摘要：研究紅三葉（Trifolium pratense L.）葉片的密碼子使用偏好性，可為優(yōu)化密碼子組成奠定基礎(chǔ)。研究通過CodonW，R，CUSP等軟件對紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組中5 513條編碼序列進行密碼子使用模式和偏好性分析。研究發(fā)現(xiàn)，GC3與GC12相關(guān)性較弱，表明選擇壓力對其密碼子偏好性的選擇有一定的作用；ENC-plot分析中，大多數(shù)密碼子偏好性相對較弱，表明選擇壓力是偏好性的主要來源，少數(shù)的基因在期望曲線兩側(cè)均衡散布，表明部分基因受突變壓力的作用；密碼子適應(yīng)度值（Codon adaptation index，CAI）分析可知，基因表達水平對密碼子偏好性產(chǎn)生過程具有一定影響作用，CAI為0.201，表明密碼子偏好性比較弱。偏倚性分析進一步證實紅三葉葉片密碼子偏好性重點受突變壓力的影響。最優(yōu)密碼子分析表明，紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組序列的最優(yōu)密碼子更偏好以G或C結(jié)尾。結(jié)果有利于紅三葉基因工程研究中密碼子優(yōu)化，對紅三葉的系統(tǒng)進化研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞：紅三葉葉片；密碼子偏好性；轉(zhuǎn)錄組；編碼序列

中圖分類號：S541""" 文獻標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）06-1752-08

Codon Usage bias Analysis of Trifolium pratense Based on Transcriptome Data

HUA Mei1， LYU Li-juan2， MU Ying-tong1， ZHANG Xiao-ming1， HAO Ning1， WANG Jun-jie1， LIU Yuan1*

（1.Inner Mongolia Autonomous Region Sino-Mongolia Medicinal Materials Breeding Engineering Technology Research Center，

College of Grassland， Resources and Environment， Inner Mongolia Agricultural University， Huhhot， Inner Mongolia 010019， China；

2.Hohhot Forestry and Grassland Bureau， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China）

Abstract：This study investigates the codon usage bias in of Trifolium pratense L.，laying the foundation for optimizing codon composition. The codon usage patterns and bias of 5 513 coding sequences of Trifolium pratense leaf transcriptome were analyzed using software such as CodonW，R，and CUSP. The study indicated that there was a weak correlation between GC3 and GC12，indicating that selection pressure plays a certain role in codon usage bias. In the ENC-plot analysis，most codons showed relatively weak usage bias，suggesting that selection pressure was the main driver of bias，while a few genes were evenly distributed on both sides of the expected curve，indicating the influence of mutational pressure on some genes. CAI analysis revealed that gene expression levels had a certain impact on the process of codon usage bias，with a CAI of 0.201 indicating relatively weak bias. Biased analysis further confirmed that codon usage bias in Trifolium pratense was mainly influenced by mutational pressure. Analysis of optimal codons showed that the optimal codons in the transcriptome of Trifolium pratense preferentially end with G or C. These results are beneficial for optimizing codon usage in genetic engineering studies of Trifolium pratense and are of significant importance for the systematic evolution research of Trifolium pratense.

Key words：Trifolium pratense leaves;Codon preference;Transcriptome;Encoding sequence

密碼子作為編碼所有生物體中mRNA的基本遺傳密碼，在生物的生長發(fā)育過程中具有重要作用［1］。密碼子偏好性能夠影響生物的蛋白質(zhì)的表達、結(jié)構(gòu)和功能以及局部翻譯的延伸速率［2］。蛋白質(zhì)對維持生命體的活動具有重要作用，蛋白質(zhì)的差異性是決定生物體生長發(fā)育過程中特異性性狀的主要原因。除了色氨酸和甲硫氨酸之外，其他的氨基酸均有2～6個不同的編碼密碼子［3］。遺傳密碼具有冗余性，通常多個密碼子共同編碼同一個氨基酸，這些編碼相同氨基酸的密碼子被稱為同義密碼子［4］。編碼同一個氨基酸的不同同義密碼子的使用頻率在不同的物種間甚至在同一物種中均具有明顯的差異。同義密碼子在同一物種中的使用頻率不同，部分密碼子的使用頻率高于其他密碼子，這種現(xiàn)象稱為密碼子使用偏好性［5］。

