關(guān)鍵詞 雞； 枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑； 壞死性腸炎； 產(chǎn)氣莢膜梭菌

中圖分類(lèi)號(hào) S852.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）03-0275-07

雞壞死性腸炎（necrotic enteritis，NE）是由產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，CP）毒素引起的一種以空腸組織病變?yōu)橹鞯哪c道疾病，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素主要有α、β、ε、ι、腸毒素、壞死性腸炎B 樣毒素［1］。壞死性腸炎造成全球家禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)60 億美元［2］。長(zhǎng)期以來(lái)家禽飼料中添加抗生素以控制NE 的發(fā)生［3］，自2020 年7 月1 日起我國(guó)禁止在畜禽飼料中添加抗生素。研究表明，益生元、益生菌、精油、植物提取物和有機(jī)酸可以作為抗生素的潛在替代品［4］，但尋找1 種對(duì)雞壞死性腸炎安全有效的抗生素替代品尤為重要。有研究表明日糧中添加枯草芽孢桿菌可以提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善腸道形態(tài)、降低腸道病變?cè)u(píng)分，調(diào)控腸道微生物群［5-6］。但有關(guān)枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑對(duì)壞死性腸炎肉雞的影響報(bào)道較少。因此，本研究通過(guò)在日糧中分別添加以枯草芽胞桿菌、香芹酚、百里香酚、肉桂醛為主的微生物制劑和以枯草芽孢桿菌及其低溫發(fā)酵產(chǎn)物為主的微生物制劑，探討枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑對(duì)肉雞感染CP 后體質(zhì)量、腸道形態(tài)、抗氧化能力和腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響，旨在為該微生物制劑應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

1 日齡健康817 雛雞120 只（購(gòu)自襄陽(yáng)正大農(nóng)牧有限公司），隨機(jī)分成4 個(gè)處理組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只：空白對(duì)照（Control）組、預(yù)防1（Prob1）組、預(yù)防2（Prob2）組、壞死性腸炎（NE）組。試驗(yàn)第1～16 天 Control 組、NE 組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧，Prob1組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧和微生物制劑1，Prob2 組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧和微生物制劑2；試驗(yàn)第14～16 天，Prob1、Prob2、NE 組每只肉雞灌胃CP（3×108 cfu/d）；試驗(yàn)第17～23 天所有組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧。整個(gè)試驗(yàn)周期為23 d。

基礎(chǔ)日糧為510 肉小雞飼料，購(gòu)自襄陽(yáng)正大農(nóng)牧有限公司，飼料組成：粗蛋白質(zhì)≥20%、粗纖維≤6%、粗灰分≤8%、鈣0.6%～1.2%、總磷≥0.5%、氯化鈉0.2%～0.8%、蛋氨酸和胱氨酸≥0.74%、水分≤14%。G 型產(chǎn)氣莢膜梭菌由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存，攻菌前用FTG（液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基）增菌培養(yǎng)至3×10⁸ cfu/mL；復(fù)合微生態(tài)制劑由武漢新聯(lián)大生物有限公司提供，微生物制劑的添加劑量為0.2%。微生態(tài)制劑1 主要成分：枯草芽胞桿菌（10⁹ cfu/g）、2% 香芹酚、2.5% 百里香酚、8% 肉桂醛；微生態(tài)制劑2 主要成分：枯草芽胞桿菌（10⁷ cfu/g）及其低溫發(fā)酵產(chǎn)物（小肽20.79%）。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：總超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、堿性磷酸酶（AKP）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNAIsolater Total RNA Extraction Reagen、HiScript II QRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

主要儀器：ELX800 酶標(biāo)儀（BIO-TEK 公司）；Step One Plus 熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）；Nano-300 超微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1）肉雞體質(zhì)量和平均日增重的測(cè)定。于試驗(yàn)第14、23 天對(duì)肉雞稱(chēng)質(zhì)量并計(jì)算平均日增重（averagedaily gain，ADG）。

2）肉雞空腸形態(tài)觀(guān)察。于試驗(yàn)第17、23 天，每個(gè)處理組隨機(jī)選取10 只雞進(jìn)行屠宰，剪取空腸部位2cm 于4% 甲醛中固定后制成石蠟切片，用輪式切片機(jī)制作成4 μm 切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色后觀(guān)察各組肉雞腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。采用Nikon 80i 生物光學(xué)顯微鏡及高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)測(cè)量肉雞空腸絨毛長(zhǎng)度（villus length，VL）和隱窩深度（crypt depth，CD），并計(jì)算絨隱比。選取5 張切片進(jìn)行測(cè)定，取平均值。

3）肉雞空腸黏膜抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。采用試劑盒測(cè)定總超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）、堿性磷酸酶（AKP）活性、丙二醛（MDA）含量。

