本,不同色塊代表相應(yīng)層次的不同的類(lèi)別。

圖1 土壤樣品的機(jī)械組成Figure 1 The mechanical composition of soil simples

由圖2 可知,土壤樣品中主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為放線(xiàn)菌門(mén)(28.8%)、變形菌門(mén)(28.6%)、浮霉菌(15.4%)、酸桿菌門(mén)(6.8%)和厚壁菌門(mén)(3.6%),總豐度達(dá)83.2%,且各處理之間門(mén)水平微生物的所占比例存在一定差異。 與CK 組土壤樣品相比,處理地塊C1、C2、C3 和C4 的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和變形菌門(mén)有所降低,浮霉菌門(mén)和酸桿菌門(mén)則有明顯的增長(zhǎng)。 結(jié)合5 個(gè)樣品的不同處理,CK 組和C1單一施用化肥組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)比例相近,而添加沼液的C2、C3 和C4 組微生物組成結(jié)果比較相似,優(yōu)勢(shì)菌門(mén)比例相近,放線(xiàn)菌門(mén)和酸桿菌門(mén)所占比例隨著沼液比例提高而增加,厚壁菌門(mén)則有所降低。

從微生物總量相對(duì)豐度的優(yōu)勢(shì)菌綱層次對(duì)比,如圖3所示,優(yōu)勢(shì)菌綱所占比例由高到低分別為α-變形菌綱、放線(xiàn)菌綱、浮霉菌綱、酸桿菌綱亞組和β-變形菌綱,各處理微生物總量從綱層面無(wú)顯著差異,對(duì)照組CK 與處理組C1、C2、C3 和C4 組相比,α-變形菌綱和嗜熱菌綱略降低,酸桿菌綱亞組、浮霉菌綱和放線(xiàn)菌綱有所升高,相互之間差異不明顯。

圖3 各樣地土壤細(xì)菌 OTUs Venn 圖Figure 3 OTUs Venn diagram of various soil bacteria

通過(guò)將各處理土壤樣品分布的OTU 為依據(jù),對(duì)各個(gè)土壤樣品的細(xì)菌菌種的多樣性進(jìn)行相關(guān)分析。 通過(guò)制成的VENN 圖可以得知,5 個(gè)樣品共有OTU 數(shù)目為2 739,除CK 和C1 特有OTU 數(shù)為0 之外,C2、C3、C4 特有OTU條數(shù)分別是1、2、1。

由此可見(jiàn),沼液還田不會(huì)大幅度增加土壤微生物的種類(lèi),基本不影響原有土壤微生物系統(tǒng)。

結(jié)合來(lái)自5 個(gè)不同區(qū)域的土壤的微生物測(cè)序結(jié)果,從門(mén)層次和綱層次柱狀圖并結(jié)合根據(jù)OTU 數(shù)制得VENN圖,初步可以得出結(jié)論,即施用沼液不會(huì)破壞土壤中原有生態(tài)系統(tǒng),促進(jìn)土壤微生物多樣性,維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。

3 討論

土壤是植物生長(zhǎng)的所依賴(lài)的基礎(chǔ),土壤理化性質(zhì)指標(biāo)反映出土壤的肥力,土壤顆粒組成決定了養(yǎng)分和水分的保持能力和運(yùn)轉(zhuǎn)能力;土壤中微生物群落的組成則衡量土壤質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一[12]。 本試驗(yàn)表明,連續(xù)兩年施用不同肥料和不同比例的沼液后,青儲(chǔ)玉米田地表層有機(jī)質(zhì)、總氮有著不同程度的提高,而土壤的pH 則是隨著沼液施用比例增多,pH 從8.11 降至7.73 左右,而施用化肥的處理pH 為8.32,分析可能是沼液中的有機(jī)污染物成份進(jìn)入土壤后,提高了土壤中有機(jī)質(zhì)和總氮的含量,同時(shí)有機(jī)質(zhì)的增加提高了微生物活性和促進(jìn)了腐殖質(zhì)等酸性物質(zhì)的生成,使得土壤pH 降低。 本試驗(yàn)在進(jìn)行過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)全磷、有效磷、有效鉀的含量并未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,全部使用沼液作為肥料的C4,土壤中的有效磷、速效鉀含量最低,分析可能是沼液還田時(shí),大量的水分?jǐn)U大了各種鹽分在土壤中的分布范圍,造成濃度的降低,也可能與沼液中有機(jī)物的添加有關(guān),促進(jìn)了微生物對(duì)礦物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,更有利于作物對(duì)磷的吸收。

