摘" 要：為了確定豬丹毒疫苗的效力，本研究采用常規(guī)方法傳代豬丹毒桿菌強毒株C43-8株及C43-6株，在傳代菌液形態(tài)、純粹及活菌計數(shù)等相關(guān)檢驗合格的基礎(chǔ)上給16～18 g昆明小鼠（簡稱KM小鼠）、BALB/c小鼠、ICR（institute cancer research）小鼠注射不同數(shù)量的活菌，根據(jù)小鼠的死亡情況確定豬丹毒桿菌強毒株對不同品種小鼠的最小致死量。結(jié)果顯示，豬丹毒強毒株C43-8株對KM小鼠、BALB/c小鼠、ICR小鼠的最小致死量（minimum lethal dose，MLD）分別為20、25、15 CFU；豬丹毒強毒株C43-6株對上述三種小鼠的MLD分別為15、20、10 CFU。

關(guān)鍵詞：豬丹毒疫苗；效力檢驗；豬丹毒桿菌C43-8株；豬丹毒桿菌C43-6株；最小致死量；小鼠

中圖分類號：S855.1+2" 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）03-0081-05

豬丹毒（swine erysipelas）又稱“皮膚鉆石病”，是由豬丹毒桿菌引起的一種熱性、急性人畜共患病[1]。該菌在自然界廣泛分布，可感染多種哺乳動物、禽和魚[2]。豬感染后在臨床上主要表現(xiàn)為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊（亞急性）、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎（慢性）[3-5]。在20世紀80年代，豬丹毒與豬瘟、豬肺疫并稱為中國養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病[6]。臨床上，豬丹毒桿菌常與豬圓環(huán)病毒、豬細小病毒、豬肺炎支原體等病原體混合感染，同時還會造成人和其他多種動物感染[7]。

目前，對豬丹毒的防治主要依靠疫苗和抗生素。但抗生素濫用會導致細菌對藥物產(chǎn)生耐受性，且藥物殘留也會影響肉品安全，因此使用抗生素防治豬丹毒的措施越來越不可行。接種豬丹毒疫苗被認為是防控該病一種經(jīng)濟有效的手段[8]。

效力檢驗是評價豬丹毒疫苗保護效果的關(guān)鍵參數(shù)。根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》（2020年版）三部第41頁和第92頁“豬丹毒滅活疫苗”和“豬丹毒活疫苗”用小鼠效力檢驗的要求：小鼠免疫疫苗后，對免疫小鼠和對照小鼠分別用豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株混合菌液進行攻毒，攻毒劑量為1個最小致死量（minimum lethal dose，MLD）或者1 000個最小致死量。因此，確定豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株對不同品種小鼠的最小致死量對豬丹毒疫苗效力檢驗成功與否至關(guān)重要。本試驗對不同品種小鼠注射不同劑量的豬丹毒桿菌C43-8株、C43-6株，根據(jù)小鼠的死亡情況確定豬丹毒桿菌C43-8株、C43-6株分別對不同品種小鼠的最小致死量，從而為豬丹毒疫苗的效力檢驗提供可靠的依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1 菌株來源及實驗動物

豬丹毒桿菌1型C43-8株及2型C43-6株均為強毒株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；16～18 g昆明小鼠（簡稱“KM小鼠”）小鼠、BALB/c小鼠、ICR（institute cancer research）小鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2 試驗試劑

馬丁肉湯、鮮血瓊脂斜面、10％血清馬丁瓊脂平板均購自北京中海生物科技有限公司；革蘭染色液購自安徽雷根生物技術(shù)有限公司。

1.3 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株的傳代

將凍干菌種豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株分別用馬丁肉湯稀釋，然后用接種環(huán)接種于鮮血瓊脂斜面，36～37 ℃培養(yǎng)24 h；隨后挑取菌落劃線于10％血清馬丁瓊脂平板上，36～37 ℃培養(yǎng)24～36 h，挑選中等大小光滑菌落20個混合于少量馬丁肉湯中，再接種鮮血斜面2根，經(jīng)36～37 ℃培養(yǎng)24 h；挑選一根菌落生長旺盛的血斜面，用少量馬丁肉湯沖洗后接種于100 mL的馬丁肉湯中，36～37 ℃培養(yǎng)24 h，收獲菌液分別為試驗用豬丹毒桿菌1型C43-8株和2型C43-6株強毒株菌液。

1.4 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液的檢測

豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液的形態(tài)、純粹檢驗及活菌計數(shù)等相關(guān)檢測按照《中華人民共和國獸藥典》（2020年版）附錄進行[9]。

1.5 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液最小致死量測定

將豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株分別稀釋為：5、10、15、20、25 CFU/0.2 mL。將55只16～18 g KM小鼠隨機分為11組，每組5只，第1～5組分別皮下注射不同稀釋劑量的豬丹毒桿菌1型C43-8株，第6～10組分別皮下注射不同稀釋劑量的豬丹毒桿菌2型C43-6株，每只小鼠注射0.2 mL，第11組為空白對照組（注射0.2 mL PBS緩沖液），觀察10 d，記錄小鼠的死亡情況，以致死整組小鼠的最少菌的數(shù)量為該菌株的MLD。BALB/c小鼠、ICR小鼠的重量、數(shù)量、分組及攻毒情況均與KM小鼠的相同。具體試驗分組及攻毒情況見表1。

2" 結(jié)果

2.1 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株的傳代

豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株通過鮮血斜面→10％血清馬丁瓊脂→鮮血斜面→馬丁肉湯的傳代獲得豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液各100 mL。具體菌種傳代過程見圖1。

