關(guān)鍵詞氯蟲苯甲酰胺；廣雙瘤蚜繭蜂；存活率；存活時間；共生菌

氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）是美國杜邦公司研制的一種新型鄰甲酰胺基苯甲酰胺類殺蟲劑，通過激活昆蟲魚尼?。╮yanodine receptor）受體，使昆蟲麻痹抽搐致死。已有的研究表明，氯蟲苯甲酰胺對環(huán)境生物蚯蚓和蜜蜂等表現(xiàn)為低毒，對家蠶表現(xiàn)為劇毒，而對天敵瓢蟲則屬于中風險。隨著生物防治技術(shù)的廣泛推廣，殺蟲劑對天敵昆蟲的威脅也逐漸受到了關(guān)注，因此，了解氯蟲苯甲酰胺對天敵昆蟲的影響是非常重要的。

棉蚜Aphis gossypii Glover廣泛分布于世界各國，是棉花的重要害蟲。廣雙瘤蚜繭蜂廣泛分布于棉田，是棉蚜優(yōu)勢寄生蜂。在田間施用化學(xué)農(nóng)藥能減少病蟲草害的發(fā)生，有利于作物的生長，但同時也影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的其他成分，例如會導(dǎo)致廣雙瘤蚜繭蜂直接或間接地接觸到農(nóng)藥。

在蚜蟲和寄生蜂之間可能存在一種由共生菌調(diào)控的協(xié)同進化競爭的關(guān)系。有學(xué)者研究了小菜蛾（抗氟苯蟲酰胺品系）腸道細菌對氟苯蟲酰胺的耐受性以及生物降解能力，發(fā)現(xiàn)腸桿菌、沙雷氏菌和肉桿菌等組成的混合菌對氟苯蟲酰胺具有生物降解功能，證實了腸道微生物在小菜蛾的抗藥性中發(fā)揮了作用。感染沙雷氏菌可以提高桃蚜對短翅蚜小蜂的防御作用與高溫耐受性，共生菌能夠明顯縮短桃蚜發(fā)育時間，增加蚜蟲的繁殖力。目前，雖然昆蟲體內(nèi)的微生物多樣性已經(jīng)被廣泛研究，但大多數(shù)研究都集中在腸道微生物。而關(guān)于評價寄生性天敵昆蟲在接觸到殺蟲劑時體內(nèi)微生物種群是否會受到影響仍不清楚。

本研究旨在明確氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量（66.7mg/L）對廣雙瘤蚜繭蜂當代和子代存活率和存活時間的影響以及體內(nèi)共生菌組成的變化情況，為更好地了解氯蟲苯甲酰胺對寄生性天敵的影響和氯蟲苯甲酰胺的安全應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

廣雙瘤蚜繭蜂和棉蚜均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗農(nóng)場（36°05'N．114°31'E）。廣雙瘤蚜繭蜂成蜂以棉蚜2齡若蚜為寄主進行擴繁，供試棉蚜為單個棉蚜在棉花上孤雌繁殖形成的種群，用網(wǎng)籠（30cm×30cm×30cm）飼養(yǎng)。試驗昆蟲均為繼代飼養(yǎng)10代以上無農(nóng)藥背景的種群，飼養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，相對濕度（65±5）%，光周期L∥D=14h∥10h。

棉花品種為‘中棉所49'，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)資源庫提供，在（26±1）℃，相對濕度（75±5）%，光周期L∥D=14h∥10h條件下培育。氯蟲苯甲酰胺原藥購自安陽全豐生物科技有限公司（CAS號：500008-45-7），田間推薦劑量為66.7mg/L，本文的試驗均采用此濃度。

