摘 要： 為了提升透明質酸鈉（Sodium hyaluronate， SH）的力學性能，采用仿生礦化方法，將磷酸鈣寡聚體（Calcium phosphate oligomers， CPO）與SH復合形成透明質酸鈉復合材料（SH-CPO），對SH-CPO的形貌、結構、流變學特性及壓縮性能進行了測試與表征。結果表明：SH不僅與CPO具有良好的相互作用，反應后能形成內部結構連續(xù)的復合材料，還能誘導CPO發(fā)生從無定形到結晶相的轉變；在SH與CPO的質量比為1∶1～1∶10范圍內，隨著CPO投料比例的增加，制備的SH-CPO復合材料的黏度得到提升，壓縮強度可達到53.5 MPa。該研究制備的SH-CPO復合材料具有良好的力學性能，在生物醫(yī)學材料領域中具有良好的應用潛力。

關鍵詞： 仿生礦化；透明質酸鈉；磷酸鈣寡聚體；復合材料；力學性能

中圖分類號： TB33

文獻標志碼： A

文章編號： 1673-3851 （2024） 05-0292-08

引文格式：陳思穎，謝番，趙瑞波，等. 仿生礦化透明質酸鈉復合材料的制備及其性能分析［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2024，51（3）：292-299.

Reference Format： CHEN Siying， XIE Fan， ZHAO Ruibo， et al. Preparation of biomimetic mineralized sodium hyaluronate composites and the analysis of their properties［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2024，51（3）：292-299.

Preparation of biomimetic mineralized sodium hyaluronate composites and the analysis of their properties

CHEN Siying， XIE Fan， ZHAO Ruibo， KONG Xiangdong

（School of Materials Science amp; Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract：" To improve the mechanical properties of sodium hyaluronate （SH）， calcium phosphate oligomers （CPO） were combined with SH to form sodium hyaluronate composites （SH-CPO） by biomimetic mineralization method. The morphology， structure， rheological and compressive properties of the composites were characterized and tested. The results showed that SH interacted well with CPO and could form composites with continuous internal structure， inducing the transformation of CPO from amorphous to crystalline phase. In the 1∶1～1∶10 mass ratio range of SH to CPO， with the increase of CPO content， not only the viscosity of the prepared SH-CPO composites was improved， but also the compressive resistance could reach 53.5 MPa. The SH-CPO composites prepared in this study have good mechanical properties and application potential in biomedical materials.

Key words： biomimetic mineralization; sodium hyaluronate; calcium phosphate oligomers; composite materials; mechanical property

0 引 言

透明質酸（Hyaluronic Acid， HA）是一種線性陰離子多糖，具有良好的生物相容性，廣泛應用于眼科疾病治療［1-2］、術后組織黏連預防［3-4］、傷口組織修復［5-6］等醫(yī)用領域。然而，透明質酸較差的機械強度限制了其在臨床上的應用。為解決這一難題，研究人員采用化學交聯方法對透明質酸分子鏈中的活性基團（如羧基、羥基等）進行化學修飾來提升透明質酸材料的力學性能［7-8］。其中，戊二醛交聯劑作為一種常用的化學交聯劑［9］，可與透明質酸交聯形成具有良好穩(wěn)定性的水凝膠；丁二醇二縮水甘油醚（BDDE）交聯劑能在堿性環(huán)境下開環(huán)，與透明質酸中的羧基結合形成醚鍵，可提升透明質酸水凝膠的機械性能［10］。通過添加交聯劑的方式對透明質酸進行化學改性，可以提升其力學性能，但存在制備過程復雜，可能引發(fā)潛在的安全隱患等問題。無機材料摻雜到透明質酸中也是一種提高透明質酸力學性能的方式。Valls-Lluch等［11］將納米磷酸鈣摻雜到透明質酸中，可顯著提升復合材料的力學性能，在組織工程中展現出較好的應用潛力，但摻雜的無機材料在復合材料中結構連續(xù)性低且分布不均，限制了透明質酸材料力學性能的進一步提升［12］。因此，尋找一種能安全快速提高透明質酸力學性能的方法，對拓展透明質酸材料在生物醫(yī)學材料領域中的應用具有重要意義。

