doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.005

收稿日期：2024-02-05

基金項目：省部共建木本油料資源利用國家重點實驗室開放課題（GZKF202103、GZKF202203）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃項目（gxyq2020040）；安徽省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（S202414098204、S202414098205）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202414098077）

作者簡介：王占軍（1984-），男，安徽壽縣人，博士研究生，主要從事植物細胞分子生物學研究。（E-mail）wangzhanjunhxj@163.com。汪虹妍為共同第一作者。

通訊作者：張" 勰，（ E-mail ）zhangxiei3@163.com

摘要：" 為探究油桐HSP70基因的功能和進化關系，本研究對HSP70基因家族成員進行了生物信息學鑒定和分析，包括理化性質、進化關系、基因結構、保守基序及染色體定位。同時分析了HSP70基因家族成員在不同組織中的表達差異。結果表明，油桐HSP70基因家族包含24個家族成員，24個HSP70蛋白的理論等電點為4.57～8.70，且大部分屬于穩(wěn)定的、親水性蛋白質，系統(tǒng)進化樹分析結果表明HSP70家族成員分為5個聚類，油桐與毛果楊親緣關系較近。24個VfHSP70蛋白氨基酸序列都包含HSP70保守結構域。22條HSP70基因分布在10條染色體上。分析不同時空的VfHSP70基因的表達量發(fā)現(xiàn)，VfHSP70-5在開花前30 d、開花前25 d、開花前10 d的花蕾中表達量均較高。VfHSP70-4在油桐根、莖、葉和種子中均有較高表達量。以上結果表明，VfHSP70基因可能在調(diào)控油桐生長發(fā)育中具有重要作用。

關鍵詞：" 油桐；HSP70；基因家族；生物信息學

中圖分類號：" S794.3""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）05-0806-11

Genome-wide identification and expression analysis of HSP70 gene family in Vernicia fordii

WANG Zhanjun1，2，" WANG Hongyan1，" YANG Yanping1，" YE Qingfang1，" WANG Shuwen1，" WANG Zhaoxia1，" ZHANG Yi2，" ZHANG Xie2

（1.School of Biology and Food Engineering， Hefei Normal University， Hefei 230601， China；2.State Key Laboratory of Utilization of Woody Oil Resource，Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， China）

Abstract：" In order to investigate the function and evolution of HSP70 gene in Vernicia fordii， the members of HSP70 gene family were identified and analyzed by bioinformatics， including physical and chemical properties， evolutionary relationships， gene structure， conserved motifs and chromosomal localization. The expression differences of HSP70 gene family members in different tissues were also analyzed. The results showed that the HSP70 gene family of Vernicia fordii contained 24 members， and the theoretical isoelectric points of 24 HSP70 proteins ranged from 4.57 to 8.70. Most of HSP70 proteins were stable and hydrophilic proteins. Phylogenetic tree analysis showed that HSP70 family members were divided into five clusters， and Vernicia fordii was closely related to Populus trichocarpa. The amino acid sequences of 24 VfHSP70 proteins contained the conserved domain of HSP70. Twenty-two HSP70 genes were distributed on 10 chromosomes. By analyzing the expression of VfHSP70 gene in different time and space， it was found that the expression levels of VfHSP70-5 were higher in buds at 30 d before anthesis， 25 d before anthesis and 10 d before anthesis. VfHSP70-4 was highly expressed in roots， stems， leaves and seeds of Vernicia fordii. These results suggest that VfHSP70 gene may play an important role in regulating the growth and development of Vernicia fordii.

Key words：" Vernicia fordii；HSP70；gene family；bioinformatics

油桐（Vernicia fordii）屬多年生落葉喬木，原產(chǎn)中國，廣泛分布于亞熱帶地區(qū)，為大戟科（Euphor biaceae）油桐屬植物，是中國四大木本油料樹種之一。油桐喜光，耐陰性差，畏寒怕冷，適宜生長在溫暖濕潤的環(huán)境，低溫是限制油桐生長發(fā)育的重要環(huán)境因素。油桐為雌雄同株異花植物，生長速度快，單位面積產(chǎn)量高，種子含油率高，而且抗逆性較強，可以生長在貧瘠的土壤上，因此適合作為造林樹種。油桐品種資源豐富，廣泛分布在中國的16個省份和多個國家，其中重慶、湖南、湖北等地的油桐栽培面積最大。油桐是中國研究最早最完善的油料樹種，中國有較為完整的油桐栽培技術，能夠實現(xiàn)油桐的早產(chǎn)、高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)。