土壤機(jī)械組成與土壤的水土保持、養(yǎng)分保持密切相關(guān)。 本試驗(yàn)反映了沼液處理后的土壤粒徑黏粒和粉粒比例增大,而使用化肥的則是粗砂和極粗砂的比例增多,可能是施用沼液后土壤有機(jī)物的增加,改善了土壤的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)[13]。 該結(jié)論也與(蘇志珠,2008)等發(fā)現(xiàn)一致[14],有機(jī)物土壤有機(jī)質(zhì)的含量與粉粒和黏粒的含量呈正相關(guān)關(guān)系,與砂粒則呈負(fù)相關(guān)。

微生物群落組成是衡量土壤健康和質(zhì)量的重要指標(biāo)[15],不同區(qū)域,不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌群落存在差異[16]。本次試驗(yàn),通過(guò)利用化肥和沼液按照不同比例進(jìn)行處理,土壤中優(yōu)勢(shì)菌群放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)和浮霉菌門(mén)所占比例介于72%～74%之間,其中變形菌門(mén)隨著沼液在施肥比例中不斷增加而略下降,而放線(xiàn)菌門(mén)則隨著沼液在施肥比例中不斷增加而上升。 由于變形菌門(mén)具有較強(qiáng)的固氮作用,沼液的添加可能影響了土壤內(nèi)部的氮循環(huán)過(guò)程[17]。放線(xiàn)菌門(mén)具有分解土壤中有機(jī)物的能力,在土壤碳礦化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[18]。 浮霉菌門(mén)作為一種生態(tài)友好型微生物,能夠參與土壤的反硝化過(guò)程;酸桿菌門(mén)是土壤菌群中一大門(mén)類(lèi),目前對(duì)其機(jī)理和作用尚未明確,一般認(rèn)為跟土壤植物纖維降解和鐵循環(huán)有關(guān)[19]。 厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度則與沼液比例呈負(fù)相關(guān),厚壁菌門(mén)具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性,能夠生存在干旱和鹽堿等較為極端的區(qū)域,有利于分解土壤中難降解化合物,預(yù)防植物病蟲(chóng)害,在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[20]。 擬桿菌則是一種相對(duì)耐氧的厭氧微生物菌群,沼液的添加一定程度上改變土壤的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境及氧氣含量,進(jìn)而影響厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)與其他微生物菌群之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

土壤施加沼液在一定程度上能夠增加土壤微生物菌群的多樣性[21];通過(guò)VENN 圖發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)3 年沼液和肥料處理,土壤樣品中新增微生物門(mén)類(lèi)較少,C1、C2、C3 和C4四組處理中,C1 與CK 種類(lèi)相同,C2 和C4 分別比CK 多1種,C3 則比CK 多了2 種,與2 749 種共有微生物種類(lèi)相比,差異很小。

4 結(jié)論

本研究顯示,土壤施用沼液在一定程度上可以提高土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮的含量,降低土壤pH 值。 根據(jù)不同處理后的土壤的機(jī)械組成分析發(fā)現(xiàn),連續(xù)施用化肥的土壤種,含有粗砂和極粗砂比例占比更高,施用沼液田地,土壤中的黏粒和粉粒占比更大,屬于粘質(zhì)壤土。 通過(guò)對(duì)比各種處理的微生物菌群,施用沼液比例越大,對(duì)土壤表層的群落結(jié)構(gòu)有一定的影響[22]。 與不經(jīng)任何處理的土壤相比,土壤中變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)相對(duì)豐度略有下降,隨著沼液添加比例上升,放線(xiàn)菌門(mén)相對(duì)豐度反彈,同時(shí)酸桿菌門(mén)和浮霉菌門(mén)有較為明顯的上升趨勢(shì),表明沼液和肥料中的養(yǎng)分進(jìn)入土壤后,對(duì)土壤的微生物菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響,VENN 圖顯示,沼液或肥料的施用不會(huì)大幅度增加土壤微生物菌群種類(lèi),保持土壤微生物生態(tài)基本穩(wěn)定。 本研究揭示了長(zhǎng)期沼液還田灌溉對(duì)青儲(chǔ)玉米田地的理化性質(zhì)和微生物菌群多樣性的影響,有助于進(jìn)一步推動(dòng)沼液安全高效還田,了解沼液灌溉對(duì)土壤微生物環(huán)境產(chǎn)生的影響。