4）肉雞空腸緊密連接蛋白基因表達(dá)的測(cè)定。根據(jù)Trizol 法提取腸道黏膜RNA，采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度和純度。采用熒光定量RTPCR（qRT-PCR）檢測(cè)各組肉雞空腸緊密連接蛋白閉合蛋白（claudin，CLDN）-1、閉合小環(huán)蛋白（zonula occludens，ZO）-1 和ZO-2 的基因表達(dá)。參照文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)引物（表1）。

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR 擴(kuò)增體系（10 μL）：cDNA 模板0.5 μL，上下游引物各0.2 μL，2×chamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix 5 μL，ddH₂O 4.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性 5 min； 95 ℃ 5 s，56 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s。采用2^-ΔΔCt 法計(jì)算CLDN-1、ZO-1、ZO-2 基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0 分析數(shù)據(jù)，以O(shè)ne-wayANOVA 進(jìn)行Duncan’s 多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。Plt;0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑對(duì)肉雞生長(zhǎng)發(fā)育的影響

由表2 可知，試驗(yàn)第14 天，NE 組肉雞體質(zhì)量和平均日增重低于Control 組但無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）；Prob1 組肉雞體質(zhì)量顯著高于NE 組（Plt;0.05），日增重?zé)o差異（Pgt;0.05）；Prob2 組肉雞體質(zhì)量和日增重顯著高于NE 組（Plt;0.05）。試驗(yàn)第23 天，NE 組肉雞體質(zhì)量和平均日增重顯著低于Control 組（Plt;0.05）；Prob1 組和Prob2 組肉雞體質(zhì)量和日增重均顯著高于NE 組（Plt;0.05）。

2.2 枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑對(duì)肉雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1 可見(jiàn)，NE 組雞空腸絨毛頂端黏膜上皮可見(jiàn)變性壞死，脫落入管腔（圖1D、H），Control 組肉雞腸絨毛完整，未見(jiàn)明顯異常（圖1A、E）；試驗(yàn)第17、23天，Prob1 組（圖1B、F）、Prob2 組（圖1C、G）肉雞腸道結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病理變化。

由表3 可知，試驗(yàn)第17、23 天NE 組肉雞空腸絨毛長(zhǎng)度、絨隱比顯著低于Control 組（Plt;0.05），試驗(yàn)第17 天NE 組肉雞空腸隱窩深度顯著高于Control 組（Plt;0.05），試驗(yàn)第23 天無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。試驗(yàn)第17、23 天，Prob1、Prob2 組空腸絨毛長(zhǎng)度、絨隱比顯著高于NE 組（Plt;0.05），試驗(yàn)第17 天Prob1 組隱窩深度與NE 組無(wú)顯著差異（Pgt;0.05），Prob2 組隱窩深度顯著低于NE 組（Plt;0.05），第23 天Prob1、Prob2 組隱窩深度與NE 組無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。

2.3 枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑對(duì)肉雞空腸黏膜抗氧化指標(biāo)的影響

由表4 可知，試驗(yàn)第17 天，NE 組肉雞空腸黏膜T-SOD、T-AOC、AKP 活性顯著低于Control 組（Plt;0.05）；Prob1 組肉雞空腸黏膜T-SOD、T-AOC、AKP 活性顯著高于NE 組（Plt;0.05）；Prob2 組肉雞空腸黏膜T-SOD 活性高于NE 組但無(wú)顯著差異（Pgt;0.05），T-AOC 、AKP 活性顯著高于NE 組（Plt;0.05）；試驗(yàn)第23 天，NE 組肉雞空腸黏膜T-SOD、活性顯著低于Control 組（Plt;0.05），NE 組肉雞空腸黏膜T-AOC、AKP 活性低于Control 組但無(wú)顯著差異（Plt;0.05）；Prob1 組、Prob2 組肉雞空腸黏膜T-SOD、T-AOC、AKP 活性高于NE 組，差異不顯著（Pgt;0.05）。試驗(yàn)第17、23天，NE組肉雞空腸黏膜MDA含量高于Control 組，而Prob1、Prob2 組肉雞空腸黏膜MDA含量低于NE組，但均無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。

2.4 枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑對(duì)肉雞空腸緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

由表5 可知，試驗(yàn)第17 天，NE 組肉雞空腸CLDN-1 和ZO-2 基因表達(dá)量顯著低于Control 組（Plt;0.05），ZO-1基因表達(dá)量低于Control組但差異不顯著（Pgt;0.05）；Prob1 肉雞空腸ZO-1、ZO-2 基因表達(dá)量高于NE組，無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）；Prob2組肉雞空腸CLDN-1、ZO-1、ZO-2 基因表達(dá)量高于NE 組，無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。試驗(yàn)第23天，NE組肉雞空腸CLDN-1、ZO-1、ZO-2 基因表達(dá)量低于Control 組，無(wú)顯著差異（Pgt;0.05），ZO-1 基因表達(dá)量顯著低于Control組（Plt;0.05）；Prob1組、Prob2組肉雞空腸CLDN-1、ZO-2 基因表達(dá)量高于NE 組，無(wú)顯著差異（Pgt;0.05），ZO-1基因表達(dá)量顯著高于NE組（Plt;0.05）。