油桐是重要的能源樹種，其經(jīng)濟價值很高，在制造油漆、合成樹脂、船舶制造、藥品生產(chǎn)等方面均有廣泛的應用。油桐種子的含油量高達50%～70%，出油率為50%，油脂含量高于油菜等油料作物，是植物油中最優(yōu)質的干性油。油桐籽的油脂具有干燥速度快，附著能力強，防水性能好，耐酸堿高溫，抗凍裂抗腐蝕等優(yōu)點。油桐籽榨油后剩余的桐餅和桐麩是優(yōu)良的有機肥料，不僅能提高土壤肥力，還能為農(nóng)作物提供養(yǎng)分，促進其生長發(fā)育，提高產(chǎn)量；并且桐餅和桐麩可供家畜食用。桐油還能用于制作生物柴油替代石油，在國防工業(yè)、材料工業(yè)、生物質能源產(chǎn)業(yè)等多個領域均有很大的發(fā)展前景。

目前，油桐的生物學研究主要包括已完成全基因組測序，油桐花發(fā)育與性別決定的深入探究，建立植物組織培養(yǎng)體系等。這些研究成果為進一步開展油桐遺傳改良提供了有力支撐。油桐對于發(fā)展中國工業(yè)油料產(chǎn)業(yè)起著戰(zhàn)略性作用，加強油桐基礎研究尤其是分子生物學和林業(yè)生物技術研究，鑒定及克隆其生長發(fā)育關鍵基因，并挖掘各基因關鍵生物學功能，對于油桐產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義。

熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）最早見于地中海果蠅（Drosophila melanogaster），在動物、植物和人體內(nèi)廣泛存在，在原核生物和真核生物中也普遍存在。HSP70基因家族成員作為分子伴侶，能維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，當細胞受到外部環(huán)境的不利刺激時，HSP70基因會被激活并誘導表達。HSP70蛋白的相對分子量為6.8×104～7.8×104，是一類高度序列保守的蛋白質家族。HSP70蛋白包括位于N端的高度保守的腺苷三磷酸結合區(qū)（ATPase domain）和位于C端的底物結合結構域（Substrate binding domain，SBD）。

在植物的生長發(fā)育過程中，HSP70基因扮演著重要的角色，同時HSP70蛋白在植物細胞響應生物脅迫（如病原體）與非生物脅迫（如冷、熱、干旱等）過程中起到重要的作用；例如，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，將HSP70基因過表達、敲除或表達下調(diào)擬南芥表型無明顯變化，但雙突變體hsp70-1 hsp70-4和三突變體hsp70-2 hsp70-4 hsp70-5表型改變，且這兩個突變體對高溫、低溫以及高糖、高鹽等滲透脅迫敏感。研究結果表明，經(jīng)過48 h的12 ℃低溫鍛煉后，大戟科的麻瘋樹（Jatropha curcas ）幼苗在1 ℃強冷脅迫下的耐冷性顯著增強。Wang等對其轉錄組數(shù)據(jù)分析表明，在低溫鍛煉階段，HSP70是對12 ℃低溫表現(xiàn)出高響應的基因。另外Wimmer等發(fā)現(xiàn)，在番茄（Solanum lycopersicum ）和菠菜（Spinacia oleracea ）中，冷誘導時HSP70在12 h和48 h時出現(xiàn)表達峰值。

擬南芥、水稻（Oryza sativa ）、毛果楊（Populus trichocarpa ）等植物的HSP70基因家族成員已經(jīng)完成鑒定，其中擬南芥中共鑒定出18個HSP70基因，水稻中共鑒定出32個HSP70基因，毛果楊中鑒定出34個HSP70基因。近年來，有關油桐的全基因組測序也已完成，且有關生物脅迫下油桐基因家族的表達模式已有報道，但目前關于油桐抗寒性基因家族的研究卻鮮有報道，因此本研究基于油桐全基因組對HSP70基因家族進行全面分析，揭示油桐生長發(fā)育和非生物脅迫響應的分子基礎，為進一步培育或改良油桐抗寒品種提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 序列數(shù)據(jù)下載

本研究所用的油桐全基因組數(shù)據(jù)由中南林業(yè)科技大學經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室提供（https：//bigd.big.ac.cn/gsa/），擬南芥基因組和毛果楊基因組來源于NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），水稻基因組來源于Phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）。

1.2" 油桐HSP70基因家族成員的鑒定

為篩選出油桐HSP70候選基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥已鑒定出的18條HSP70蛋白氨基酸序列，利用TBtools軟件將其與油桐基因組蛋白質氨基酸序列進行同源比對（E值＜1×10-10），獲取油桐HSP70基因家族成員編碼的蛋白質氨基酸序列，共檢測出24條待定的HSP70基因序列，同時通過BLASTP同源搜索，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）中下載HSP70蛋白結構域（PF00010）的隱馬爾科夫模型（HMM）文件，使用HMMER v3.0軟件查找油桐中VfHSP70蛋白氨基酸序列。使用SMART工具（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行結構域篩選，確定這24個HSP70蛋白氨基酸序列均含有HSP70結構域，以此確認油桐有24條HSP70蛋白氨基酸序列。

