摘要：[目的]優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的日本落葉松胚性愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系。[方法]以液體增殖培養(yǎng)7d的日本落葉松胚性愈傷組織為受體材料，利用攜帶β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的pCAMBIA1305.1載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，根據(jù)GUS的表達(dá)量及酶活性，篩選最佳侵染液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間。并利用篩選出的轉(zhuǎn)化體系，分析落葉松scarecrow-like6（LaSCL6）啟動(dòng)子的活性。[結(jié)果]瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后，GUS表達(dá)明顯。當(dāng)侵染液濃度OD600為0.2，侵染5 min，共培養(yǎng)72 h時(shí)，GUS的表達(dá)量最高，△cT值為-2.274 2；當(dāng)侵染液濃度OD600為0.05，侵染5 min，共培養(yǎng)72 h時(shí)，GUS酶活性最高，為25.7286 U·L-1。LaSC/6啟動(dòng)子的活性是CaMV35S啟動(dòng)子的1.55倍。[結(jié)論]綜合考慮GUS的表達(dá)量和酶活性，當(dāng)侵染液濃度OD600為0.05，侵染5 min，共培養(yǎng)24 h時(shí)，GUS的表達(dá)量和酶活性較高，這一條件可以用來進(jìn)行日本落葉松胚性愈傷組織的高效轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：落葉松；瞬時(shí)轉(zhuǎn)化；胚性愈傷組織；GUS；啟動(dòng)子

中圖分類號：S722;S791.223 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）03-0129-07

瞬時(shí)表達(dá)分析是一種快速研究基因功能的方法，T-DNA雖然未被整合到宿主基因組上，但在其進(jìn)入宿主細(xì)胞后，仍可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，在轉(zhuǎn)化后12 h左右即可檢測到目的基因的表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系以其快捷、高效的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于外源基因表達(dá)分析、基因沉默、啟動(dòng)子分析、蛋白互作等許多植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的受體材料主要包括愈傷組織、原生質(zhì)體、葉片等。與其它受體材料相比，愈傷組織具有成本低、轉(zhuǎn)化效率高、能夠大量增殖培養(yǎng)等優(yōu)勢，因此，以愈傷組織為受體材料的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系在植物基因功能研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但是，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化過程中一些參數(shù)和培養(yǎng)條件會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，如農(nóng)桿菌菌液的濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等。因此，轉(zhuǎn)化條件的探索對轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)化效率的提高至關(guān)重要。

日本落葉松（Larix kaempferi （Lamb.） Carr.）具有材質(zhì)優(yōu)良、抗病性強(qiáng)和用途廣等特點(diǎn)，是我國重要的人工造林樹種。隨著日本落葉松基因組的測定，日本落葉松中越來越多重要的基因被鑒定出來，因此，基因功能的解析已成為當(dāng)前日本落葉松研究的主要目標(biāo)。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是研究基因功能的重要手段，其中根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是最常用的轉(zhuǎn)基因方法之一。自從Rossi等于1993年在煙草中首次成功建立以來，該技術(shù)目前已在多種植物中成功應(yīng)用。遺傳轉(zhuǎn)化包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，目前，已經(jīng)建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的日本落葉松胚性愈傷組織穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系，對于其瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的研究仍未見報(bào)道。

本研究以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的日本落葉松胚性愈傷組織穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系為基礎(chǔ)，利用攜帶β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的pCAMBIA1305.1載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，通過分析侵染液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間對GUS表達(dá)量和酶活性的影響，篩選高效的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化條件，為日本落葉松基因及其啟動(dòng)子的功能研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的由日本落葉松未成熟種子誘導(dǎo)的胚性愈傷組織。在固體增殖培養(yǎng)基上每隔15 d繼代一次，在液體增殖培養(yǎng)基上每7d繼代一次。增殖培養(yǎng)在暗環(huán)境（25+2℃）下進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

使用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（ZP309K-2，北京莊盟國際生物基因科技有限公司）進(jìn)行總DNA的提取，具體操作按照說明書進(jìn)行。通過瓊脂糖凝膠電泳確定DNA的質(zhì)量，使用分光光度計(jì)對DNA的濃度進(jìn)行檢測。合格的DNA于-80℃冰箱保存。