紅三葉（Trifolium pratense L.）又名紅車軸草等［6］，為豆科（Leguminosae）車軸草屬（Trifolium L.）多年生草本植物。紅三葉起源于地中海地區(qū)，廣泛分布于歐洲、亞洲、非洲、南北美洲的溫帶地區(qū)，是世界上栽培最多的豆科牧草之一［7］。紅三葉壽命4～6年，直根系［8］，掌狀三出復(fù)葉，小葉卵狀橢圓形至倒卵形［9］，葉面上常有深淺不一的V字形白色斑紋；花序球狀或卵狀［10］，花萼筒狀，花冠蝶形，淡紅色、紫色或淡紫紅色偶爾也呈粉白色［11］；子房橢圓形，花柱絲狀細長；莢果小，腎形［12］。紅三葉作為多功能植物，其體內(nèi)含豐富異黃酮類化合物（Isoflavones），具有營養(yǎng)全面、適口性好、再生性強、根瘤眾多、固氮能力強、防止水土流失等特點，在生產(chǎn)中常作為牧草、藥用植物、水土保持植物、蜜源植物和間作綠肥［13］等投入使用。

分析紅三葉等重要經(jīng)濟作物的密碼子偏好性有助于引導(dǎo)植物的適應(yīng)性改良和遺傳改良工作。同時，通過比較不同物種之間的密碼子偏好性差異，可以探討植物進化過程中基因組變化和適應(yīng)性演化的機制。此外，同一植物不同部位的密碼子偏好性可能受到基因表達調(diào)控、功能需求、翻譯效率以及環(huán)境適應(yīng)性等因素的影響［14］。本研究旨在利用紅三葉葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)性地分析其密碼子偏好性，并探討其在生物學(xué)功能和進化過程中的意義，以及為后續(xù)分析紅三葉不同部位密碼子偏好性研究做鋪墊。深入探究紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組密碼子偏好性，將為植物基因表達調(diào)控和生物進化研究提供新的見解，為植物的遺傳改良和資源利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試紅三葉為2020年6月份于呼倫貝爾地區(qū)所采集的野生植物，經(jīng)王俊杰教授鑒定為紅三葉植物，其千粒重為1.243 g，采用Trizol法提取樣品總RNA，得到紅三葉葉片總的RNA后于Agilent 2100檢測RNA的質(zhì)量，質(zhì)量合格后，用于轉(zhuǎn)錄組測序，實驗委托給上海歐易生物科技有限公司。

1.2 相對同義密碼子使用度

相對同義密碼子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）是用來檢測全基因中所有同義密碼子使用模式的變化，等于基因樣本中某同義密碼子在實際中觀測到的使用次數(shù)值與其在理論中平均使用期望次數(shù)的比值。

1.3 密碼子相對適應(yīng)度

密碼子適應(yīng)度值（Codon adaptation index，CAI）是一種普遍使用的幾何方法，用于衡量單個密碼子的相對適應(yīng)度值。CAI方法被普遍的用于各個方面生物學(xué)的研究中［15］。計算公式為：Wij=RSCUij/RSCUimax。其中，Wij為密碼子相對適應(yīng)度，RSCUimax為第i個氨基酸最多的使用頻度的密碼子的RSCU值。

1.4 ENC-plot優(yōu)先密碼數(shù)繪圖分析

有效密碼子數(shù)（Effective number of codon，ENC）指密碼子偏離隨機選擇的程度，也是衡量同義密碼子不均等使用偏好程度的關(guān)鍵性指標(biāo)。通常對于高表達基因其偏好性比較大，是因為其含有較少種類的稀有密碼子，ENC的值就相對比較?。坏捅磉_基因的密碼子偏好程度較小，會導(dǎo)致了ENC取值比較大［16］。以GC3為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)進行ENC-plot繪圖分析構(gòu)建散點圖，同時增加標(biāo)準(zhǔn)曲線：ENC=2+GC3+29/［GC32+（1-GC3）2］。