1.3" 油桐HSP70家族蛋白質的理化性質分析

利用在線工具 ExPASy （http：//web.expasy.org/protparam/）分析油桐HSP70蛋白的理化性質，包括蛋白質長度（Predicted protein length）、相對分子量（Relative molecular weight，RMW）、等電點（pI）、不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index，II）、親水性指數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）等。借助在線工具WOLF PSOR（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位分析。

1.4" HSP70家族的系統(tǒng)進化樹構建

從數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥、水稻、毛果楊的HSP70蛋白氨基酸序列構建種間進化樹，根據(jù)文獻下載的喙葉泥炭蘚（Sphagnum recurvum）和北美喬柏（Thuja plicata）HSP70蛋白氨基酸序列均來自Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）數(shù)據(jù)庫。利用MAGE 11軟件中的Clustal W對擬南芥、毛果楊、水稻、油桐、喙葉泥炭蘚和北美喬柏的HSP70蛋白氨基酸序列進行多序列比對，對比結果采用最大似然法（Maximum likelihood）構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值設置為1 000，對其結果使用在線軟件Evolview與Adobe Illustrator進行美化。同時結合BLASTP與進化樹對油桐的24個HSP70基因進行命名。

1.5" 油桐HSP70基因家族的基因結構分析與保守基序分析

使用GSDS 2.0在線工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制油桐HSP70基因家族的基因結構圖。采用在線工具 MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）進行HSP70基因家族成員保守基序（Motif）分析，基序最大數(shù)設為10，其他參數(shù)使用網(wǎng)站默認值，獲得xml格式文件，再在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載24條油桐HSP70蛋白的hitdata文件，利用準備的meme.xml文件、hitdata文件、油桐的進化樹Newick Export文件和24條油桐HSP70蛋白氨基酸序列，通過TBtools軟件分析油桐HSP70家族蛋白質保守序列和蛋白質結構域。

1.6" 油桐HSP70基因家族成員的染色體定位

使用油桐基因組GFF注釋文件，對儲存基因的ID文件進行提取，獲取的基因ID應與GFF注釋文件相對應。通過TBtools軟件定位油桐HSP70基因，獲取其染色體長度及位置信息。

1.7" 油桐HSP70基因家族的表達分析

為探究油桐中HSP70基因的表達情況，利用來自中南林業(yè)科技大學油桐研究團隊的油桐根、莖、葉、種子（開花后10周、開花后15 周、開花后20 周、開花后25 周、開花后30 周）、花蕾（開花前30 d、開花前25 d、開花前10 d、開花前1 d）的基因表達數(shù)據(jù)，使用TBtools進行作圖分析，讓試驗結果可視化。

2" 結果與分析

2.1" 油桐HSP70基因家族鑒定結果

根據(jù)參考文獻中的基因序列號在數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥的HSP70蛋白氨基酸序列為比對序列，運用BLASTP對油桐基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，檢索得到24個油桐HSP70候選基因。使用在線SMART數(shù)據(jù)庫檢驗這24個HSP70蛋白氨基酸序列，結果顯示均含有HSP70結構域；結合多個驗證結果綜合考量，24個油桐HSP70基因家族成員最終被確定。依據(jù)24個VfHSP70基因在NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTP中所得結果和系統(tǒng)進化樹綜合分析，為24個VfHSP70基因命名。

2.2" 油桐HSP70家族成員的理化性質

24個HSP70蛋白的理化性質如表1所示，蛋白質氨基酸序列長度為88～2 008 aa，其中VfHSP70-10蛋白最長，為2 008 aa，VfHSP70-34蛋白最短，為88 aa；VfHSP70-15的相對分子量最大，為9.872×104，VfHSP70-20的相對分子量最小，為1.374×104；理論等電點為4.57～8.70，其中VfHSP70-1的等電點是8.70，為堿性蛋白，其余23個HSP70蛋白的等電點均在7以下，為酸性蛋白。親水性指數(shù)是用來衡量蛋白質親疏水性的大小，親水性指數(shù)越大，蛋白質的疏水性就越強，HSP70蛋白親水性指數(shù)為-1.069～0.095，VfHSP70-8親水性指數(shù)為0.095，VfHSP70-34親水性指數(shù)為0.066，其余HSP70蛋白親水性指數(shù)均＜0，為負值。從親水性來看，大多數(shù)HSP70家族成員親水性多數(shù)為負值，可見油桐HSP70蛋白大部分屬于親水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)是用來衡量蛋白質在體外的穩(wěn)定性，不穩(wěn)定系數(shù)＜40的為穩(wěn)定蛋白。結果顯示，HSP70家族成員不穩(wěn)定系數(shù)為18.36～50.66，其中不穩(wěn)定系數(shù)＞40的有9個HSP70蛋白。其中10個油桐HSP70蛋白定位于細胞質，4個油桐HSP70蛋白定位于葉綠體，3個油桐HSP70蛋白定位于細胞核，3個油桐HSP70蛋白定位于線粒體，3個油桐HSP70蛋白定位于內(nèi)質網(wǎng)，1個油桐HSP70蛋白定位于細胞外。不同的亞細胞定位意味著功能區(qū)別和系統(tǒng)發(fā)育分化。