1.2.2 落葉松scarecrow-like 6（LaSCL6）啟動(dòng)子克隆及載體構(gòu)建

利用日本落葉松基因組數(shù)據(jù)[16]，選取LaSCL6起始密碼子上游2 500 bp序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。以DNA為模板，利用引物5＇-AAACCCTCGTCATGGATTTG-3’和5’-TGACAGCAAAACCAAAAA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物切膠回收后進(jìn)行TA克隆和測序驗(yàn)證。以測序正確的質(zhì)粒為模板，利用分別帶有HindⅢ和Nco Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物5'-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAACCCTCGTCATGGATTTG-3’和5'-TTACCCTCAGATCTACCATGGTGACAGCAAAACCAAAAA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增（下劃線表示酶切位點(diǎn)序列）。利用HindⅢ和Nco Ⅰ酶分別消化pCAMBIA1305.1載體和PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物切膠回收后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，測序驗(yàn)證后獲得PLaSCL6：：GUS重組質(zhì)粒。

1.2.3 侵染

通過凍融法將攜帶GUS的pCAMBIA1305.1載體（35S：：GUS）和重組質(zhì)粒（PLaSCL6：：GUS）轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。取200”μL菌液，涂于含50 mg·L-1卡那霉素的固體Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)2d。挑取單菌落于含50 mg·L-1卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm搖床上震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。菌液4℃，4 000 rpm，離心10 min后，棄上清，收集菌體。使用含20 mg·L-1乙酰丁香酮的液體增殖培養(yǎng)基重懸菌體，使菌液OD600分別為0.05、0.1和0.2（表1），此時(shí)得到的溶液即為侵染液。

胚性愈傷組織液體增殖培養(yǎng)7d后，使用抽濾脫菌裝置抽干水分，置于侵染液中進(jìn)行侵染，侵染時(shí)間分別為1、5和10 min（表1）。侵染之后使用抽濾脫菌裝置將混合物抽干，之后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有20 mg·L-1乙酰丁香酮的固體增殖培養(yǎng)基BM中，23℃，黑暗條件下分別共培養(yǎng)24、48和72 h（表1），隨后收集材料，-80℃保存。

1.2.4 RNA提取、半定量RT-PCR和定量RT-PCR（qRT-PCR）

以瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織為材料，使用RNA提取試劑盒提取總RNA（ERl01，北京全式金生物技術(shù)），具體操作按照說明書進(jìn)行。使用核酸檢測儀及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA濃度及純度檢測。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（P10720，北京全式金生物技術(shù)）將檢測合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR和qRT-PCR檢測，LaEFIA1為內(nèi)參基因，引物序列為5’-GACTGTACCTGTTGGTCGTG-3‘和5’-CCTCCAGCAGAGCTTCAT-3’。以pCAMBIA1305.1載體中的GUS作為檢測基因，引物序列為5’-CGAAGCGAGCAATGTGATGG-3’和5’-GATCCGCAAGACGCATCAAC-3’。

半定量RT-PCR反應(yīng)體系：1μLcDNA，12.5 μLKOD酶，引物各0.75μL，10μL RNase-freeH2O。反應(yīng)條件：94 CC 2 min; 98℃10 s，55 ℃5s，68℃15 s，32個(gè)循環(huán)；68℃2 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

qRT-PCR反應(yīng)體系：12.5 μL TB GreenPremix Ex TaqTM，2UL cDNA，引物各0.5 μL，9.5UL RNase-free H2O。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5s．60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃10 s；65℃5s；95℃5s。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)，表達(dá)量以ACT值體現(xiàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示。

1.2.5 GUS酶活性檢測

將-80℃保存的實(shí)驗(yàn)樣品置于液氮中研磨成粉末，以1：9的比例置于0.01 mol·L-1 PBS緩沖液中，充分混勻后，4℃離心15 min，5 000 rpm，取上清移入新的管中，放到冰上備用。之后使用分光光度計(jì)檢測上清中總蛋白含量，隨后置于-20℃?zhèn)溆?。使用?葡萄糖苷酸酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒（LB5023A，武漢力博瑞生物科技有限公司）進(jìn)行GUS酶活性檢測，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD450處的值為縱坐標(biāo)，使用Excel繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的OD450處的值計(jì)算樣品相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品總蛋白的濃度。每個(gè)樣品檢測3次，檢測結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示。