生物礦化是生命體利用有機分子調控無機礦物形成硬組織材料（如牙齒、骨等）的主要過程［13］。仿生礦化方法在制備具有高韌性、高力學強度材料領域具有良好的應用潛力［14］。Liu等［15］成功制備了多種含氧酸鹽寡聚體材料（如磷酸鈣寡聚體、碳酸鈣寡聚體等），并將磷酸鈣寡聚體（Calcium phosphate oligomers， CPO）與聚乙烯醇、海藻酸鈉復合形成具有連續(xù)結構和高力學性能有機無機雜化材料［16］。由于寡聚體尺寸小（約1 nm）、比表面積高，可增加無機單元與有機基質之間的接觸面積，從而減少有機-無機復合界面的缺陷，并增強復合材料內部的相互作用［17］。因此，將CPO與透明質酸鈉（Sodium Hyaluronate， SH）復合有望提高材料的力學性能。

本文以CPO與SH為原料，通過SH的羧基、羥基分別與CPO中的Ca2+、PO43-的相互作用，誘導CPO與SH礦化復合，制備透明質酸鈉復合材料（SH-CPO）。通過TEM、XRD、FT-IR和SEM表征復合材料的形貌和結構，通過流變學特性測試、力學性能測試分析復合材料的黏性、彈性和壓縮強度變化，以探索加入不同質量的CPO對復合材料流變學特性及力學性能的影響。本文提出的復合材料制備方法簡單，為SH在生物醫(yī)學材料領域中的拓展提供新思路。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

無水氯化鈣、三乙胺和正磷酸（上海泰坦化學有限公司）；無水乙醇（杭州米克化工有限公司）和透明質酸鈉（100～150 kDa，上海葉源生物科技有限公司）。所有試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 CPO的制備

CPO制備方法參考文獻［15］，具體方法如下：將8.88 g的無水氯化鈣溶解于1.60 L無水乙醇中，攪拌2 h后形成透明溶液，將221.79 mL三乙胺（TEA）加入到無水氯化鈣溶液中，磁力攪拌30 min，制得溶液A。將4.18 mL正磷酸加入到80 mL無水乙醇中，混合均勻制得溶液B，將溶液B緩慢滴加到保持攪拌的溶液A中，混合完成后以600 r/min的轉速攪拌，12 h后停止反應。以6000 r/min的轉速離心溶液5 min，棄上清后得到膠狀CPO。上述反應均在常溫下進行。

1.2.2 SH-CPO及SH-磷酸鈣顆粒復合材料的制備

SH-CPO復合材料具體合成方案如下：將2.00 g SH（100～150 kDa）溶解于200 mL去離子水中，常溫下以800 r/min的速率攪拌12 h形成透明凝膠溶液，各取40 mL SH加入100 mL燒杯中。將制備好的CPO用乙醇離心重懸洗滌兩次，去除上清，將SH和CPO按照質量比1∶1、1∶5、1∶10和1∶20加入到燒杯中混合，在1200 r/min的攪拌速率下常溫攪拌48 h得到均勻的SH-CPO復合材料。在保持制備條件不變的情況下，將4.00 g磷酸鈣顆粒（CaP）加入到裝有40 mL的SH溶液的燒杯中，得到SH-CaP復合材料。SH-CPO復合材料的合成路線示意圖見圖1，不同原料質量比制備的復合材料樣品名稱見表1。

1.3 測試與表征

1.3.1 透射電子顯微鏡表征

采用透射電子顯微鏡（TEM， JEM-2100， 日本）觀察磷酸鈣寡聚體、經過磷鎢酸負染方式處理后的SH和經過超純水稀釋后的SH-CPO復合材料的微觀形貌和衍射花樣。

1.3.2 X射線粉末衍射測試

采用X射線粉末衍射儀（XRD， A8 Advance， 美國）對自然干燥后的SH-CPO復合材料進行晶體結構分析。衍射角2θ范圍為3°～80°，掃描速度0.2步/s。

1.3.3 傅里葉紅外光譜測試

采用傅里葉紅外光譜儀（FT-IR， Nicolte 5700， 美國）對自然干燥后的SH-CPO復合材料進行結構分析，波長范圍設置為4000～500 cm-1，每次測試前均進行背景采集及基線校正。

1.3.4 場發(fā)射掃描電子顯微鏡表征

采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM， GeminiSEM 500， 德國）觀察SH、SH-CaP和SH-CPO-10復合材料的微觀形貌。

1.3.5 流變學特性測試

使用旋轉流變儀（RH. MCR52， 澳大利亞）對SH和SH-CPO復合材料的流變學特性進行測試，剪切速率設置為0.1～100 s-1，頻率范圍設置為0.1～10 Hz。