2.3" HSP70家族進化關系

利用最大似然法構建6個物種的HSP70系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示，其中包括17個擬南芥HSP70蛋白氨基酸序列，34個毛果楊HSP70蛋白氨基酸序列，16個北美喬柏HSP70蛋白氨基酸序列，24個水稻HSP70蛋白氨基酸序列和1個喙葉泥炭蘚HSP70蛋白氨基酸序列。根據(jù)同源關系將116個HSP70蛋白分為5個亞族（Ⅰ～Ⅴ），每個亞族都含有油桐HSP70蛋白。Ⅰ亞族占比最高，共59個HSP70蛋白，包括6個擬南芥HSP70蛋白，14個毛果楊HSP70蛋白，13個水稻HSP70蛋白，10個油桐HSP70蛋白。Ⅱ亞族有8個HSP70蛋白，包括1個擬南芥HSP70蛋白，3個毛果楊HSP70蛋白，3個油桐HSP70蛋白。Ⅲ亞族含有17個HSP70蛋白，Ⅳ亞族含有12個HSP70蛋白，Ⅴ亞族含有20個HSP70蛋白，其中北美喬柏HSP70蛋白聚集于Ⅰ亞族，喙葉泥炭蘚HSP70蛋白聚集在Ⅱ亞族，生物進化距離表明，油桐與喙葉泥炭蘚的親緣關系較遠。

2.4" 油桐HSP70基因家族的基因結構

根據(jù)油桐HSP70基因注釋文件，利用GSDS 2.0在線分析工具，獲得油桐HSP70基因家族成員基因結構。如圖2所示， VfHSP70-8、VfHSP70-23與VfHSP70-25僅含有外顯子，其他21個HSP70基因都含有內(nèi)含子和外顯子。在相同的進化樹亞族中的VfHSP70基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子分布模式，如VfHSP70-5與VfHSP70-28、VfHSP70-23與VfHSP70-25外顯子-內(nèi)含子分布模式相似?？傮w來說，不同亞族VfHSP70基因家族成員的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量差異較大，且內(nèi)含子位置和長度也存在很大差異，但同一亞族成員大部分基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子分布模式。

2.5" 油桐HSP70家族的保守基序

為了解HSP70蛋白的結構特征，使用MEME在線工具分析油桐HSP70家族成員蛋白氨基酸序列的保守基序，最大Motif檢測數(shù)設置為10。由圖3可知，有5個VfHSP70蛋白氨基酸序列包含全部10個保守基序，分別為VfHSP70-5、VfHSP70-6、VfHSP70-10、VfHSP70-28、VfHSP70-29。同一進化分支上的蛋白質具有相同的保守序列，如VfHSP70-9與VfHSP70-10，VfHSP70-5與VfHSP70-28等。VfHSP70-34僅含有1個保守基序。其中17個VfHSP70蛋白包含Motif 1，15個VfHSP70蛋白包含Motif 2，Motif 1和Motif 2可能在HSP70蛋白的進化中表現(xiàn)出特異性。各個HSP70蛋白的Motif數(shù)量以及分布上的不同可能會導致HSP70蛋白功能上的差異，保守基序種類及分布可能與蛋白質功能多樣性相關。基序結構域分析結果表明，24個蛋白質氨基酸序列共含有13個結構域，其中都含有HSP70結構域。結構域的分布存在差異，但是在同一亞群的家族成員具有類似的結構域，如VfHSP70-5與VfHSP70-28。

