摘要：利用分子標(biāo)記檢測小麥區(qū)試品系，明確其優(yōu)異等位基因組成，有利于進一步精準(zhǔn)改良利用。分析KASP標(biāo)記檢測中存在的問題，有助于促進分子育種應(yīng)用。以山東省2021—2022 年小麥旱地區(qū)試24 份參試品系為材料，利用32 個抗旱高產(chǎn)相關(guān)基因的KASP 標(biāo)記，分析KASP 標(biāo)記檢測中存在的異常結(jié)果和材料的優(yōu)異等位基因利用情況。結(jié)果表明，未知基因型產(chǎn)生的主要原因是KASP 反應(yīng)失敗或非特異擴增。混合DNA 樣品檢測結(jié)果為雜合的主要原因是單株間基因型不一致，次要原因是錯誤分型。32 個KASP 標(biāo)記中，14 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因檢出率超過83%，表明這些基因在育種中已經(jīng)得到有效利用；17 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因檢出率低于50%，其中，WRKY51-2B、AX-95025477-7B、SnRK2.4A3、TaMoc-2433 和NCED1 5 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因未檢出，表明這些基因在育種中利用較少，可通過分子標(biāo)記輔助選擇開展遺傳改良。24 份材料中，HQ04 攜帶20 個優(yōu)異等位基因，是數(shù)量最多的，可作為基因供體用于育種。利用KASP 標(biāo)記開展輔助選擇定向精準(zhǔn)提高優(yōu)異等位基因在小麥育種中的利用率仍有可為。

關(guān)鍵詞：小麥；抗旱；功能基因；KASP 標(biāo)記；區(qū)試品系

中圖分類號：S512.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1002?2481（2024）04?0009?07

長期以來干旱是導(dǎo)致小麥減產(chǎn)的重要因素之一，制約著小麥產(chǎn)量水平的提高。河北省和山西省是水資源缺乏重災(zāi)區(qū)，河北省先后選育出節(jié)水高產(chǎn)品種石家莊8 號[1]、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種石優(yōu)20[2]等，山西省選育出了晉麥47[3]、晉麥101[4]等節(jié)水小麥品種。實踐證明，通過選育和推廣抗旱節(jié)水小麥新品種是干旱半干旱地區(qū)提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重要途徑。山東是小麥生產(chǎn)大省，據(jù)山東統(tǒng)計年鑒數(shù)據(jù)，近幾年山東小麥播種面積在400 萬hm2 左右，居全國第2 位；其中旱地小麥約占1/3，而產(chǎn)量不足1/4[5]。山東省先后育成了魯麥21[6]、山農(nóng)27[7]等抗旱小麥品種。近年來，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所先后選育了濟麥262[8]、濟麥60[9]、濟麥379[10]等抗旱新品種，為山東旱地小麥生產(chǎn)作出重要貢獻。培育抗旱節(jié)水小麥新品種是抵御干旱、保障旱地小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的根本途徑。傳統(tǒng)抗旱育種以常規(guī)雜交為主，通過水旱交叉選擇實現(xiàn)豐產(chǎn)性和抗旱性兼顧。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代生物育種正在從傳統(tǒng)育種向精準(zhǔn)設(shè)計育種轉(zhuǎn)變，通過分子標(biāo)記輔助選擇可以實現(xiàn)優(yōu)異等位基因的快速精準(zhǔn)選擇。

KASP（Kompetitive allele specific PCR）標(biāo)記是LGC 公司開發(fā)的一種檢測SNP 的技術(shù)方法，被廣泛用于各種作物的分子標(biāo)記檢測。RASHEED等[11]在小麥中開發(fā)和驗證了70 個KASP 標(biāo)記，其中包括2 個抗旱相關(guān)標(biāo)記，是較早報道的小麥抗旱KASP 標(biāo)記。KHALID 等[12]報道了另外3 個與抗旱適應(yīng)性相關(guān)的KASP 標(biāo)記，使抗旱相關(guān)標(biāo)記增加到5 個。UR REHMAN 等[13]進一步開發(fā)了11 個抗旱相關(guān)KASP 標(biāo)記，使可用標(biāo)記的數(shù)量進一步增加。李瑋等[14]新報道了與抗旱、抗寒、根系等相關(guān)的11 個KASP 標(biāo)記，豐富了KASP 標(biāo)記關(guān)聯(lián)的抗旱相關(guān)性狀種類。越來越多小麥抗旱相關(guān)KASP 標(biāo)記的開發(fā)為開展抗旱分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了便利。