1.5 PR2-plot繪圖分析

PR2-plot繪圖分析（PR2-bias plot analysis）主要目的是為了有效避免密碼子的第3位堿基腺嘌呤A與胸腺嘧啶T以及胞嘧啶C與鳥嘌呤G之間的線性突變不平衡［17］。以G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)，A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)進行繪圖分析，中點表示A=T且C=G，表示密碼子偏好性完全受到突變影響。

1.6 中性繪圖分析

以GC12為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)進行繪圖，圖中每一散點對應(yīng)一個基因。對于中性繪圖的分析方法就是以得到GC12為一條線的縱向坐標(biāo)，以得到GC3為一條線的橫向坐標(biāo)后再進行作圖。通過對密碼子第1，2位和第3位堿基組成的相關(guān)性進行分析，研究對密碼子偏好性產(chǎn)生直接影響的主要因素。當(dāng)GC12與GC3之間有顯著相關(guān)時，表示3個不同位置上的堿基組成沒有大的區(qū)別，應(yīng)用密碼子會被突變所影響。當(dāng)GC12以及GC3的基因相關(guān)性差異不顯著時，回歸系數(shù)非常接近0，表示第1，2位以及第3位的堿基組成不同，應(yīng)用密碼子較多的會被選擇因素影響［18］。

1.7 對應(yīng)性分析

對應(yīng)關(guān)系分析（Correspondence analysis，CA）是用于分析基因間的同義密碼子在研究中的使用偏好產(chǎn)生的主要原因的一種方法，這種方法在研究中普遍使用［19］。通過對分離獲得的各種基因間的相關(guān)關(guān)系進行分析，可以精確的發(fā)現(xiàn)和判斷基因間同義密碼子使用偏好性產(chǎn)生的主要原因。

1.8 最優(yōu)密碼子分析

最優(yōu)密碼子使用頻率（Frequency of optimal codons，F(xiàn)OP）是指在某物種高表達基因中使用頻率最高的密碼子。需要通過一組基因序列以及其相對應(yīng)的表達信息來確定最優(yōu)密碼子［20］。對紅三葉編碼序列ENC值進行排序，從兩端挑選10%基因，構(gòu)建高低表達數(shù)據(jù)庫，利用CodonW計算RSCU值和△RSCU，將滿足△RSCU≥0.08，且RSCUgt;1的密碼子確定為最優(yōu)密碼子。

1.9 數(shù)據(jù)處理

利用密碼子分析軟件CodonW等軟件工具分析密碼子以下指標(biāo)：同義密碼子相對使用度、有效密碼子數(shù)以及使用在線軟件CUSP（http：//imed.med.ucm.es/EMBOSS/）計算密碼子GC含量（GC1，GC2，GC3）、3位堿基的GC平均含量（GC-all）以及密碼子第3位堿基的A，T，C，G（A3，T3，C3，G3），用R語言進行密碼子偏倚分析和中性繪圖分析等，并分析單個基因的密碼子使用偏好性。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子GC含量組成分析

運用Codon W軟件獲得紅三葉葉片5 513條編碼序列中GC比例，結(jié)果如圖1所示，GC比例范疇分布在27.4%～71.5%之間，主要分布在40%～50%之間，占比50%以上，GC的平均比例為45.60%。GC1的平均比例為51.23%，GC2的平均比例為40.80%，GC3的平均含量為44.76%。經(jīng)過對比得知，GC2的含量最少，GC1與GC3的值相對比較相近，表明紅三葉葉片編碼序列更加偏向于使用G，C兩種堿基。T3s和A3s遠高于G3s和C3s，表明紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組基因密碼子第3位堿基以A/U為主。CAI為0.201，表明紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組基因密碼子偏好性比較弱（表1）。

