關鍵詞：蠟梅；CpBEAT3基因；乙酸芐酯；啟動子；酵母單雜交；互作蛋白

蠟梅（Chimonanthus praecoxL．）是蠟梅科（Calycanthaceae）蠟梅屬（Chimonanthus）多年生灌木，是特產(chǎn)于中國的傳統(tǒng)觀賞植物，有悠久的栽培歷史；適應性強，具有花香馥郁、花小色艷、樹姿優(yōu)美等特點。蠟梅具有極高的觀賞價值、文化價值、藥用價值和經(jīng)濟價值，在苗木、切花盆景、香精精油生產(chǎn)等方面具有巨大的開發(fā)潛力，也是鄉(xiāng)村旅游、觀光農(nóng)業(yè)的常用特色花卉?；ㄏ阕鳛橹匾挠^賞性狀之一，在很大程度上影響蠟梅在園林景觀、切花、盆景盆栽、精油等方面的應用?；ㄏ愕拇x通路較為復雜，研究蠟梅花香物質(zhì)代謝途徑，對于蠟梅生產(chǎn)價值提高和植物花香遺傳改良具有重大意義。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）可以激活植物次生代謝物合成途徑中多個合成酶基因的協(xié)同表達．有效啟動次生代謝物合成途徑。目前已發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物揮發(fā)性化合物的合成，如在桂花（Osmanthus fragrans）花瓣中過表達OfMYB21能夠使OfTPS2上調(diào)并導致芳樟醇的積累增加：PbbHLH4能夠激活PbGDPS和PbTPSlO的啟動子并調(diào)控蝴蝶蘭花中單萜類物質(zhì)的生物合成：西伯利亞百合（Lilium'Siberia’）中的轉(zhuǎn)錄因子LiMYB108能夠直接激活LoTPS1的表達從而促進羅勒烯和芳樟醇的合成。但對蠟梅揮發(fā)性物質(zhì)合成具有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子還鮮有報道。

蠟梅中的花香揮發(fā)性化合物主要有萜烯化合物和苯丙烷類化合物，其中苯丙烷類化合物是對蠟梅花香成分貢獻值第二大的類群，而乙酸芐酯是該類群中影響蠟梅花香最主要的物質(zhì)之一。苯甲醇乙?；D(zhuǎn)移酶（BEAT）能夠以苯甲醇和乙酰輔酶A（acetyl-CoA）為底物催化合成乙酸芐酯，是植物乙酸芐酯生物合成代謝途徑下游的關鍵酶。在矮牽牛、梅花等植物中過表達BEAT基因后乙酸芐酯含量明顯提高，干擾BEAT基因表達則會降低乙酸芐酯的含量。本課題組前期研究已經(jīng)篩選出3條蠟梅乙酸芐酯合酶基因，并通過組織部位表達分析發(fā)現(xiàn)CpBEA T3可能是控制蠟梅葉片中乙酸芐酯合成的關鍵基因，但對其生物合成的分子機制和特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究仍不清楚。因此，本研究通過PCR擴增獲得蠟梅乙酸芐酯合酶基因CpBEAT3啟動子區(qū)片段，并對該序列核心啟動子區(qū)、順式作用元件和CpG島等結(jié)構(gòu)進行生物信息學預測分析，同時利用酵母單雜交技術對可能與CpBEAT3啟動子互作的蛋白進行初步驗證，以期為進一步揭示CpBEAT3在蠟梅乙酸芐酯生物合成中的作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

供試植物材料為基因型HLT015的蠟梅植株，由云南省昆明市黑龍?zhí)豆珗@提供。于2022年11月-2023年4月采摘蠟梅不同組織部位（根、葉、花、子葉）樣品放人液氮速凍，運回實驗室保存于-80℃超低溫冰箱，用于提取基因組DNA和總RNA。

1.2實驗方法

1.2.1候選轉(zhuǎn)錄因子的確定利用已發(fā)表文獻中鑒定出的與乙酸芐酯合酶基因互作的轉(zhuǎn)錄因子及其他對苯環(huán)類花香揮發(fā)物有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子序列，在蠟梅基因組數(shù)據(jù)庫中進行同源比對，篩選出5個可能與苯類／苯丙烷類花香物質(zhì)合成調(diào)控有關的MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中CpMYB42與PhOD01同源，CpMYB4.1、CpMYB4.2與PhMYB4同源，CpMYB108.1、CpMYB108.2與JsMYB108同源。

1.2.2組織部位表達特異性分析根據(jù)RNA提取試劑盒說明書分別提取蠟梅不同組織部位（根、葉、花、子葉）的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)CpBEA T3及候選轉(zhuǎn)錄因子的序列設計qRT-PCR引物（表1），以作為內(nèi)參基因，進行實時熒光定量PCR反應，并設置3個生物學重復，用2-AAC法計算基因表達量。qRT-PCR反應體系及程序均按照BlasTaq 2x qPCR MasterMix試劑盒說明書。