2.6" 油桐HSP70基因家族成員的染色體定位

為了明確油桐HSP70基因在染色體上的分布情況，使用TBtools軟件對24個油桐HSP70基因家族成員進行染色體定位分析。在染色體1上有6個基因，分別為VfHSP70-3、VfHSP70-23、VfHSP70-24、VfHSP70-14、VfHSP70-19、VfHSP70-13。染色體2上也有6個VfHSP70基因，分別為VfHSP70-6、VfHSP70-10、VfHSP70-18、VfHSP70-1、VfHSP70-2、VfHSP70-4。染色體6上有2個VfHSP70基因，分別為VfHSP70-20，VfHSP70-29，染色體8有2個VfHSP70基因，分別為VfHSP70-34，VfHSP70-7。VfHSP70-15基因分布在染色體3上，VfHSP70-5分布在染色體4上，VfHSP70-8分布在染色體5上，VfHSP70-25基因分布在染色體7上，VfHSP70-28基因分布在染色體9上，VfHSP70-16基因分布在染色體10上。VfHSP70-26基因和VfHSP70-9未定位到染色體上。

2.7" 油桐HSP70基因家族的表達特性

收集油桐HSP70基因在不同組織中的表達數(shù)據(jù)，利用轉錄組數(shù)據(jù)獲取FPKM值，使用TBtools制作熱圖使數(shù)據(jù)可視化，對VfHSP70基因家族成員在根、莖、葉、種子和花中的表達量進行研究。

對于VfHSP70基因家族成員在根、莖、葉中的表達，結果如圖4所示，VfHSP70-3與VfHSP70-4在根中的表達量較高，在莖和葉中的表達量明顯低于根，VfHSP70-18在莖中表達量較高；VfHSP70-26在葉中表達量較高，說明這些基因對油桐營養(yǎng)組織的生長發(fā)育過程起重要作用，且同一個基因在不同的組織中發(fā)揮不同的功能。關于VfHSP70在油桐種子中的表達模式，分析了以下5個具有代表性的種子發(fā)育階段：開花后10周（S1）、開花后15周（S2）、開花后20周（S3）、開花后25周（S4）、開花后30周（S5）。在開花后10周，油桐種子中VfHSP70-5表達量較高；在開花后15周，油桐種子中VfHSP70-4的表達量較高；在開花后20周，油桐種子中VfHSP70-26表達量較高；開花后25周，油桐種子中VfHSP70-4表達量較高；在開花后30周，油桐種子中VfHSP70-25表達量較高。這些較高表達的基因在油桐種子發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，不同發(fā)育時期種子的高表達基因也有所不同。Feng等將在某一階段表達量是其余階段表達量2倍以上的VfHSP70基因定義為“階段特異性”基因，由圖4可見，VfHSP70-2基因在開花后30 周是“階段特異性”基因。在油桐發(fā)育階段，這些特異性表達的基因起著重要的作用。

對VfHSP70基因在花中表達量進行可視化，分析了以下4個具有代表性的雌蕾和雄蕾發(fā)育階段：開花前30 d的雌蕾（C1）和雄蕾（X1）；開花前25 d的雌蕾（C2）和雄蕾（X2）；開花前10 d的雌蕾（C3）和雄蕾（X3）；開花前1 d的雌蕾（C4）和雄蕾（X4）。在4個階段中，VfHSP70-3、VfHSP70-13、VfHSP70-19、VfHSP70-23、VfHSP70-25和VfHSP70-29基因FPKM＜0.2，幾乎不表達；VfHSP70-5、VfHSP70-6、VfHSP70-10、VfHSP70-14、VfHSP70-18基因在4個階段表達量較高，VfHSP70-5在開花前30 d到開花前10 d均有較高表達量；在兩性花發(fā)育階段，VfHSP70-18有較高表達量。這些結果表明，不同的基因可能階段性參與油桐花的發(fā)育。

油桐HSP70基因家族成員在根、莖、葉、種子、花5種組織中各有不同的表達模式，VfHSP70-4、VfHSP70-5、VfHSP70-6、VfHSP70-14、VfHSP70-18、VfHSP70-26在5種組織中均有較高表達，表明這些基因在油桐的整個生長發(fā)育中發(fā)揮著較大作用，且不同的基因在這5個組織中的表達具有特異性；VfHSP70-4在根、莖、葉、種子均有較高表達，說明VfHSP70-4在油桐根、莖、葉和種子的生長和發(fā)育過程中可能起著重要作用；VfHSP70-5從開花前30 d至開花前10 d均表現(xiàn)出較高表達水平。因此，這些基因可能在油桐繁殖階段起著重要調(diào)控作用。