小麥旱地區(qū)試的參試品系代表了小麥抗旱育種的水平，新的抗旱品種將從此脫穎而出，然而，目前對抗旱品種（系）攜帶優(yōu)異等位基因分布情況的報道較少。本研究以2021—2022 年山東省小麥旱地區(qū)試的參試品系為材料，選擇與抗旱高產(chǎn)性狀遺傳位點相關(guān)的32 個KASP 標(biāo)記進行檢測，分析參試品系攜帶優(yōu)異等位基因數(shù)量，旨在了解小麥抗旱等相關(guān)優(yōu)異等位基因利用情況，以促進利用KASP標(biāo)記進行抗旱小麥遺傳改良。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的23 份2021—2022 年山東省小麥旱地區(qū)試參試品系（HQ01-HQ23）和對照品種山農(nóng)27（表1），均取自德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗基地。

1.2 DNA 提取

返青期取小麥單株葉片長度2 cm 左右，每個編號隨機選取長勢一致的3 個單株，采用簡化高鹽低pH 值法[15]分別提取DNA，調(diào)整質(zhì)量濃度至100 ng/μL，相同編號的3 個單株DNA 等量混合后進行檢測。

1.3 KASP 標(biāo)記檢測

32 個KASP 標(biāo)記9 個和根系相關(guān)，21 個和抗旱相關(guān)，2 個和抗寒相關(guān)。KASP 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參考RASHEED 等[11]的報道，所用32 個KASP標(biāo)記見表2。

引物序列詳見參考文獻，由北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成（表2）。KASP MasterMix 購自LGC 公司。使用PHERAstar 檢測，檢測結(jié)果導(dǎo)入Kluster Caller 軟件分型。對于檢測結(jié)果中出現(xiàn)的未知和雜合基因型，用3 個單株DNA 重新檢測，以確定雜合基因型產(chǎn)生的原因。

2 結(jié)果與分析

2.1 KASP 標(biāo)記未知和雜合基因型分析

用24 個混合DNA 樣品檢測時，KASP 標(biāo)記分型圖中產(chǎn)生了Hex 基因型（紅色圓點）、Fam 基因型（藍色圓點）、雜合基因型（綠色圓點）、未知基因型（粉色圓點），黑色圓點為無模板對照（圖1）。

圖1-A 顯示的是P5CS1A 基因分型情況，其中，HQ03 在該位點的基因型未知，HQ10、HQ12 和HQ21 為雜合基因型。為了明確這些未知基因型和雜合基因型產(chǎn)生的原因，隨即各用3 個單株進行了驗證，結(jié)果如圖1-a 所示，HQ03 的3 個單株DNA檢測結(jié)果全部為Hex 基因型，說明混樣中未知基因型產(chǎn)生的原因之一是KASP 反應(yīng)失敗；而HQ10 的檢測結(jié)果為1 個Hex 基因型和2 個Fam 基因型，HQ12 的檢測結(jié)果為2 個Hex 基因型和1 個Fam 基因型，HQ21 的檢測結(jié)果為1 個Hex 基因型和2 個Fam 基因型，說明不同純合基因型單株的采樣是造成混樣呈現(xiàn)雜合基因型的主要原因。