1.2.3蠟梅CpBEA T3基因啟動子克隆及誘餌載體的構(gòu)建根據(jù)CpBEA T3翻譯起始密碼子上游約2300bp的啟動子序列設計特異性擴增引物（表1），利用蠟梅基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系如下：DNA模板1上、下游引物各擴士曾程序：95℃預變性3min;95℃變性15s，57℃退火15s，72℃延伸2min 30s，共30個循環(huán)；72℃終延伸5min，4℃保存。將膠回收產(chǎn)物與克隆載體連接并轉(zhuǎn)化Transl-T1感受態(tài)細胞，挑選陽性單克隆菌液送生物公司測序，對測序結(jié)果進行比對。在成功擴增CpBEA T3啟動子的特異性引物兩端引入EcoRI和Sacl接頭，進行PCR擴增，將膠回收產(chǎn)物與pHis2載體進行同源重組，獲得pHis2-pCpBEAT3誘餌載體。

1.2.4生物信息學分析根據(jù)BDGP生物信息學數(shù)據(jù)庫（http：//www. fruitfly.

org/seq一tools/pro-moter.html）預測CpBEA T3基因核心啟動子區(qū)域；利用MethPrimer數(shù)據(jù)庫（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer. cgi）預測Cp-BEAT3基因啟動子CpG島；利用PlantCARE在線軟件（http： //bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）對啟動子順式作用元件進行預測。在擬南芥信息資源網(wǎng)站TAIR（https：//www.arabidopsis.org）下載AtMYB家族的氨基酸序列，利用MEGA 5.1軟件使用NJ法與CpTFs氨基酸序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap檢測數(shù)值設置為1000次，分析蠟梅的候選轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥MYB家族的進化關系。

1.2.5候選轉(zhuǎn)錄因子克隆及獵物載體的構(gòu)建根據(jù)候選轉(zhuǎn)錄因子的CDS序列，利用Primer 3 In-put在線網(wǎng)站設計特異性引物（表1），以蠟梅cD-NA為模板進行PCR擴增，膠回收產(chǎn)物連接克隆載體并轉(zhuǎn)化DH5ca感受態(tài)細胞，挑選陽性單克隆菌液進行測序、比對。在成功擴增候選轉(zhuǎn)錄因子的特異性引物兩端引入EcoRI和BamH I接頭，進行PCR擴增，并將其與pGADT7載體進行同源重組，獲得pGADT7-CpTFs獵物載體。

1.2.6酵母單雜交篩選互作轉(zhuǎn)錄因子將pHis2-pCpBEAT3轉(zhuǎn)入Y187酵母感受態(tài)細胞，涂布于SD/-Trp培養(yǎng)基上，挑取陽性單克隆菌落稀釋后點板于含有0、10、20、30、40、50mmol/L 3-AT（3-氨基-1，2，4-三唑）的SD/-Trp-His培養(yǎng)基上，篩選能夠抑制HIS3表達的最低3-AT濃度。將誘餌載體質(zhì)粒與獵物載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細胞，并涂布在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上，挑取陽性單克隆菌落依次稀釋10、100、1000倍，將10uL各濃度菌液分別點板于含有能夠抑制酵母HIS3表達的最低濃度3-AT的SD/-His-Trp-Leu培養(yǎng)基上，篩選潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

2結(jié)果與分析

2.1CpBEAT3基因及候選轉(zhuǎn)錄因子基因的組織表達模式分析

圖1顯示，CpBEAT3及5個候選轉(zhuǎn)錄因子基因在所檢測的蠟梅組織中均有表達。CpBEAT3在葉中的表達量最高，其次是在根中，兩者間差異不顯著，但顯著高于在花和子葉中的表達量，在花中的表達量最低。CpMYB4.1和CpMYB108.2均在花中表達量最高，顯著高于其他組織；CpMYB4.2在子葉中表達量顯著高于在其他組織；CpMYB42在葉、根中有較高表達，顯著高于花和子葉，在子葉中表達量最低；CpMYB108.1在花中表達量最高，其次在葉和子葉中表達量也較高，各部位差異顯著。

2.2CpBEA T3基因啟動子克隆

根據(jù)CpBEA T3起始密碼子上游序列設計引物并進行PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖2）顯示，PCR擴增產(chǎn)物約2300bp，目的條帶單一，與預期片段大小相符。陽性菌落測序結(jié)果比對顯示，已成功克隆到長度為2310bp（位于-2115～195bp）的蠟梅CpBEA T3基因啟動子區(qū)序列，去除CDS段的195bp序列，最終獲得了2115bp CpBEAT3啟動子序列。

