摘要：旨在開發(fā)一款綠色防控中藥材種植中易發(fā)的紅葉螨的生物農(nóng)藥，以辣椒提取物為原料，通過對6 種乳化劑、消泡劑、防凍劑等種類的篩選和用量試驗(yàn)以及考察轉(zhuǎn)相剪切轉(zhuǎn)速，確定辣椒提取物納米型水乳劑生物農(nóng)藥配方及制備工藝；同時(shí)以1.8% 阿維菌素為陽性對照評估其抗蟲效果。結(jié)果表明，單一乳化劑均不能形成穩(wěn)定水乳劑，EL-40 和S-20 的乳化效果優(yōu)于其他乳劑，且二者復(fù)配比例為9∶1 時(shí)，乳化效果最佳，無析水、有少量析油；剪切轉(zhuǎn)速考察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速大于8 000 r/min 時(shí)，不再析油；Zeta 電位及納米粒徑分析儀顯示，當(dāng)剪切轉(zhuǎn)速為9 000 r/min時(shí)，水乳劑粒徑跨度值最小，為1.48；0.1% 的消泡劑和2% 的乙二醇可達(dá)到理想的消泡和防凍效果。殺蟲效果顯示，當(dāng)該產(chǎn)品稀釋100 倍（6.3 μg/mL）時(shí)，第4 天累計(jì)趨避殺滅率達(dá)94.9%，顯著高于其他稀釋組和陽性對照，500 倍液與陽性對照效果相當(dāng)。綜上，當(dāng)生物農(nóng)藥的制備工藝為2% 辣椒素稀釋液、8% 冬青油、2% 乙二醇、0.1% 消泡劑、10% 復(fù)配乳化劑（EL-40∶S-20=9∶1）、80% 蒸餾水，剪切轉(zhuǎn)速為9 000 r/min 時(shí)，該產(chǎn)品具有良好的殺滅紅葉螨效果。

關(guān)鍵詞：辣椒；辣椒素；納米型；水乳劑；抗蟲效果

中圖分類號：S482.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1002?2481（2024）04?0142?08

辣椒Capsicum annuum（Linn）為茄科辣椒屬1 年或有限多年生草本植物。辣椒果實(shí)是人們常用的食材之一，因其含有辣椒素而有辣味，能增進(jìn)食欲?，F(xiàn)代藥理研究表明，辣椒素具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌、抗氧化、抗菌[1-4]等功效。FRAGOSO 等[5]研究表明，辣椒水提物對小番茄蛀蟲（Neoleucinodes el?egantalis）具有一定的殺滅活性。ISMAIL 等[6] 報(bào)道，辣椒提取物中小分子化合物可通過激活宿主植物抗螨防御系統(tǒng)來抑制棉葉螨（Tetranychus urti?cae）對植物的傷害，抑制率達(dá)93.36%，其活性與阿維菌素相當(dāng)。這些小分子化合物是辣椒素類物質(zhì)（主要為辣椒堿和二氫辣椒堿）[1，3]。有研究表明，辣椒素通過神經(jīng)毒性致害蟲麻痹、癱瘓，并兼有胃毒性，使害蟲的生理代謝受阻而死亡[7]。其神經(jīng)毒性作用在體外的非洲爪蟾（Xenopus）卵母細(xì)胞、小鼠以及大鼠體內(nèi)模型中得到證實(shí)。ALZAABI 等[8]研究表明，辣椒素通過抑制爪蟾卵母細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元中的α7-煙堿乙酰膽堿受體的表達(dá)，進(jìn)而影響神經(jīng)信號的傳遞。BALLEZA-TAPIA 等[9]使用小鼠模型證明了辣椒素通過TrpV1 受體非依賴性通路損傷Na+/K+-atp 酶，抑制小鼠正常海馬神經(jīng)元的活動(dòng)。大量研究還表明，辣椒素類物質(zhì)不僅對小地老虎、蚜蟲、東方黏蟲、溫室白粉虱以及菜青蟲有防治作用[10-13]，還可用于驅(qū)鼠[14-15]。目前，辣椒提取物研制的農(nóng)藥劑型有乳油、微膠囊懸浮劑和粉劑，但未見其納米型水乳劑的相關(guān)報(bào)道[7]。