3" 討論

油桐是一種經(jīng)濟價值較高的能源樹種，能夠提供十分優(yōu)質的生物質能源，如干性油料。油桐屬典型的中亞熱帶樹種，為陽性樹種，喜溫、喜光、喜水，但又不耐水濕，適應暖濕氣候，增強油桐的抗逆性將對油桐的種植范圍與生產(chǎn)產(chǎn)量有很大的幫助。HSP70是一種普遍存在的分子伴侶，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，植物中HSP70基因家族成員廣泛參與植物的逆境脅迫反應和代謝調(diào)控。目前，HSP70基因的生物學功能已在許多植物中得到了研究，例如擬南芥、水稻、毛果楊和小麥（Triticum aestivum），但油桐的HSP70基因鮮有報道。因此本研究對油桐HSP70基因家族進行了全面的全基因組分析，以期為今后油桐HSP70基因功能研究提供基礎。

HSP70是一種重要的熱休克蛋白，在植物的細胞、組織、器官以及整個生命周期中發(fā)揮著廣泛的作用。近年來，隨著HSP70基因家族成員的深入研究，人們對HSP70基因在植物油脂代謝中的作用有了更深入的理解。然而，關于油桐油脂代謝中HSP70基因的具體作用仍待探秘。研究發(fā)現(xiàn)，隨著環(huán)境溫度的升高，擬南芥萼片與花朵早上隨之開放，然而對于其潛在的分子機制知之甚少。輕度熱應激會使脂質代謝減慢，特別是表皮脂質代謝減慢，萼片中的相關基因表達量變高，HSP70-16的突變同樣使脂質代謝減慢，萼片中的相關基因表達量變高 。另外，研究發(fā)現(xiàn)大豆（Glycine max）中的一些miRNA通過靶向負調(diào)控HSP70基因的表達，從而對大豆籽粒的蛋白質合成起到促進作用。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）可能在大豆籽粒成熟過程中油脂和蛋白的轉化中扮演著重要角色。1，5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶有4個大亞基（RbcL）和4個小亞基（RbcS），RbcS2基因表達量高且相對穩(wěn)定，被用于微藻重組蛋白表達載體的構建。HSP70-Rbcs2嵌合啟動子是促進萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）外源基因表達的較好啟動子。含有HSP70和RBCS雙啟動子的蛋白質表達載體可以降低小球藻的轉基因沉默效應 。隨著研究的不斷深入，期待HSP70基因在油桐油脂代謝中的作用機制能被明確闡釋。這些研究結果不僅有助于人們理解植物在環(huán)境變化下的適應機制，也為改良油桐品種提供了新思路。

4" 結論

本研究從油桐全基因組數(shù)據(jù)中鑒定出HSP70家族基因，分析其理化性質、系統(tǒng)發(fā)育關系、染色體定位、基因結構、保守基序及表達特性等。與其他植物相比，油桐的HSP70基因家族成員數(shù)量適中（擬南芥18個，水稻32個，大豆61個，北美喬柏16個，喙葉泥炭蘚1個），油桐的HSP70蛋白等電點（4.57～8.70）與大戟科的麻瘋樹（5.06～6.06）相近，油桐HSP70蛋白主要為酸性的、親水性的、穩(wěn)定的蛋白質。有研究結果表明，HSP70蛋白的親水性能夠增強植物對非生物脅迫的抵御能力。HSP70基因編碼的蛋白質多定位于細胞質、葉綠體、細胞核和線粒體中，表明HSP70在油桐的整個生命活動中都發(fā)揮作用，其中較多的HSP70基因編碼的蛋白質定位于細胞質中，這可能與它所承擔的功能有關，即位于胞質的HSP70成員在信息傳遞到細胞核中的過程中起著至關重要的作用，從而對基因在細胞核內(nèi)的表達進行調(diào)節(jié)。由油桐系統(tǒng)發(fā)育進化樹、基因結構與保守基序結果綜合分析來看，同一聚類的蛋白質常具有相同或相似的結構，該結果與擬南芥、水稻、毛果楊、大豆的研究結果一致，可能是由于在進化過程中油桐基因組的串聯(lián)重復和隨機重復，串聯(lián)重復和隨機重復在基因家族的進化和擴張中發(fā)揮重要作用。其物種間進化樹分析結果表明，有5對直系同源基因，其中3對是毛果楊與油桐，說明油桐與毛果楊的親緣關系較為接近?；蚪Y構分析結果表明，屬同一進化分支的家族成員，具有明顯相同或相似的內(nèi)含子-外顯子數(shù)量結構特征；油桐基序分析結果表明，其中5個VfHSP70蛋白氨基酸序列包含全部10個保守基序，其余19個VfHSP70蛋白氨基酸序列均缺少部分Motif。以上結果表明，VfHSP70家族不同聚類在進化關系、基因結構、保守基序上均具有明顯的差異性。VfHSP70基因在油桐不同組織和器官中表達，這些結果表明它們可能參與油桐生長發(fā)育的各個過程，其中VfHSP70-5在開花前30 d到開花前10 d的花蕾中均有較高表達量，推測可能促進油桐花的發(fā)育；VfHSP70-4在根、莖、葉、種子中均有較高表達量，推測可能與油桐的生長發(fā)育有較強關聯(lián)。