2.3CpBEA T3啟動子生物信息學分析

利用BDGP啟動子預測軟件分析CpBEAT3基因核心啟動子區(qū)域，結(jié)果（表2）顯示，CpBEAT3基因可能存在4個轉(zhuǎn)錄起始位點，分別位于-1844～-1794bp（得分0.99）、-843～-793bp（得分0.99）、-823～-773bp（得分0.98）、-141～-91bp（得分0.90）。推測其核心啟動子區(qū)域可能位于-1844～-1794bp處，可能的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域為CCCGAGTTGATATATATGGAGCTCAACCCGATCCGACCCGACCCGAATTC，啟動子核心區(qū)域包含典型的TATA-box元件。

基于在線軟件MethPrimer對CpBEAT3基因啟動子區(qū)（2115bp）進行CpG島預測，結(jié)果（圖3）顯示存在一個長度為410bp的CpG島，位于247～656bp處（對應于啟動子區(qū)的-1869～-1459bp處），可能會對啟動子調(diào)控基因產(chǎn)生一定的影響。

利用PlantCARE在線軟件對擴增獲得的2115bp CpBEAT3啟動子序列進行分析，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)其中除了包含CAAT-box和TATA-box等啟動子必備的核心元件外，還存在多個光Ⅱ向應元件如Box 4、chs-CMAla、GATA-motif、TCT-motif，以及脫落酸響應元件ABRE，乙烯響應元件ERE，參與茉莉酸甲酯（MejA）反應的順式作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif，MYB和MYC結(jié)合位點，此外還有多個與低溫、干旱、防御和壓力等逆境脅迫相關的順式作用元件LTR、W box、STRE、ARE、TC-rich repeats。

2.4候選轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化分析

將搜索到的擬南芥125個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列與蠟梅候選轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4），可見，CpMYB4.1、CpMYB4.2與AtMYB4親緣關系最近；CpMYB42與AtMYB42、AtMYB85親緣關系較近；CpMYB108.1和CpMYB108.2與AtMYB108、At-MYB78親緣關系較近。

2.5誘餌載體構(gòu)建與3-AT抑制濃度篩選

將2115bp的CpBEAT3啟動子片段與pHis2載體同源重組，構(gòu)建誘餌載體pHis2-pCpBEAT3；將誘餌載體轉(zhuǎn)入Y187酵母感受態(tài)細胞中，涂布于SD/-Trp培養(yǎng)基上，挑取陽性單克隆菌落依次稀釋10、100、1000倍后，分別取10uL點板于含有不同濃度3-AT的SD/-Trp-His培養(yǎng)基上，菌落生長情況如圖5所示。可見，誘餌載體菌株在含30mmol/L 3-AT的SD/-Trp-His培養(yǎng)基上仍能生長，說明誘餌載體菌株內(nèi)的啟動子片段存在自激活現(xiàn)象，但在含40mmol/L 3-AT的SD/-Trp-His培養(yǎng)基上生長幾乎被完全抑制，說明40mmol/L 3-AT可以抑制住誘餌酵母中報告基因的泄露表達。

2.6候選轉(zhuǎn)錄因子克隆及獵物載體的構(gòu)建

根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子CDS序列設計引物，克隆出5個候選轉(zhuǎn)錄因子（圖6），然后將其與經(jīng)雙酶切后的pGADT7載體進行同源重組，獲得pGADT7-CpTFs獵物載體。

2.7酵母單雜交篩選互作轉(zhuǎn)錄因子

將獵物載體pGADT7-CpTFs與誘餌載體pHis2-pCpBEAT3共轉(zhuǎn)Y187進行酵母單雜交互作驗證。結(jié)果顯示，所有共轉(zhuǎn)誘餌質(zhì)粒和pGADT7載體的酵母菌株在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上均能正常生長：挑取生長良好的菌落將其稀釋后分別取10uL點板于含有40mmol/L 3-AT的SD/-His-Trp-Leu培養(yǎng)基上，菌落生長結(jié)果如圖7所示。可見，轉(zhuǎn)化pHis2-pCpBEAT3+pGADT7-CpMYB4.1的菌株在SD/-His-Trp-Leu（40mmol/L3-AT）培養(yǎng)基上能夠生長，而轉(zhuǎn)化pHis2-pCpBEAT3+pGADT7-CpTFs和空載體質(zhì)粒的菌株則不能，說明CpMYB4.1蛋白能結(jié)合CpBEAT3的啟動子。

為進一步探究候選轉(zhuǎn)錄因子具體是與Cp-BEAT3啟動子的哪個區(qū)域互作，將CpBEA T3啟動子進行分段，每500 bp為一段，構(gòu)建分段pHis2誘餌載體，并與pGADT7 -CpMYB4.1共轉(zhuǎn)Y187后進行酵母單雜交實驗，結(jié)果如圖8所示：pHis2 -pCpBEAT3-P4+pGADT7-CpMYB4.1的菌株在SD/-His-Trp-Leu（40mmol/L 3-AT）培養(yǎng)基上能夠生長，而轉(zhuǎn)化其余啟動子片段和空載體質(zhì)粒的菌株則不能，說明CpMYB4.1蛋白能與CpBEAT3啟動子的P4片段結(jié)合。