共7 個標(biāo)記（8 個數(shù)據(jù)點）的混合DNA 樣本中存在未知基因型，進一步的單株檢測發(fā)現(xiàn)，AX-95025477-7B 標(biāo)記在HQ06 種質(zhì)的3 個單株DNA仍為未知基因型，其余均成功分型為Hex 或Fam 基因型，表明未知基因型產(chǎn)生的主要原因是KASP 反應(yīng)失敗，重新檢測可以成功分型。共18 個標(biāo)記（25 個數(shù)據(jù)點，圖1-B）在混合DNA 樣本中存在雜合基因型，進一步的單株檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17 個數(shù)據(jù)點表現(xiàn)為2 種純合基因型，比如HQ10 的TaSnRK2.3-1B-KASP-4 標(biāo)記3 個單株檢測結(jié)果分別為Fam、Hex、Hex（圖1-b）；1 個數(shù)據(jù)點表現(xiàn)為Hex、Fam 和雜合3 種基因型，剩余7 個數(shù)據(jù)點的單株DNA 檢測結(jié)果一致，為假雜合。以上結(jié)果表明，混合DNA 樣品檢測結(jié)果為雜合的主要原因是單株間基因型不一致，占本研究中全部雜合基因型的72%，次要原因是錯誤分型，占比為28%。

在排除假雜合后共有6 個品系單株檢測的基因型不一致，其中，HQ04、HQ10 和HQ12 分別有4、4、7 個標(biāo)記位點不一致，表明這3 個品系雜合度可能偏高，但不排除取到混雜單株的可能。而HQ16、HQ21 和HQCK 僅有1 個標(biāo)記位點不一致，可能該位點未純合。在后續(xù)分析中雜合基因型用單株檢測占多數(shù)的基因型替代，HQ04 的TaSnRK2.3-1BKASP-4 標(biāo)記單株檢測結(jié)果有Hex、Fam 和雜合3 種基因型，在優(yōu)異等位基因分析時按含有優(yōu)異等位基因處理，HQ06 的AX-95025477-7B 標(biāo)記單株檢測結(jié)果仍為未知基因型，在優(yōu)異等位基因分析時按非優(yōu)異等位基因處理。

2.2 32 個KASP 標(biāo)記的檢測結(jié)果

檢測結(jié)果表明（圖2），14 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因檢出率較高（gt;80%），包括TaSnRK2.8-5AKASP-7、TaPPH-KASP-13、TaDreb_SNP、VSR1-2BMITE、DRO5A、TaSAP-7B-KASP-8、TaLTPs-KASP-11、PYL1B、DRO5B、TaPARG-2A-KASP-9、Wcor142B、TaLTPs-KASP-12、1fehw3 和SnRK2.4B3；標(biāo)記P5CS1A 的優(yōu)異等位基因檢出率接近50%；12 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因檢出率較低（lt;21%），攜帶這些優(yōu)異等位基因的品系可作為供體親本，包括攜帶WRKY51-2A 優(yōu)異等位基因的品系HQ04 和HQ14，攜帶AX109558906-6B 優(yōu)異等位基因的品系HQ04 和HQ06，攜帶TaSnRK2.3-1AKASP-2 優(yōu)異等位基因的品系HQ12 和HQ18，攜帶TaSnRK2.3-1B-KASP-4 優(yōu)異等位基因的品系HQ07、HQ15、HQ17，攜帶SRL14A929和SRL14A96優(yōu)異等位基因的品系HQ05、HQ18、HQ20，攜帶TaS?nRK2.9-5A-KASP-6 和TaSnRK2.9-5A-KASP-5優(yōu)異等位基因的品系HQ05、HQ12、HQ16、HQ22，攜帶OSCA1.4 優(yōu)異等位基因的品系HQ07、HQ15、HQ17，攜帶DTG2BK2 優(yōu)異等位基因的品系HQ12，攜帶TaGW2-6A 優(yōu)異等位基因的品系有5 個，包括HQ02、HQ04、HQ07、HQ17 和HQ19，攜帶COBL5B 優(yōu)異等位基因的品系也有5 個，包括HQ02、HQ04、HQ07、HQ12 和HQ15。5 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因未檢出，包括WRKY51-2B、AX-95025477-7B、SnRK2.4A3、TaMoc-2433、NCED1。整體來看，32 個標(biāo)記對應(yīng)基因位點在區(qū)試材料里優(yōu)異等位基因的利用程度呈兩極分化趨勢，43.75%基因位點的優(yōu)異等位基因利用較多，另外，56.25%基因位點的優(yōu)異等位基因利用較少，特別是優(yōu)異等位基因未檢出的5 個基因位點有待加強利用。