1.3.6 力學性能測試

采用萬能試驗機（UTM， 5943， 美國）對常溫干燥后的SH-CPO復合材料的力學性能進行測試，壓縮速率設置為10 mm/min，壓縮應變?yōu)?0%時停止檢測。

1.3.7 體視顯微鏡表征

采用體視鏡（NSZ-608T， 中國）觀察SH-CPO復合材料在壓縮前后的外觀變化。

2 結果與討論

2.1 CPO結構分析

圖2為CPO的TEM圖和XRD譜圖。從圖2（a）可知，CPO的內部結構為單分散的納米顆粒，尺寸大約為1～2 nm。從圖2（b）可知，CPO是一種非晶態(tài)材料，該結果與前人報道的結果相一致［15］。

2.2 SH-CPO復合材料形貌及結構分析

圖3（a）為SH的TEM圖SH呈隨機線圈狀，與文獻報道結果相一致［18］；圖3（b）—（e）為SH-CPO復合材料的TEM圖，SH能與CPO發(fā)生礦化形成纖維狀復合材料。圖3（b）—（e）內插圖為纖維狀復合物區(qū)域的選區(qū)電子衍射結果，SH-CPO中均出現羥基磷灰石（HAP）（211）晶面，SH-CPO-5和SH-CPO-10結果中出現羥基磷灰石（002）晶面，證明SH具有誘導CPO礦化并向羥基磷灰石晶體轉變的作用效果。

圖4為SH-CPO復合材料的XRD譜圖。由圖4可知：SH沒有明顯結晶峰，SH-CPO復合材料中均出現（002）和（211）晶面的衍射特征峰；除此之外，SH-CPO-5在2θ=47°處出現（222）晶面的衍射特征峰，SH-CPO-10在2θ=47°和2θ=49°處出現（222）和（213）晶面的衍射特征峰。通過與羥基磷灰石晶體PDF卡比對，XRD結果顯示復合材料中出現的衍射峰為羥基磷灰石的（002）、（211）、（222）和（213）晶面的特征衍射峰［19］，表明SH在與CPO反應過程中，CPO發(fā)生了從無定形相到結晶相的轉變，與圖3中選區(qū)電子衍射結果一致；但當SH和CPO投料比為1∶20時，高濃度CPO發(fā)生團聚，在與SH復合時影響有機/無機界面的微觀復合，影響復合材料中CPO的結晶過程，導致在該投料比下復合材料的XRD譜圖中僅出現（002）和（211）晶面的衍射特征峰，且特征峰的強度降低。

圖5為SH-CPO-10、SH和CPO的紅外光譜圖。由圖5可知：SH在1666 cm-1和1047 cm-1處出現吸收峰，分別歸因于為透明質酸鈉分子鏈中CO伸縮振動和C—O—C伸縮振動［20-21］；CPO在587 cm-1處出現吸收峰，歸因于PO43-中P—O伸縮振動［21］。對比SH和CPO紅外光譜曲線可發(fā)現，復合材料中上述3個特征峰均出現紅移現象，這是由于PO43-和—OH之間形成的氫鍵作用以及Ca2+和—COOH之間的相互作用［22-24］，表明成功合成了SH-CPO復合材料。

圖6為SH、SH-CPO-10和SH-CaP的SEM圖。由圖6可知：SH的內部結構平整，在加入CPO后復合材料表面呈現出均勻且連續(xù)的結構特征并無明顯缺陷，而SH-CaP表面粗糙且排列無序，表明將CPO添加到有機網絡中可以獲得內部結構均勻且連續(xù)的復合材料。

2.3 SH-CPO復合材料流變學特性分析

圖7（a）為SH和SH-CPO復合材料的黏度與剪切速率曲線。由圖7（a）可知：SH和SH-CPO復合材料的黏度均隨著剪切速率的增加而下降，表現出剪切稀化行為；SH-CPO-10的剪切黏度最高，表明CPO與SH之間存在相互作用，增加CPO的投料比例會使得復合材料內部分子間的相互作用力增強，從而提高復合材料的剪切黏度；此外，在SH和CPO質量比為1∶20時，SH-CPO-20的剪切黏度并沒有得到進一步提升，表明過量的CPO會發(fā)生團聚，在聚合物基體中無法均勻分散，導致SH-CPO復合材料內摩擦力減小，黏度降低。圖7（b）為SH和SH-CPO復合材料的模量-頻率曲線。由圖7（b）可知：隨著頻率的增加，SH和SH-CPO復合材料的儲能模量（G′）始終大于損耗模量（G″），表明隨著頻率的增加，SH和SH-CPO復合材料的彈性行為始終大于黏性行為。在SH和CPO質量比為1∶1～1∶10范圍內，SH-CPO復合材料的G′隨著CPO投料比例的增加明顯增加，進一步表明SH-CPO復合材料的彈性隨著CPO投料比例的增加得到提高；SH-CPO-20的G′低于SH-CPO-10的G′，進一步表明過量的CPO會減弱其與SH反應過程中有機組分和無機組分的分子間吸引力，抑制SH-CPO復合材料的剪切黏度和彈性的提升。