低溫是影響油桐生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，本研究對油桐HSP70基因家族成員進行鑒定和生物信息學分析，系統(tǒng)揭示了油桐HSP70基因的理化性質、進化特點和表達特性等，為將來利用分子手段培育抗寒油桐新品種提供了理論基礎。

致謝：" 感謝合肥師范學院生物與食品工程學院陶瑞松副教授在本文進化樹研究工作中的支持與幫助！

參考文獻：

趙" 斌. 油桐的嫁接繁殖技術. 種子，2005（8）：118-120.

譚曉風. 油桐的生產(chǎn)現(xiàn)狀及其發(fā)展建議.經(jīng)濟林研究，2006，24（3）：62-64.

賀舍予，鐘海雁，金" 超，等. 桐油主要脂肪酸定量分析方法的構建及其應用. 中南林業(yè)科技大學學報，2014，34（5）：83-87.

張玲玲，彭俊華. 油桐資源價值及其開發(fā)利用前景. 經(jīng)濟林研究，2011，29（2）：130-136.

潘" 登. 兩步法催化桐油制備生物柴油工藝及動力學研究. 重慶：重慶大學，2009.

李永梅，魏遠新，周大林，等. 油桐的價值及其發(fā)展途徑. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（16）：113.

譚曉風，蔣桂雄，譚方友，等. 我國油桐產(chǎn)業(yè)化發(fā)展戰(zhàn)略調(diào)查研究報告. 經(jīng)濟林研究，2011，29（3）：1-7.

張慶偉，溫智婷，羅克明. 油桐生物學研究進展. 經(jīng)濟林研究，2020，38（4）：238-245.

黃健生. 油桐發(fā)展前景分析及豐產(chǎn)栽培技術.安徽農(nóng)學通報，2018，24（24）：71-72，95.

周" 靜，韓杰鋮，涂洲溢，等. 我國油桐籽的生產(chǎn)及發(fā)展對策. 中國油脂，2021，46（4）：118-122.

毛穎基. 油桐花發(fā)育及其性別決定機制研究. 合肥：中國科學技術大學，2017.

馮邦朝，黃" 艷，馬" 博，等. 大戟科主要木本油料植物組織培養(yǎng)快繁技術研究進展. 南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43（11）：1650-1654.

RITOSSA F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in drosophila. Experientia，1962，18（12）：571-573.

VIERLING E. The roles of heat shock proteins in plants. Annual Review of Plant Biology，1991，42：579-620.

MIEMYK J. The 70 kDa stress-related proteins as molecular chaperones. Trends in Plant Science，1997，2（5）：180-187.

DRAGOVIC Z， BROADLEY S A， SHOMURA Y， et al. Molecular chaperones of the Hsp110 family act as nucleotide exchange factors of Hsp70s. EMBO Journal，2006，25（11）：2519-2528.

LENG L， LIANG Q， JIANG J， et al. A subclass of HSP70s regulate development and abiotic stress responses in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Research，2017，130（2）：349-363.

AO P X， LI Z G， FAN D M， et al. Involvement of antioxidant defense system in chill hardening-induced chilling tolerance in Jatropha curcas seedlings. Acta Physiol Plant ，2013，35：153-160.

AO P X， LI Z G， GONG M. Involvement of compatible solutes in chill hardening-induced chilling tolerance in Jatropha curcas seedlings. Acta Physiol Plant，2013，35：3457-3464.

WANG H， ZOU Z， WANG S， et al. Global analysis of transcriptome responses and gene expression profiles to cold stress of Jatropha curcas L.. PLoS One，2013，8（12）：e82817.

WIMMER B， LOTTSPEICH F， VAN DER KLEI I， et al. The glyoxysomal and plastid molecular chaperones （70-kDa heat shock protein） of watermelon cotyledons are encoded by a single gene. PNAS，1997，94（25）：13624-13629.

LIN B， WANG J， LIU H， et al. Genomic analysis of the HSP70 superfamily in Arabidopsis thaliana. Cell Stress Chaperones，2001，6（3）：201-208.

SARKAR N K， KUNDNANI P， GROVER A. Functional analysis of HSP70 superfamily proteins of rice （Oryza sativa）. Cell Stress Chaperones，2013，18：427-437.

YER E N， BALOGLU M C， ZIPLAR U T， et al. Drought-responsive HSP70 gene analysis in populus at genome-wide level. Plant Molecular Biology Reporter，2016，34（2）：483-500.