從參試品系分析，24 份材料攜帶優(yōu)異等位基因數(shù)量11～20 個不等，區(qū)試對照品種HQCK 的優(yōu)異等位基因數(shù)量為14 個，全部為高檢出率的優(yōu)異位點。利用優(yōu)異等位基因最多的HQ04 為20 個，除14 個高檢出率的優(yōu)異位點還包括TaGW2-6A、COBL5B、P5CS1A、WRKY51-2A、AX109558906-6B 和TaSnRK2.3-1B-KASP-4。利用優(yōu)異等位基因數(shù)量最少的品系HQ06 為11 個，缺少了高檢出率優(yōu)異位點TaPPH-KASP-13、TaDreb_SNP、DRO5A、TaSAP-7B-KASP-8 和DRO5B，但增加了AX109558906-6B 和P5CS1A。特別注意，攜帶優(yōu)異等位基因多的品系可在育種中多加利用，如HQ07、HQ17可能是良種。

3 結(jié)論與討論

KASP 技術(shù)自開發(fā)以來，因其檢測簡單快速，通量靈活等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于水稻[18]、玉米[19]等多種作物的分子標(biāo)記輔助選擇等研究。RASHEED等[11]較早將KASP 技術(shù)應(yīng)用在小麥中，在其檢測結(jié)果中有32 個標(biāo)記存在未知基因型，7 個標(biāo)記存在雜合基因型。ZHAO 等[20]利用KASP 標(biāo)記分析了1 152 份全球小麥47 個基因的優(yōu)異等位基因利用情況，在其檢測結(jié)果中46 個標(biāo)記有未知基因型，42 個標(biāo)記有雜合基因型存在。ZHANG 等[21]利用44 個基因的KASP 標(biāo)記分析了207 份小麥，結(jié)果顯示，41 個標(biāo)記存在未知基因型，26 個標(biāo)記存在雜合基因型。李瑋等[22]在對區(qū)試品系混合DNA 樣品進行KASP 標(biāo)記檢測時，發(fā)現(xiàn)雜合基因型比例較高，可能與混合取樣有關(guān)。以上結(jié)果表明，在進行KASP 標(biāo)記檢測時未知基因型和雜合基因型普遍存在。當(dāng)未知基因型和雜合基因型個數(shù)較多時就需要加以關(guān)注。本研究利用32 個KASP 標(biāo)記對24 份小麥混合DNA 的分析結(jié)果中，共有7 個標(biāo)記存在未知基因型，用單株DNA 重新檢測后僅剩1 個標(biāo)記存在未知基因型。一般來說，未知基因型產(chǎn)生的原因主要包括引物結(jié)合位點變異，DNA 質(zhì)量較差和KASP 反應(yīng)失敗，故進一步對未知基因型樣品單株DNA 重新檢測后成功分型，說明本研究前一步未知基因型的出現(xiàn)是由于KSAP 反應(yīng)失敗，但是個別樣品重復(fù)檢測仍無法分型，可能和引物結(jié)合位點存在變異有關(guān)。本研究為了分析混合DNA 樣品檢測時25 個數(shù)據(jù)點（18 個標(biāo)記）的雜合基因型產(chǎn)生原因，用單株DNA 進行了驗證，結(jié)果表明，18 個數(shù)據(jù)點是由于單株基因型不一致導(dǎo)致，另外7 個數(shù)據(jù)點是錯誤分型導(dǎo)致的假雜合。單株間基因型不一致的原因可能與品系不純和種子混雜有關(guān)，為了避免混合取樣造成的雜合，可以考慮進行單株取樣并盡量排除可能的雜株。對于非特異擴增導(dǎo)致的錯誤分型，可通過提高引物的特異性和優(yōu)化反應(yīng)條件來改善。