2.2 豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株菌液的檢測

2.2.1 性狀

經(jīng)革蘭染色后鏡檢觀察，豬丹毒桿菌C43-8株和C43-6株均為革蘭陽性纖細小桿菌。具體檢測結(jié)果見圖2和圖3。

2.2.2 純粹檢驗

經(jīng)純粹檢驗判定傳代豬丹毒桿菌1型C43-8株和2型C43-6株純粹。具體檢測結(jié)果見圖4。

2.2.3 活菌計數(shù)

菌液經(jīng)馬丁肉湯10倍系列稀釋后接種于10％血清馬丁瓊脂平板，0.1 mL/塊，37 ℃培養(yǎng)后判定菌液的活菌數(shù)，具體檢測結(jié)果見表2。

2.3 豬丹毒桿菌1型C43-8及2型C43-6菌液的最小致死量的測定

試驗結(jié)果表明，豬丹毒桿菌C43-8株對不同品種小鼠的最小致死量為：KM小鼠為20 CFU，BALB/c小鼠為25 CFU，ICR小鼠為15 CFU；豬丹毒桿菌C43-6株對不同品種小鼠的最小致死量為：KM小鼠為15 CFU，BALB/c小鼠為20 CFU，ICR小鼠為10 CFU。具體試驗小鼠的死亡情況見表3。對照組小鼠沒有死亡。

3" 分析討論

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2018年5月19日正式啟動實施獸用抗菌藥使用減量化行動。獸用細菌類疫苗將逐漸取代抗生素，成為細菌類疫病防控的主力。細菌類疫苗的質(zhì)量控制，是保證其發(fā)揮有效防控效果的關(guān)鍵[10]。

小鼠對豬丹毒桿菌的毒力及免疫原性的反應與豬的反應呈正相關(guān)。目前國內(nèi)市場上現(xiàn)有的豬丹毒疫苗產(chǎn)品均用小鼠來評價疫苗的安全性及效力，國外研究學者也是用小鼠來評價丹毒桿菌保護性抗原的免疫效果[11-13]。

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》（2020年版）三部對豬丹毒疫苗的效力檢驗要求：對照組注射1個MLD的豬丹毒桿菌強毒株小鼠3只中至少死亡2只，對照組注射1 000個MLD的豬丹毒桿菌強毒株小鼠3只全部死亡。但是，在實際檢測過程中，往往受小鼠品種、菌液混合均勻度、注射劑量等不確定因素的影響，造成對照小鼠的死亡情況不符合規(guī)定。因此，本試驗通過對KM小鼠、BALB/c小鼠、ICR小鼠三種不同品種小鼠注射不同劑量豬丹毒桿菌強毒株，測得豬丹毒桿菌C43-8株對上述三種小鼠的MLD分別為20、25、15 CFU，豬丹毒桿菌C43-6株的MLD分別為15、20、10 CFU。本試驗結(jié)果為豬丹毒疫苗效力檢驗成功提供可靠的數(shù)據(jù)參考。

參考文獻

[1] COOPER J，STUART B，COLE J．Erysipelothrix rhusiopathiae associated with swine abortion[J]．Georgia Veterinarian，1980，32（2）：10-14.

[2] WANG Q，CHANG B J，RILEY T V．Erysipelothrix rhusiopathiae[J]．Veterinary Microbiology，2009，140（3/4）：405-417.

[3] 王一鴻．一例豬丹毒的診治與體會[J]．福建畜牧獸醫(yī)，2019，41（6）：57.

[4] 林艷．一例豬丹毒的鑒別診斷與防控案例分析[J]．養(yǎng)豬，2019，（5）：101-102.

[5] 祭冬琴，王旭．豬丹毒絲菌的分離鑒定與藥敏分析[J]．養(yǎng)豬，2019（4）：122-123.

[6] 宋培武，朱巧玲．警惕當前豬丹毒在規(guī)模豬場的流行與危害[J]．養(yǎng)豬，2013，（5）：117-118.

[7] 張媛，魏財文，李建，等．豬丹毒絲菌生產(chǎn)用菌種CVCC43005株最高擴繁代次的確定及疫苗佐劑的篩選[J]．中國獸藥雜志，2019，53（10）：7-14.

[8] 張文通，魏鳳，李峰，等．商品化豬丹毒疫苗分類及特點[J]．豬業(yè)科學，2020，37（7）：100-101.

[9] 中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典-三部：2020年版[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2020.

[10] 劉博，張媛，袁璐，等．豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)參考品的研究[J]．中國獸醫(yī)雜志，2020，56（5）：115-118.

[11] GROSCHUP M H，CUSSLER K，WEISS R，et al．Characterization of a protective protein antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae[J]．Epidemiol Infect，1991，107（3）：637-649.

[12] TO H，NAGAI S．Genetic and antigenic diversity of the surface protective antigen proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae[J]．Clinical and Vaccine Immunology，2007，14（7）：813-820.

[13] MAKINO S，YAMAMOTO K，MURAKAMI S，et al．Properties of repeat domain found in a novel protective antigen，SpaA of Erysipelothrix rhusiopathiae[J]．Microbiology Pathogeny，1998，25（2）：101-109.

*作者簡介：張俊平（1978－ ），女，碩士，從事動物生物制品研發(fā)；E-mail：zhangjunping5259@sina.com

*通信作者：李春華（1974－ ），女，博士，研究員，主要從事畜禽病毒分子生物學及生物制品研究；E-mail：orchid_lee@sina.com