1.2.6 順式作用元件分析

使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動(dòng)子CaMV35S和P/aSC/6的順式作用元件進(jìn)行分析。使用TBtools軟件繪制啟動(dòng)子元件圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。柱狀圖使用Origin 2021軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本落葉松胚性愈傷組織中GUS的瞬時(shí)表達(dá)

使用載體35S：：GUS，以O(shè)D600=0.1的侵染液侵染10 min，共培養(yǎng)48 h為條件進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)化的材料中可以檢測到GUS的擴(kuò)增片段，而在未轉(zhuǎn)化的材料中未檢測到（圖1A）。qRT-PCR分析也進(jìn)一步驗(yàn)證了半定量RT-PCR的結(jié)果（圖1B）。這兩個(gè)結(jié)果表明，以O(shè)D 600=0.1的侵染液侵染10 min，共培養(yǎng)48 h為瞬時(shí)轉(zhuǎn)化條件，載體35S：：GUS可以導(dǎo)入日本落葉松胚性愈傷組織的細(xì)胞中，且CaMV35S啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)。

2.2 侵染液濃度、侵染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間對GUS表達(dá)量和酶活性的影響

侵染液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)計(jì)了3個(gè)梯度，使用載體35S：：GUS進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。qRT-PCR結(jié)果顯示，GUS在不同的條件下均能表達(dá)，但表達(dá)量差別明顯（表1）。當(dāng)侵染液OD600=0.2，侵染5 min，共培養(yǎng)72 h時(shí)，GUS的表達(dá)量最高，ACT值為-2.274 2：當(dāng)侵染液OD600=0.05，侵染1 min，共培養(yǎng)24 h時(shí)，GUS的表達(dá)量最低，ACT值為-11.630 0。GUS酶活性在所有材料中均能被檢測到，但在不同的條件下，其大小不同（表1）。當(dāng)侵染液OD600=0.05，侵染5 min，共培養(yǎng)72 h時(shí)，GUS酶活性最高，為25.728 6 U·L_1；當(dāng)侵染液OD600=0.2，侵染5 min，共培養(yǎng)48 h時(shí)，GUS酶活性最低，為12.045 3 U·L-1。GUS表達(dá)量較高的5個(gè)材料是處理4、10、15、24和27，而酶活性較高的5個(gè)材料是處理3、4、5、6和17。這些結(jié)果表明，處理4中，即以侵染液OD600=0.05，侵染5 min，共培養(yǎng)24 h為轉(zhuǎn)化條件時(shí)，GUS的表達(dá)量和酶活性都比較高。

2.3 CaMV35S和PLaSCL6啟動(dòng)子活性分析

分別使用載體35S：：GUS和重組質(zhì)粒PLaSCL6：：GUS，以O(shè)D600=0.05的侵染液侵染5min，共培養(yǎng)24 h為條件進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。半定量RT-PCR結(jié)果表明，兩種轉(zhuǎn)化材料中都可以檢測到GUS的擴(kuò)增片段，但轉(zhuǎn)PLaSCL6：：GUS的材料中電泳條帶相對較亮（圖2A）。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步表明，轉(zhuǎn)PLaSCL6：：GUS的材料中GUS表達(dá)量是轉(zhuǎn)35S：：GUS的1.55倍（P＜0.01）（圖2B）。

2.4 CaMV35S和PLaSCL6啟動(dòng)子元件分析

根據(jù)預(yù)測結(jié)果，P/aSCL6上調(diào)控元件的數(shù)量和種類均要明顯多于CaMV35S。P/aSCL6具有132個(gè)調(diào)控元件，而CaMV35S僅有28個(gè)調(diào)控元件（圖3A）。PLaSCL6上TATA-box有45個(gè)，而CaMV35S上僅有3個(gè)。此外，PLaSCL6中包含19種順式作用元件，而CaMV35S上有11種，它們共有的調(diào)控元件有7種，分別是激素響應(yīng)元件（ABRE、TGA-box、）、光響應(yīng)元件（G-box）、參與MejA反應(yīng)的元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、-30附近的核心啟動(dòng)子元件（TATA-box）和常見的順式作用元件（CAAT-box）（圖3B）。此外，PLaSCL6上還包含多種其它順式作用元件，如激素響應(yīng)元件（GARE-motif、P-box、CGTCA-motif、TGACG-motif）、光響應(yīng)元件（AE-box、Box 4、Box Ⅱ、G-Box、I-box）、厭氧誘導(dǎo)必須的調(diào)控元件ARE、干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS和參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控元件TC-rich-repeats等。