1.2氯蟲苯甲酰胺暴露對F0和F1代廣雙瘤蚜繭蜂的影響

使用藥膜法進行試驗。氯蟲苯甲酰胺原藥用丙酮溶解后配制成濃度為66.7mg/L的藥液，吸取2～3ml藥劑于離心管中（7mL），快速轉(zhuǎn)動離心管使藥液均勻分布于離心管內(nèi)壁，然后靜置，待管內(nèi)壁藥劑全部蒸發(fā)干燥后得到有均勻藥膜的干燥離心管，以0.1% Triton X-100溶液處理的離心管為對照。將羽化24h內(nèi)的廣雙瘤蚜繭蜂成蜂20頭接入離心管內(nèi)使其充分爬行1h，然后收集雌蜂和雄蜂，按寄生蜂：棉蚜=1：10的比例將成對寄生蜂移人接有30頭2齡棉蚜若蚜的新鮮棉花真葉上使其充分寄生8h，然后轉(zhuǎn)移至自制干凈無藥劑且有足夠多氣孔的離心管內(nèi)，為確保充足的營養(yǎng)供給，用含有20%蜂蜜水溶液的棉球飼喂廣雙瘤蚜繭蜂。每24h觀察并統(tǒng)計寄生蜂的存活率和存活時間，直至其死亡。每處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。同時，將棉蚜轉(zhuǎn)移到1.8%瓊脂培養(yǎng)皿中（皿內(nèi)放有棉花子葉），于溫度（25±1）℃，相對濕度（75±5）%，光周期L∥D=14h∥10h的人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)。每48h更換1次培養(yǎng)皿和棉花葉片，至F1代廣雙瘤蚜繭蜂羽化后，收集雌蜂和雄蜂，使其在不接觸藥劑的條件下寄生棉蚜，處理方法同前，統(tǒng)計F1代廣雙瘤蚜繭蜂的存活率和存活時間等生物學(xué)數(shù)據(jù)。

1.3氯蟲苯甲酰胺暴露對廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生茵多樣性的影響

1.3.1廣雙瘤蚜繭蜂總DNA提取

分別用氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量處理廣雙瘤蚜繭蜂1h和3d，然后將30頭存活的廣雙瘤蚜繭蜂（統(tǒng)稱為1個生物學(xué)重復(fù)）保存在無酶離心管中。以0.1% Triton X-100溶液制備的藥膜離心管處理為空白對照。每處理組均包含6個生物學(xué)重復(fù)。將廣雙瘤蚜繭蜂樣本用75%乙醇進行表面消毒，再用無菌ddH2O反復(fù)沖洗，晾干后使用FastDNA⑥Spin Kitfor Soil（MP Biomedicals，Arnerica）提取并純化DNA。

1.3.2共生菌的多樣性分析

通過Miseq測序技術(shù)得到雙端序列數(shù)據(jù)（paired-end reads．PE reads）。采取基于窗口的低質(zhì)量數(shù)據(jù)去除策略進行質(zhì)控，窗口大小設(shè)定為50bp，去除低于Q20質(zhì)量的reads，長度不足50bp的reads以及包含N堿基的reads，以確保數(shù)據(jù)的純凈性。將得到的高質(zhì)量PE reads，以overlap長度至少為10 bp進行拼接，在拼接過程中允許一定程度的錯配，但將錯配比率控制在0.2以下，剔除所有不符合這一標準的序列，根據(jù)序列兩端的barcode和引物信息對樣品進行區(qū)分。barcode序列與reads要求完全匹配，不允許任何錯配；而引物的錯配數(shù)則不得超過2。最后，基于序列間的重疊關(guān)系用FLASH軟件將雙末端測序所得的成對reads組裝為單一序列，進而獲取了高變區(qū)的Tags。在拼接過程中設(shè)定15bp為最小匹配長度且允許重疊區(qū)域存在0.1以內(nèi)的錯配率，以確保組裝結(jié)果的準確性和可靠性。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后，在97%相似性閾值下，按相似性進行聚類，獲得ASV（amplicon sequence variant），每個ASV對應(yīng)1個物種。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用GraphPad Prism 8軟件分析存活率和存活時間數(shù)據(jù)并繪制圖表，采用獨立樣本t檢驗分析處理和對照之間的差異顯著性。