江慎秀，王靜雅，莊婧怡，等. 油桐NPR1家族全基因組鑒定及表達模式分析. 植物遺傳資源學報，2021，22（2）：521-531.

張慶偉，溫智婷，羅克明. 油桐生物學研究進展. 經(jīng)濟林研究，2020，38（4）：238-245.

ZHANG L， LIU M， LONG H， et al. Tung tree （Vernicia fordii） genome provides a resource for understanding genome evolution and improved oil production. Genomics Proteomics Bioinformatics，2019，17（6）：558-575.

CHEN J， CHEN H， ZHANG Y， et al. TBtools an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological date. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

GUAN Y， LIU S， WU W， et al. Genome-wide identification and cold stress-induced expression analysis of the CBF gene family in Liriodendron chinense. Journal of Forestry Research，2021，32（6）：2531-2543.

宋晉輝，馬海蓮，翁巧云，等. 玉米HSP70基因家族的全基因組鑒定與分析. 核農(nóng)學報，2017，31（7）：1245-1254.

WILKINS M R， GASTEIGER E， BAIROCH A， et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods in Molecular Biology，1999，112：531-552.

HORTON P， PARK J， OBAYASHI T， et al. WoLF PSORT：protein localization predictor. Nucleic Acids Research，2007，35（2）：585-587.

CHEN Y J， CHENG S Y， LIU C H， et al. Exploration of the truncated cytosolic Hsp70 in plants-unveiling the diverse T1 lineage and the conserved T2 lineage. Frontiers in Plant Science，2023，14：1279540.

TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology And Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

HU B， JIN J， GUO Y， et al. GSDS 2.0：an upgraded gene feature visualization server. Bioinformatics，2015，31（8）：1296-1297.

BAILEY T L， BODEN M， BUSKE F A， et al. MEME SUITE：tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Research，2009，37（2）：202-208.

LIU W， YI Y， ZHUANG J， et al. Genome-wide identification and transcriptional profiling of the basic helix-loop-helix gene family in tung tree （Vernicia fordii）. Peer J，2022，10：e13981.

FENG N， SONG G， GUAN J， et al. Transcriptome profiling of wheat inflorescence development from spikelet initiation to floral patterning identified stage-specific regulatory genes. Plant Physiology，2017，174（3）：1779-1794.

GUO H， ZHANG H， WANG G， et al. Identification and expression analysis of heat-shock proteins in wheat infected with powdery mildew and stripe rust. Plant Genome，2021，14（2）：e20092.

孫旋輝，邴旭文，丁煒東，等. 高溫應激對鱖幼魚血清生化指標及肝臟sod基因和熱休克蛋白基因表達的影響. 南方農(nóng)業(yè)學報，2022，53（12）：3539-3547.

楚宗麗，李亮杰，姬" 虹，等. 小麥Hsp70基因家族鑒定及蛋白互作網(wǎng)絡分析. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2022，50（10）：37-44.

CHEN Z， JASINSKA W， ASHRAF M， et al. Lipidomic insights into the response of Arabidopsis sepals to mild heat stress. aBIOTECH，2023，4（3）：224-237.

CHEN X， SHI L， CHEN Y， et al. Arabidopsis HSP70-16 is required for flower opening under normal or mild heat stress temperatures. Plant Cell amp; Environment，2019，42：1190-1204.

RAN X， CHEN X， SHI L， et al. Transcriptomic insights into the roles of HSP70-16 in sepal’s responses to developmental and mild heat stress signals. Environmental and Experimental Botany，2020，179：104225.

陳錦玲. 大豆油脂和蛋白質合成與累積相關基因的表達及調(diào)控研究. 桂林：廣西師范大學，2020.

朱" 振. 萊茵衣藻核編碼葉綠體定位蛋白表達及其應用. 大連：大連工業(yè)大學，2018.

TOKUNAGA S， SANDA S， URAGUCHI Y， et al. Overexpression of the DOF-Type transcription factor enhances lipid synthesis in chlorella vulgaris. Applied Biochemistry and Biotechnology，2019，189（1）：116-128.

ZHANG L， ZHAO H K， DONG Q L， et al. Genome-wide analysis and expression profiling under heat and drought treatments of HSP70 gene family in soybean （Glycine max L.）. Frontiers in Plant Science，2015，6：773.

周" 輝，宋" 莉，趙德剛. 大腸桿菌 HspQ 基因的生物信息學分析.山地農(nóng)業(yè)生物學報，2018，37（5）：57-61.

徐劍文，趙 君，劉劍光，等. 芝麻全基因組Hsp70基因的鑒定與生物信息學分析. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2017，33（3）：493-502.

（責任編輯：成紓寒）