2.4 SH-CPO復合材料力學性能分析

圖8為SH-CPO復合材料壓縮前后對比圖。由圖8可知：SH-CPO-1和SH-CPO-5由于受到外部力量擠壓，在撤去壓縮應力后出現起皺和斷裂現象，而在SH和CPO質量比為1∶10和1∶20時，SH-CPO復合材料均發(fā)生橫向變形，表明隨著CPO投料比例的增加，SH-CPO復合材料內分子間作用力得到提升。

圖9為SH-CPO復合材料的壓縮應力-應變曲線。由圖9可知：SH-CPO復合材料的壓縮強度隨CPO投料比例的增加呈增強趨勢，SH-CPO-1的壓縮強度為1.2 MPa，隨著CPO投料比例的增加，SH-CPO-10的壓縮強度增加至53.5 MPa；由于復合材料的力學性能與材料內部結構密切相關［25］，在SH和CPO投料比為1∶1～1∶10范圍內，隨著CPO投料比例的增加，與SH發(fā)生反應的無機組分增加，從而提高了SH-CPO復合材料的壓縮強度。SH-CPO-20的壓縮強度并沒有因為加入更多的CPO而得到顯著提升，表明在CPO投料比例過多的情況下分散性較差，與聚合物之間的界面作用受到影響［26］，表明CPO過量會影響SH-CPO復合材料的壓縮強度進一步提升。

3 結 論

本文以CPO與SH為原料，通過改變CPO的投料比例，采用仿生礦化方法制備了不同CPO質量比的SH-CPO復合材料，并分析復合材料的形貌結構、流變學特性和力學性能，主要結論如下：

a）CPO與SH具有良好的分子間相互作用，SH不僅能與CPO反應后形成纖維狀復合材料，還能誘導CPO向羥基磷灰石晶體轉變。

b）與SH-CaP復合材料相比，通過仿生礦化方式制備的SH-CPO復合材料內部結構連續(xù)且更加均勻。

c）CPO投料比例的增加能夠顯著增強SH-CPO復合材料的剪切黏度、彈性，壓縮強度得到提升，其中SH-CPO-10的黏彈性得到顯著提升，壓縮應力提高到53.5 MPa。

本文制備的SH-CPO復合材料內部結構連續(xù)，且具有良好的力學性能，為將來拓展SH復合材料在生物醫(yī)學材料領域中的應用提供了新思路。

參考文獻：

［1］Chae J J， Jung J H， Zhu W， et al. Drug-free， nonsurgical reduction of intraocular pressure for four months after suprachoroidal injection of hyaluronic acid hydrogel［J］. Advanced Science， 2021， 8（2）： 2001908.

［2］Raia N R， Jia D， Ghezzi C E， et al. Characterization of silk-hyaluronic acid composite hydrogels towards vitreous humor substitutes［J］. Biomaterials， 2020， 233： 119729.

［3］Cai Z X， Tang Y M， Wei Y， et al. Physically cross-linked hyaluronan-based ultrasoft cryogel prepared by freeze-thaw technique as a barrier for prevention of postoperative adhesions［J］. Biomacromolecules， 2021， 22（12）： 4967-4979.

［4］Li Z Y， Liu L X， Chen Y M. Dual dynamically crosslinked thermosensitive hydrogel with self-fixing as a postoperative anti-adhesion barrier［J］. Acta Biomaterialia， 2020， 110： 119-128.

［5］Jin Y J， Koh R H， Kim S H， et al. Injectable anti-inflammatory hyaluronic acid hydrogel for osteoarthritic cartilage repair［J］. Materials Science and Engineering： C-Materials for Biological Applications， 2020， 115： 111096.

［6］Galarraga J H， Locke R C， Witherel C E， et al. Fabrication of MSC-laden composites of hyaluronic acid hydrogels reinforced with MEW scaffolds for cartilage repair［J］. Biofabrication， 2022， 14（1）： 041406.