針對每個ASV所對應(yīng)物種采用多種方法進行a多樣性分析，包括classify-sklearn（基于樸素貝葉斯）、classify-consensus-Vsearch（基于Vsearch）、classify-consensus-Blast（基于Blast）以及RDP clas-sifier貝葉斯算法。為評估菌群豐度，采用Ace指數(shù)和Chao指數(shù)作為關(guān)鍵度量標準，其數(shù)值升高表明群落物種豐富度增加。菌群多樣性通過Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來評估，Shannon指數(shù)與群落多樣性之間存在正相關(guān)性，即指數(shù)值越高多樣性越豐富；而Simpson指數(shù)則與多樣性呈負相關(guān)，即指數(shù)值越低多樣性越高。此外，為全面評估菌群多樣性加入了覆蓋率這一指標來衡量測序深度。

2結(jié)果與分析

2.1氯蟲苯甲酰胺暴露后F0代廣雙瘤蚜繭蜂的存活率和存活時間

接觸田間推薦劑量的氯蟲苯甲酰胺（CAP）1h對廣雙瘤蚜繭蜂的存活率沒有顯著影響（t=0.923，P=0.408），對照組和處理組的存活率分別為62.20%、69.45%（圖1a）；但廣雙瘤蚜繭蜂的存活時間顯著縮短（t=6.326，P=0.003），CAP暴露1h存活時間僅為2.9d，對照組存活時間為4.6d（圖1b）。

2.2氯蟲苯甲酰胺暴露后Fi代廣雙瘤蚜繭蜂的存活率和存活時間

為明確接觸氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量對廣雙瘤蚜繭蜂是否存在代際傳遞效應(yīng)，對接觸氯蟲苯甲酰胺1h后正常寄生產(chǎn)生的F1代寄生蜂的存活率和存活時間進行了測定。結(jié)果（圖2）表明，與對照組F1代廣雙瘤蚜繭蜂存活率（83.33%）相比，CAP處理組F1代的存活率（61.31%）呈現(xiàn)出下降的趨勢，但未達到顯著水平（t=1.781，P=0.150）。廣雙瘤蚜繭蜂F1代的存活時間縮短至3.4d，與對照組的4.6d相比顯著降低（t=4.47．P=0.011）。

2.3接觸氯蟲苯甲酰胺后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生菌的alpha多樣性分析

對氯蟲苯甲酰胺暴露1h處理的廣雙瘤蚜繭蜂的16SrDNA進行測序，質(zhì)控和拼接，獲得537099條有效序列，聚類后得到894個ASV；暴露3d處理組獲得603218條有效序列，聚類后得到266個ASV。在97%相似性閾值下，依據(jù)ASV信息，采用多樣性指標Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)對樣品微生物物種豐富度和多樣性進行評估。根據(jù)Ace指數(shù)和Chao指數(shù)分析結(jié)果，氯蟲苯甲酰胺暴露1h處理組中微生物的物種豐富度低于對照組，根據(jù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析結(jié)果，暴露1h處理組的群落多樣性高于對照組；延長接觸暴露時間至3d后，與對照組相比處理組的物種豐富度和群落多樣性增加。廣雙瘤蚜繭蜂經(jīng)66.7mg/L氯蟲苯甲酰胺處理后的ASV覆蓋率達到100%，覆蓋度指數(shù)均為1，表明不存在未被測序檢測到的物種，測序數(shù)據(jù)量合理。

2.4接觸氯蟲苯甲酰胺后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生茵的ASV Venn圖分析

Venn圖可以更加清晰地顯示出氯蟲苯甲酰胺（CAP）處理和對照組中廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共有和特有的微生物種類數(shù)量。對基于屬水平的微生物種類進行分析可知，暴露th時，對照組和處理組分別有232個和156個物種是特有的，有34個物種是共有的；暴露3d時對照組和處理組分別有18個和58個物種是特有的，有4個物種是共有的。由此可知，CAP暴露1h后，與對照組相比，CAP處理組降低了寄生蜂體內(nèi)微生物豐富度和多樣性；而延長暴露時間至3d，寄生蜂體內(nèi)微生物多樣性和豐富度增加。