2.2 中性繪圖分析

紅三葉葉片編碼序列中性圖分析的結(jié)果如圖2所示，其中GC12值的范疇在0.29～0.67之間，GC3值的范疇在0.14～0.95之間。GC3與GC12的關(guān)聯(lián)性系數(shù)為0.085，說明選擇壓力對紅三葉葉片基因密碼子的使用偏好性具有一定影響。

2.3 ENC-plot繪圖分析

ENC的取數(shù)范疇在24.76～61之間，平均值為52.84，其中ENC小于等于35的基因有138個（1.30%），ENC等于61的基因有337個（3.18%），說明紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組的編碼序列除了少部分密碼子有著很強的偏好性之外，其它所有的基因序列密碼子使用偏好性均相對較弱。

對紅三葉葉片基因以GC3s為橫坐標(biāo)、ENC為縱坐標(biāo)繪制散點圖（圖3），若密碼子偏好性是主要由突變造成的，則散點將分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線周圍；若基因密碼子偏好性受自然選擇影響更大，則散點將偏離期望曲線。圖中每個點表示基因情況的散布，紅三葉葉片大多數(shù)基因遠離期望曲線，說明密碼子的偏好性大部分來自于選擇壓力的影響，小部分基因在期望曲線的兩側(cè)平均的分布，說明部分基因受到突變壓力的作用。

2.4 對應(yīng)性和相關(guān)性分析

紅三葉葉片對應(yīng)性分析結(jié)果如圖4A所示，其中，大于60%的GC含量編碼序列在坐標(biāo)系中分散分布，而小于60%的GC含量編碼序列則在坐標(biāo)系中比較集中分布。

另外，選擇6個編碼序列有關(guān)的參數(shù)（GC12，GC3，GCall，ENC，CAI和Axis1）進行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果如圖4B所示。Axis1與GC3（r=-0.728，Plt;0.01）、GCall（r=-0.418，P＜0.01）之間存在顯著負相關(guān)關(guān)系。結(jié)合圖4A與圖4B，說明GC3比例與GC比例高的編碼序列傾向于在Axis1的左側(cè)分布。所以，可推斷以G/C結(jié)尾的密碼子于Axis1負軸集中分布而以A/U結(jié)尾的密碼子于Axis1正軸集中分布。

紅三葉葉片編碼序列CAI的范圍在0.097～0.451之間，且CAI均值為0.201，表明紅三葉葉片的轉(zhuǎn)錄組基因序列密碼子偏好性較弱，并且對CAI與GC3，GC和ENC等其他幾個重要的參數(shù)進行了相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4C所示。CAI與ENC之間表現(xiàn)出明顯的負相關(guān)（r=-0.07，P＜0.05），表明在紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組中，部分基因的密碼子使用偏好性與密碼子使用的多樣性之間存在一定程度的關(guān)聯(lián)，但這種關(guān)聯(lián)不是非常強烈?；蛑蠫C比例和基因表達程度越高，密碼子使用偏好性的水平越高。

2.5 基因表達水平對密碼子使用偏好性的影響及偏倚性分析

對紅三葉葉片基因PR2偏倚分析如圖5所示，紅三葉葉片基因位點在圖中分布并不均勻，這表明紅三葉葉片基因密碼子使用偏好性主要受到突變壓力的影響。圖中下半部分基因明顯多于上半部分，表明紅三葉葉片基因中的第三位密碼子的使用頻率是T/Ugt;A，G和C的使用無明顯差別。因此，紅三葉葉片基因受自然選擇效應(yīng)的影響較大。

2.6 最優(yōu)密碼子分析

紅三葉葉片編碼序列高、低表達序列的RSCU值如表1所示。得到26個密碼子作為紅三葉葉片編碼序列的最優(yōu)密碼子，分別為：UUC，CUC，CUG，AUC，GUC，UAC，CAC，CAG，AAC，AAG，GAC，GAG，UCC，UCG，CCC，CCG，ACC，ACG，GCC，GCG，UGC，CGU，CGC，CGG，AGC和GGC。當(dāng)中以C（16個）、G（9個）及U（1個），以G/C結(jié)尾的較多，說明紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組編碼序列的最優(yōu)密碼子偏好以G或C結(jié)尾。