3討論

自畜禽飼料中禁止添加抗生素以來(lái)，益生菌、植物精油等抗生素替代品在養(yǎng)殖業(yè)尤其是預(yù)防畜禽胃腸道疾病中逐步受到重視［4］。

通常情況下，肉雞感染CP 會(huì)引起腸道黏膜受損，導(dǎo)致雞生長(zhǎng)遲緩和飼料轉(zhuǎn)化率降低［8］。本研究的組織學(xué)結(jié)果表明NE 組肉雞腸道上皮細(xì)胞壞死，2 種枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑不同程度緩解腸道病變。本研究雞群感染CP 后體質(zhì)量降低，這與Grilli等［9］報(bào)道的結(jié)果相似。在本研究中，枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑可以顯著提高肉雞的體質(zhì)量和日增重，同時(shí)感染CP 7 d 后Prob1 組肉雞體質(zhì)量顯著高于Prob2 組，添加以枯草芽孢桿菌為主要成分的微生物制劑可以明顯改善患有NE 雞群的生長(zhǎng)性能，這與胡均等［10］報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似，可能是微生物制劑可以調(diào)節(jié)腸道pH 值而抑制病原體的生長(zhǎng)。

小腸是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，絨毛（VL）越長(zhǎng)、隱窩（CD）越淺、VL/CD 值越大，代表小腸吸收能力越強(qiáng)［11］。連麗娜等［12］研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌制劑可以顯著提高腸道絨毛長(zhǎng)度和絨隱比，促進(jìn)絨毛生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中NE 組肉雞腸絨毛變短并且絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度的比值降低，通過(guò)在日糧中添加枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑可以提高肉雞的絨毛長(zhǎng)度、絨隱比且Prob1 組肉雞腸絨毛長(zhǎng)度要高于Prob2 組。

CLDN、ZO 是緊密連接蛋白，緊密連接蛋白對(duì)維持腸道屏障功能至關(guān)重要，具有調(diào)節(jié)免疫、轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)、防止病原體入侵等作用［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，NE組空腸絨毛頂端黏膜上皮可見(jiàn)變性壞死、脫落入管腔，表明腸上皮細(xì)胞緊密連接受損，同時(shí)緊密連接蛋白基因表達(dá)量下降也印證了這一點(diǎn)。本研究使用枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑使空腸組織CLDN1、ZO-1、ZO-2 基因表達(dá)量有所升高，提高了腸道黏膜屏障的防御能力。

MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，而SOD 是一種抗氧化物酶，高活性SOD 可以清除氧自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生［15］。有研究通過(guò)飼喂重組枯草芽孢桿菌制劑提高肉雞的SOD 活性、降低MDA 含量來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力［16］；而聯(lián)合添加益生菌和酶制劑也可以減少腸道脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，顯著降低腸道MDA 含量，同時(shí)提高SOD 活性［17］。同時(shí)，有文獻(xiàn)報(bào)道香芹酚、百里香酚、肉桂醛等精油具有抗氧化作用［18］。因此本研究設(shè)計(jì)中Prob1 組將枯草芽孢桿菌和植物精油同時(shí)添加。結(jié)果表明CP 可引起肉雞腸道內(nèi)SOD 活性和總抗氧化能力T-AOC 活性降低，MDA 含量升高；Prob1 組、Prob2 組肉雞空腸黏膜TSOD活性高于NE 組，MDA 含量均低于NE 組。說(shuō)明在日糧中添加枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑可以提高肉雞的抗氧化能力，Prob1 組肉雞抗氧化能力要高于Prob2 組可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌和植物精油的協(xié)同作用。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是廣泛分布于機(jī)體組織器官的單磷脂水解酶，主要分為組織非特異性和組織特異性AKP，如腸堿性磷酸酶（intestinalalkaline phosphatase，IAP）［19］。IAP 過(guò)表達(dá)可以提高腸道緊密連接蛋白基因ZO-1、ZO-2 表達(dá)量，調(diào)節(jié)腸道屏障功能［20］。本試驗(yàn)中，感染CP 后腸道黏膜AKP 活性降低，Prob1、Prob2 組空腸黏膜的AKP活性升高，說(shuō)明枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑可能通過(guò)提高空腸的AKP 活性從而調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)量。

綜上，日糧添加枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑可以促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)、改善腸道形態(tài)、提高腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)和機(jī)體抗氧化能力，其中枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物制劑1 的預(yù)防效果更好。

（責(zé)任編輯：邊書(shū)京）