2.5接觸氯蟲苯甲酰胺后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生茵組成分析

門水平上，氯蟲苯甲酰胺暴露1h和3d，廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)微生物的核心群落組成均為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinomycetota和芽胞桿菌門Bacillota（gt;99%），但相對豐度不同，其中，暴露1h處理，變形菌門（CK：98.42%；CAP：99.28%）、放線菌門（CK：0.29%；CAP：0.20%）、芽胞桿菌門（CK：0.47%; CAP：0.30%）相對豐度沒有明顯變化。氯蟲苯甲酰胺暴露3d，與對照相比，變形菌門相對豐度由35.5%升高至99.68%，放線菌門的相對豐度由64.54%降低至0.04%；芽胞桿菌門的相對豐度變化不大，由0.03%變?yōu)?.22%（圖4）。

在屬水平上，對照和氯蟲苯甲酰胺暴露處理的廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生菌的優(yōu)勢菌屬均為沙雷氏菌屬Serratia。對照組共生菌主要由沙雷氏菌屬（71.64%）、克雷伯氏菌屬（12.45%）、未分類（Unclassified） （8.33%）、志賀氏菌屬ShigeLla（5.86%）組成。而氯蟲苯甲酰胺暴露1h，各屬占比分別為：沙雷氏菌屬71.05%、克雷伯氏菌屬11.60%、志賀氏菌5.36%、紅球菌屬Rhodococcuts0.01%。延長暴露時間至3d后，對照組中共生菌由沙雷氏菌屬（7.84%）、紅球菌屬（64.43%）和葡萄桿菌屬Gluconobacter（27.43%）組成，CAP處理組中，沙雷氏菌屬占比36.82%，葡萄桿菌屬升高至44.5%，克雷伯氏菌屬占比2.46%，志賀氏菌屬占比1.64%，紅球菌屬的含量降低至0（圖4）。

3討論

在田間使用農(nóng)藥的過程中，害蟲和非靶標昆蟲都暴露于殺蟲劑中，殺蟲劑會對它們產(chǎn)生多種效應(yīng)，甚至對其后代造成一定的威脅。因此，研究殺蟲劑對天敵昆蟲的影響能夠更好地了解殺蟲劑施用過程中環(huán)境昆蟲，尤其是天敵昆蟲的風險。農(nóng)藥對寄生性天敵及其代際效應(yīng)的影響研究較少。氯蟲苯甲酰胺因其廣譜、高效低毒和環(huán)境友好等特性被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。本研究評價了氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量對廣雙瘤蚜繭蜂當代及后代的影響，并通過高通量測序分析了其體內(nèi)共生菌種類組成及相對豐度的變化。結(jié)果表明，氯蟲苯甲酰胺暴露對寄生蜂當代及后代的存活時間均表現(xiàn)為負影響，同時接觸氯蟲苯甲酰胺3d后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)微生物物種多樣性發(fā)生明顯變化。