3 討論

植物的遺傳轉(zhuǎn)化受到多種因素的影響，要建立一個(gè)高效的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，需對影響遺傳轉(zhuǎn)化的多種因素進(jìn)行全面的探索與優(yōu)化。彭綠春等認(rèn)為菌液濃度對云南杜鵑（Rhododendron yunnanenseFranch.）愈傷組織中GUS的瞬時(shí)表達(dá)有顯著影響。侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素，因?yàn)榍秩緯r(shí)間過長容易導(dǎo)致外植體死亡，而侵染時(shí)間過短則受體材料上不能夠附著足夠的菌液，共培養(yǎng)時(shí)間的長短又直接影響著目的基因的整合和轉(zhuǎn)化。本研究以日本落葉松胚性愈傷組織為受體材料，探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系中侵染液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響。從GUS的表達(dá)量和酶活性來看，不同組合處理后轉(zhuǎn)化效率差別較大。綜合分析后，發(fā)現(xiàn)以侵染液濃度OD600為0.05，侵染5 min，共培養(yǎng)24 h為轉(zhuǎn)化條件時(shí)，GUS的表達(dá)量和酶活性都比較高。研究結(jié)果也再次表明掌握好侵染液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間有助于提高瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率。另外，上述條件不僅可以用來進(jìn)行日本落葉松胚性愈傷組織的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，也為其它針葉樹瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化提供參考。

啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，它的調(diào)控作用是由多層次、多因素共同作用的結(jié)果。對啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制的研究不僅有利于了解基因調(diào)控模式和信號傳遞途徑，而且對于了解植物的生長發(fā)育機(jī)制和對外界環(huán)境的響應(yīng)具有重要意義。由于對日本落葉松基因的啟動(dòng)子研究不夠深入，導(dǎo)致其在應(yīng)用中具有不確定性。有些外源啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中不一定能夠誘導(dǎo)目的基因高效表達(dá)。例如，外源性啟動(dòng)子hsr203J在柑橘（Citrussinensis Osbeck）中并未被激活。落葉松P LkF3H2啟動(dòng)子的活性在本生煙草（Nicotianabenthamiana Domin）中略弱于CaMV35S啟動(dòng)子，并且隨著PLkF3H2啟動(dòng)子長度的縮短，其活性降低。因此，在未來日本落葉松啟動(dòng)子的克隆及應(yīng)用研究仍然是重中之重。上述轉(zhuǎn)化條件在啟動(dòng)子活性檢測上的成功應(yīng)用證明了該轉(zhuǎn)化體系的高效性和穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)CaMV35S活性低于PLaSCL6，這可能與PLaSCL6是落葉松內(nèi)源啟動(dòng)子有關(guān)，也可能與P/aSCL6較CaMV35S具有更多的順式作用元件有關(guān)（圖3）。這一結(jié)果不僅驗(yàn)證了上述轉(zhuǎn)化體系的有效性，也為日本落葉松遺傳轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)候選啟動(dòng)子。

4 結(jié)論

本研究分析了日本落葉松胚性愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化過程中侵染液濃度、侵染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)OD600=0.2的侵染液侵染5 min，共培養(yǎng)72 h時(shí)，GUS的表達(dá)量最高，ACT值為-2.2742；當(dāng)OD600=0.05的侵染液侵染5 min，共培養(yǎng)72 h時(shí)，GUS酶活性最高，為25.7286 U·L-1。綜合考慮GUS的表達(dá)量和酶活性，當(dāng)OD600=0.05的侵染液侵染5 min，共培養(yǎng)24 h時(shí)轉(zhuǎn)化效率較高，這一條件可以用來進(jìn)行日本落葉松胚性愈傷組織的高效轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果優(yōu)化了日本落葉松瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化體系，不僅為日本落葉松的基因功能研究提供了技術(shù)支持，也為其它針葉樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和完善提供了參考。

（責(zé)任編輯：張研）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“落葉松miR171-LaSC/6調(diào)控體胚發(fā)生的分子機(jī)理”（32271904）。