［7］Burdick J A， Prestwich G D. Hyaluronic acid hydrogels for biomedical applications［J］. Advanced Materials， 2011， 23（12）： 41-56.

［8］Khanlari A， Schulteis J E， Suekama T C， et al. Designing crosslinked hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties for biomedical applications［J］. Journal of Applied Polymer Science， 2015， 132（22）： 42009.

［9］Crescenzi V， Francescangeli A， Taglienti A， et al. Synthesis and partial characterization of hydrogels obtained via glutaraldehyde crosslinking of acetylated chitosan and of hyaluronan derivatives［J］. Biomacromolecules， 2003， 4（4）： 1045-1054.

［10］Choi S C， Yoo M A， Lee S Y， et al. Modulation of biomechanical properties of hyaluronic acid hydrogels by crosslinking agents［J］. Journal of Biomedical Materials Research Part A， 2015， 103（9）： 3072-3080.

［11］Valls-Lluch A， Poveda-Reyes S， Amors P， et al. Hyaluronic acid-silica nanohybrid gels［J］. Biomacromolecules， 2013， 14（12）： 4217-4225.

［12］Li Z Y， Su Y L， Xie B Q， et al. A tough hydrogel-hydroxyapatite bone-like composite fabricated in situ by the electrophoresis approach［J］. Journal of Materials Chemistry B， 2013， 1（12）： 1755-1764.

［13］Cao H， Pan H H， Tang R K. Materials enhanced by biomimetic mineralization［J］. Chinese Journal of Inorganic Chemistry， 2019， 35（11）： 1957-1973.

［14］金曄麗， 潘海華， 唐睿康. 仿生礦化與硬組織修復［J］. 無機化學學報， 2020， 36（7）： 719-734.

［15］Liu Z M， Shao C Y， Jin B， et al. Crosslinking ionic oligomers as conformable precursors to calcium carbonate［J］. Nature， 2019， 574（7778）： 394-398.

［16］Yu Y D， Guo Z X， Zhao Y G， et al. A flexible and degradable hybrid mineral as a plastic substitute［J］. Advanced Materials， 2022， 34（9）： 2107523.

［17］Yu Y D， Kong K R， Tang R K， et al. A bioinspired ultratough composite produced by integration of inorganic ionic oligomers within polymer networks［J］. ACS Nano， 2022， 16（5）： 7926-7936.

［18］Fessler J H， Fessler L I. Electron microscopic visualization of the polysaccharide hyaluronic acid［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1966， 56： 141-147.

［19］Yu Y D， He Y， Mu Z， et al. Biomimetic mineralized organic-inorganic hybrid macrofiber with spider silk-like supertoughness［J］. Advanced Functional Materials， 2020， 30（6）： 201908556.

［20］Ghobashy M M， El-Sawy N M， Kodous A S. Nanocomposite of cosubstituted carbonated hydroxyapatite fabricated inside Poly（sodium hyaluronate-acrylamide） hydrogel template prepared by gamma radiation for osteoblast cell regeneration［J］. Radiation Physics and Chemistry， 2021， 183： 109408.

［21］Svarca A， Grava A， Dubnika A， et al. Calcium phosphate/hyaluronic acid composite hydrogels for local antiosteoporotic drug delivery［J］. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology， 2022， 10： 917765.

［22］Wang Y J， Zhang X N， Song Y H， et al. Ultrastiff and tough supramolecular hydrogels with a dense and robust hydrogen bond network［J］. Chemistry of Materials， 2019， 31（4）： 1430-1440.

［23］Fazal T， Murtaza B N， Shah M Z， et al. Recent developments in natural biopolymer based drug delivery systems［J］. RSC Advances， 2023， 13（33）： 23087-23121.

［24］Papageorgiou S K， Kouvelos E P， Favvas E P， et al. Metal-carboxylate interactions in metal-alginate complexes studied with FTIR spectroscopy［J］. Carbohydrate Research， 2010， 345（4）： 469-473.

［25］Wegst U G K， Bai H， Saiz E， et al. Bioinspired structural materials［J］. Nature Materials， 2015， 14（1）： 23-36.

［26］Zeng X F， Chen J F， Zhao H Y. Microstructure and mechanical properties of Nano-CaCO3-PVC composites［J］. Journal of Beijing University of Chemical Technology， 2001， 28（4）： 1-3.

（責任編輯：張會?。?/p>