無論是高效低毒還是高毒殺蟲劑使用后都會在田間殘留，對非靶標昆蟲生長發(fā)育以及繁殖產(chǎn)生不同程度的影響。有研究報告了氯蟲苯甲酰胺對非靶標昆蟲的亞致死或致死效應(yīng)。氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量抑制非靶標昆蟲褐飛虱種群增長，抑制梨小食心蟲的種群繁殖，對二化螟取食消化等方面營養(yǎng)指標有負面影響。有研究表明，氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對褐飛虱表現(xiàn)出顯著影響，但田間推薦劑量對其沒有顯著影響。氯蟲苯甲酰胺低致死劑量干擾溝金針蟲幼蟲對食物的消耗與利用能力，具有較高的殺蟲活性。沈櫟陽等認為在稻田施用氯蟲苯甲酰胺不會對寄生類天敵種群產(chǎn)生不利影響。而陳吉祥等認為氯蟲苯甲酰胺對環(huán)境生物存在潛在風險。本研究中廣雙瘤蚜繭蜂接觸到田間推薦劑量的氯蟲苯甲酰胺后F0和F1代的存活時間顯著縮短，而其親代存活率略有增加可能是藥劑暴露后，昆蟲機體為了應(yīng)對藥劑壓力而進行的生理調(diào)整。值得一提的是，雖然氯蟲苯甲酰胺暴露處理組和對照組廣雙瘤蚜繭蜂的存活率沒有顯著差異，但與親代存活率相比F1代的存活率呈現(xiàn)下降趨勢，表明在田間按推薦劑量施用氯蟲苯甲酰胺對天敵昆蟲的后代存在一定的威脅。

結(jié)合16S rDNA分析結(jié)果，氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量暴露th后寄生蜂體內(nèi)微生物群落豐富度低于未接觸藥劑處理；隨著接觸暴露時間的延長，CAP暴露3d后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)微生物群落豐富度高于未接觸CAP處理。在門水平上，廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)微生物以變形菌門為共有優(yōu)勢菌門。研究表明變形菌門是維持昆蟲生長發(fā)育的關(guān)鍵，在昆蟲體內(nèi)作為優(yōu)勢菌門具有高度一致性，中華蜜蜂A-pis cerana cerana Fabricius的優(yōu)勢菌門也為變形菌門，廣雙瘤蚜繭蜂的優(yōu)勢菌門為變形菌門．與之前的研究報告一致。

基于屬水平分析，氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量處理th的寄生蜂共生菌優(yōu)勢菌屬為沙雷氏菌屬，菌屬的相對豐度無明顯變化；隨著寄生蜂齡期的改變和暴露時間的延長，CAP暴露延長至3d時，和對照相比沙雷氏菌屬的相對豐度增加，但紅球菌屬的相對豐度顯著降低。沙雷氏菌屬于變形菌門腸桿菌科，研究表明其能夠殺死發(fā)育著的阿爾蚜繭蜂幼蟲，從而提高宿主對寄生蜂的抵御能力。沙雷氏菌屬普遍具有溶血活性，且沙雷氏菌分泌的次級代謝產(chǎn)物通過改變脂酶、蛋白酶等生物化學(xué)物質(zhì)，實現(xiàn)抗細菌、真菌和瘧原蟲等。研究表明紅球菌屬廣泛存在于昆蟲體內(nèi)，和昆蟲的生長發(fā)育、消化和免疫息息相關(guān)。在本試驗中CAP暴露后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)關(guān)鍵菌屬相對豐度的變化，可能是引起其存活率和存活時間改變的原因。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，當廣雙瘤蚜繭蜂接觸氯蟲苯甲酰胺田推薦劑量（66.7mg/L）暴露后，廣雙瘤蚜繭蜂的親代和子代的生存能力均受到了潛在的負面影響。通過16SrDNA分析結(jié)果表明，氯蟲苯甲酰胺對微生物群落的影響具有時間依賴性，短期暴露可能導(dǎo)致菌屬的相對豐度普遍下降，而長期暴露則可能導(dǎo)致特定菌屬的耐受性增加和敏感菌屬的減少。延長接觸時間會改變寄生蜂體內(nèi)微生物的組成，同時可能會通過改變微生物的組成結(jié)構(gòu)而直接或間接影響廣雙瘤蚜繭蜂的存活率和存活時間。這是首次報道氯蟲苯甲酰胺能夠跨代影響非靶標天敵昆蟲的安全性，表明氯蟲苯甲酰胺暴露可能對寄生性天敵產(chǎn)生意外的風險。因此，我們建議加強對氯蟲苯甲酰胺施用管理，以避免其可能引發(fā)的環(huán)境毒性問題以及對有益天敵的威脅。