3討論與結(jié)論

CpBEAT3是蠟梅葉中乙酸芐酯生物合成的關鍵酶基因，挖掘CpBEAT3上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對揭示乙酸芐酯生物合成機制具有重要意義。本研究克隆獲得2115bp的CpBEAT3啟動子序列，利用在線軟件對其進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該基因的核心啟動子區(qū)域可能位于-1844～-1794bp處；存在一個位于-1869～-1459bp處的長度為410bp的CpG島；含有多個MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、光響應元件、激素響應元件以及多種脅迫響應元件，說明CpBEAT3基因的表達可能受到光、轉(zhuǎn)錄因子和激素的調(diào)控，且在逆境脅迫中發(fā)揮作用。進一步利用酵母單雜交技術篩選出1個與CpBEAT3啟動子區(qū)結(jié)合的MYB類轉(zhuǎn)錄因子CpMYB4.1。

轉(zhuǎn)錄因子通過與下游靶基因啟動子結(jié)合進而激活或抑制靶基因的表達，在植物揮發(fā)性物質(zhì)代謝合成過程中具有重要的調(diào)控作用，也是分子生物學領域研究的熱點問題。目前，對于花香成分及其生物合成網(wǎng)絡的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制逐漸明晰，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控花香物質(zhì)的形成和釋放中起著重要作用。MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物多種次生代謝產(chǎn)物的生物合成，目前已證實MYB4基因能夠調(diào)節(jié)植物花青素、類黃酮及木質(zhì)素等代謝途徑中關鍵酶基因的表達，從而影響其生物合成。但MYB轉(zhuǎn)錄因子對于揮發(fā)性苯丙烷類物質(zhì)有調(diào)控作用的報道相對比較少，多見于模式植物矮牽牛中，如R2R3-MYB家族成員的PhODO I能夠調(diào)節(jié)矮牽牛苯丙烷類揮發(fā)物的合成，并且能夠上調(diào)5-烯醇丙酮酰莽草酸磷酸合酶-3-磷酸合成酶（5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase）基因的表達：PhEOB基因也能調(diào)控矮牽牛苯丙烷類揮發(fā)物的合成，其表達變化能夠影響多個花香生物合成相關基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，進而調(diào)控苯甲醛、苯甲酸芐酯及異丁子香酚等花香物質(zhì)的合成：PhEOB I對矮牽牛揮發(fā)性物質(zhì)合成也具有重要的調(diào)控作用，PhEOBH能夠調(diào)控PhEOB的表達，同時二者又共同對PhODoi的表達進行調(diào)節(jié)：過表達MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因PhPAP1使矮牽?；ㄉ兩?，且苯丙烷類揮發(fā)性物質(zhì)的含量增加了10倍：沉默PhMYB4基因后轉(zhuǎn)基因植株中的p-香豆酸顯著增加，說明PhMYB4與矮牽牛苯丙烷類揮發(fā)物的代謝調(diào)控有關。另外，在桂花、茉莉、金魚草、姜花等植物中也有相關報道。

植物苯丙烷類代謝途徑較為復雜，而大部分MYB只對某一代特定的代謝通路有調(diào)節(jié)作用，僅部分MYB能夠同時調(diào)控多個不同的代謝途徑。例如在煙草中表達苦蕎（Fagopyrum tata-curLcum） FtMYB1和FtMYB2能顯著上調(diào)花青素代謝通路上PAL、CHI和F3H基因的表達，增強煙草花青苷合成，使總黃酮含量增加，同時抑制黃酮醇合酶基因FLS的表達，減少黃酮醇的生成：丹參SmMYB39通過抑制苯丙烷類代謝途徑C4H基因的表達，對迷迭香酸的合成進行調(diào)控。苯丙烷類花香物質(zhì)生物合成途徑與花青素、木質(zhì)素合成途徑有部分重疊，且花香與花色、木質(zhì)素的生物合成競爭碳通量，有時會抑制某一途徑從而改變代謝流，進而使得另一途徑過表達．所以在一定程度上存在花色一花香、木質(zhì)素一花香共調(diào)控現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，CpMYB4.1蛋白可以與CpBEAT3啟動子互作，表明其可能參與蠟梅乙酸芐酯的生物合成調(diào)控。接下來將深入研究轉(zhuǎn)錄因子CpMYB4.1對CpBEAT3表達的調(diào)控效應，并對其他可能參與協(xié)同調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子進行鑒定，從而為揭示蠟梅乙酸芐酯合成機制奠定基礎。