3 討論

密碼子是生物重要的組成部分，它們在生物進化過程中扮演關(guān)鍵角色。生物體面臨著復(fù)雜多變的環(huán)境，通常會傾向于使用特定的密碼子來增強對環(huán)境的適應(yīng)能力。分析物種對密碼子的使用模式有助于理解基因的表達調(diào)控機制，促進對基因的異源表達。此外，對密碼子使用模式的研究還能深入探究生物體的基因表達水平、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及翻譯速率等重要生物學(xué)特征，對于揭示生物的遺傳特性和功能機制具有重要意義［22-23］。因此，探索藥用紅三葉葉片基因密碼子使用偏好性，可為研究其密碼子使用特點，篩選最佳蛋白異源表達載體及密碼子優(yōu)化奠定理論基礎(chǔ)。本研究對紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中5 513條完整編碼序列的密碼子使用偏好性進行分析表明，紅三葉葉片編碼序列更偏好使用G/C兩種堿基，高夢琦等［24］在對大黃密碼子使用偏好性的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律。

堿基突變和遺傳選擇也是影響密碼子使用偏好性形成的重要因素。ENC-plot分析表明，紅三葉葉片的編碼序列除了小部分密碼子存在相對較強的偏好性之外，其所有的密碼子使用偏好性相對較弱，并且紅三葉葉片大多數(shù)基因遠離期望曲線，從而得知選擇壓力是密碼子偏好性的主要影響因素，少數(shù)的基因在期望曲線兩側(cè)均衡散布，說明一些基因受到突變壓力的作用。PR2-plot分析表明紅三葉葉片基因密碼子第三位點的堿基使用頻率具有一定偏好性，且更偏好使用堿基T（U），而非A，這可能與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯速度以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。此外，僅少數(shù)基因偏離中心點較遠，進一步說明紅三葉葉片基因密碼子使用偏好性主要受自然選擇效應(yīng)的影響較大，可能反映了紅三葉葉片基因在適應(yīng)環(huán)境變化和功能需求方面的演化策略。而在此前對毛茛科與芍藥科葉綠體基因組密碼子偏好性［25］的研究中也得到了相似的研究結(jié)果，此外，這與榕屬（Ficus）［26］、金花茶（Theaceae Camellia）［27］和倒提壺（Cynoglossum amabile）［20］等葉綠體基因組密碼子偏好性分析的結(jié)果基本一致。在構(gòu)建蛋白表達載體時，不同的基因密碼子使用偏好性差異很大，因此分析紅三葉葉片的基因密碼子使用特點對于載體的密碼子優(yōu)化具有重要意義。

同義密碼子使用偏好性是在自然選擇、基因突變等因素共同影響下形成的，正向選擇和突變壓力越大，基因組中形成的最優(yōu)密碼子越多，反之，則最優(yōu)密碼子相對較少。本研究篩選得到UUC，CUC，CUG，AUC等共26個最優(yōu)密碼子。這些最優(yōu)密碼子均為以G/C堿基結(jié)尾的密碼子，推測紅三葉葉片基因密碼子使用偏好性在基因突變的范圍之內(nèi)。本研究填補了紅三葉葉片密碼子研究水平上的空白，也可為紅三葉的酮類化合物合成及其合成路徑研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究以紅三葉葉片為研究對象，進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過密碼子分析軟件對其密碼子組成及偏好性進行分析，結(jié)果表明，紅三葉葉片編碼序列更傾向于使用G/C堿基，這種偏好性可能反映了紅三葉葉片基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中對G/C堿基的偏好選擇；同時紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組基因密碼子偏好性受到自然選擇和突變的影響；而且其密碼子偏好性較弱主要受到自然選擇效應(yīng)影響；紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組編碼序列篩選出26個最優(yōu)密碼子，偏好使用G/C結(jié)尾。這些結(jié)果為深入理解紅三葉葉片轉(zhuǎn)錄組的密碼子使用特點提供了重要線索，并為后續(xù)的基因功能研究和蛋白表達載體的構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）