選育小麥抗旱品種是一項長期而艱巨的工作，隨著抗旱相關(guān)功能基因的克隆，利用分子標(biāo)記輔助選擇進行抗旱基因聚合可以有效提高抗旱育種的效率。RUBAB 等[23]通過KASP 功能標(biāo)記檢測和表型性狀鑒定篩選出了抗旱性較好的親本材料，為抗旱育種提供了參考。ELTAHER等[24]分析了TaDreb-B1和1-FEH w3 等位基因在冬小麥和春小麥群體中與抗旱的關(guān)聯(lián)性，認(rèn)為TaDreb-B1 抗旱等位基因與抗旱表型的一致性比1-FEH w3 更好。本研究結(jié)果表明，14 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因在育種中已經(jīng)得到選擇利用，另外17 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因檢出率較低，對這些基因的利用需要加強，特別是WRKY51-2B、AX-95025477-7B、SnRK2.4A3、TaMoc-2433、NCED1 5 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因未檢出，因為標(biāo)記是共顯性，未檢出和引物無關(guān)，表明本研究中的24 份小麥未利用這5 個基因。攜帶WRKY51-2B 優(yōu)異等位基因的品種有晉麥47、晉麥92、晉麥101 等[14]，攜帶AX-95025477-7B 優(yōu)異等位基因的品種有中麥895、輪選987、魯麥15 等[25]，攜帶SnRK2.4A3 優(yōu)異等位基因的品種有濟麥379等[14]，攜帶TaMoc-2433 優(yōu)異等位基因的品種有魯麥1、中國春等[13]，攜帶NCED1 優(yōu)異等位基因的品種有和尚頭、臨旱2 號和德抗961 等[17]，其可作為今后育種利用的目標(biāo)親本加以關(guān)注。在檢測的32 個KASP 標(biāo)記中，區(qū)試對照品種山農(nóng)27 攜帶其中14 個優(yōu)異等位基因，而區(qū)試品系攜帶優(yōu)異等位基因的數(shù)量為11～20 個不等，通過分子標(biāo)記輔助選擇聚合更多的優(yōu)異等位基因來選育抗旱品種仍有可為。HQ04 在檢測品系中攜帶優(yōu)異等位基因最多，可作為親本加以利用。值得注意的是隨著目標(biāo)基因數(shù)量的增多，雜交組合方式將變得復(fù)雜，所需的群體大小也呈指數(shù)增加，需要對基因組合方式進行取舍。目前，抗旱品種選育仍然以傳統(tǒng)表型選擇為主，盡管幾乎沒有通過對抗旱基因選擇育成品種的報道，但從本研究的結(jié)果中可以看出，大部分優(yōu)異位點仍然在高代品系中被利用。如果能將分子標(biāo)記輔助選擇和傳統(tǒng)育種相結(jié)合，有望通過對抗旱基因的定向精準(zhǔn)選擇提升選擇效率。

本研究通過對24份小麥旱地區(qū)試品系進行32個KASP 標(biāo)記檢測，發(fā)現(xiàn)14 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因在24 份參試品系中有20 份檢測結(jié)果為陽性，檢出率超過83%；另外，18 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因檢出率低于50%，其中，WRKY51-2B、AX-95025477-7B、SnRK2.4A3、TaMoc-433 和NCED1 5 個標(biāo)記的優(yōu)異等位基因未檢出，明確了抗旱相關(guān)優(yōu)異等位基因在區(qū)試品系中的利用情況，為利用KASP 標(biāo)記開展定向精準(zhǔn)分子育種提供了參考。

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基金項目：山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目（2021LZGC009，2022LZGCQY002，2021LZGC013）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項目（CXGC2023A01）