紅葉螨（Tetranychus cinnbarinus）除了會(huì)危害農(nóng)作物外[16]，也會(huì)對中藥材如懷地黃造成危害[17]。杜鵑蘭每年8—12 月均有紅葉螨蟲害，9—10 月為蟲害爆發(fā)期，12 月后紅葉螨活躍度下降直至消失。當(dāng)前防治螨蟲的主要手段是使用化學(xué)殺螨劑，但化學(xué)農(nóng)藥的過度使用會(huì)對環(huán)境、藥材等造成不利影響[18]。隨著我國對環(huán)境保護(hù)的高度重視，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域加強(qiáng)對高毒、易殘留農(nóng)藥的管理，低毒、低殘留或無殘留農(nóng)藥是我國新型農(nóng)藥發(fā)展的一個(gè)重要方向[19]。辣椒素具有易溶于有機(jī)溶劑、難容于水的性質(zhì)[7]，可利用相應(yīng)的乳化劑將其制備成O/W 型水乳劑，以增大其在水中的溶解度。水乳劑以水為分散介質(zhì)，可減少有機(jī)溶劑的使用，能顯著降低農(nóng)藥在作物和環(huán)境中的殘留，已被國際公認(rèn)為環(huán)境安全的農(nóng)藥新劑型之一，可替代傳統(tǒng)乳油農(nóng)藥[20]。納米顆粒粒徑為納米級，易被害蟲皮膚和宿主植物吸收，能提高農(nóng)藥的生物利用度，提高殺蟲效果。為此，本研究針對螨蟲蟲害從辣椒中提取出辣椒素類有效殺蟲成分，并采用現(xiàn)代制劑手段研制納米型水乳劑生物農(nóng)藥，以期為杜鵑蘭等中藥材螨蟲蟲害的綠色防控提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

干辣椒樣品購自生活超市，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為茄科辣椒屬植物辣椒Capsicumannuum（Linn）的果實(shí)。杜鵑蘭種植于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥材種植圃。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

冬青油（水楊酸甲酯）購自邦源生物；三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（農(nóng)乳601）、蓖麻油環(huán)氧乙烷加成物（By140）、聚氧乙烯月桂酸酯（2301）、蕁麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、十二烷基苯磺酸鈣（500）、失水山梨醇月桂酸酯（S-20）均購自江蘇省海安石油化工廠；1.8% 阿維菌素乳油購自河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司；有機(jī)硅消泡劑購自東莞市德豐消泡劑有限公司；分析純乙二醇和95% 乙醇購自天津市富寧精細(xì)化工有限公司；分析純無水氯化鈣和無水氯化鎂購自無錫市亞太聯(lián)合化工有限公司。

高剪切乳化機(jī)（FJ500-SH，安徽炎信生物科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）；Zeta 電位及納米粒徑分析儀（DelsaNanoc，美國貝克曼庫爾特公司）；電子分析天平（SQP，瑞士Mettler-Toledo 公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-1AB，天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣椒素稀釋液的制備

將除去蒂和籽的干辣椒于50 ℃下烘干后粉碎，過0.425 mm 篩，收集備用。稱取辣椒粉25.00 g，加入100 mL 95% 乙醇，超聲提取35 min（功率90 W）。重復(fù)提取2 次，合并2 次濾液，減壓濃縮，濾液揮發(fā)至10 mL 左右時(shí)取出濾液，將濃縮液置于120 ℃ 恒溫箱中烘干至恒質(zhì)量。向辣椒提取濃縮物中加入少量冬青油，超聲使其溶解，多次重復(fù)操作，使充分溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用冬青油定容至刻度，搖勻，作為辣椒素稀釋液備用。

1.3.2 乳化劑篩選

選擇農(nóng)乳601、By140、EL-40、500、S-20 和2301 等6 種乳化劑進(jìn)行種類篩選試驗(yàn)。參照張貴森等[21]的方法制備水乳劑，分別精密量取6 種乳化劑各10 mL 至燒杯中，再依次加入2 mL 辣椒素稀釋液和8 mL 冬青油，攪拌均勻作為油相，再緩慢加入80 mL 蒸餾水，采用轉(zhuǎn)相法（剪切速度為5 000 r/min）持續(xù)剪切5 min，即制得該產(chǎn)品水乳劑，每種乳化劑重復(fù)做3 批。分別參照GB/T 19137—2003《農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測定方法》和GB/T 19136—2003《農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測定方法》，計(jì)算水乳劑在低溫（0±2）℃和高溫（54±2）℃貯存下的析水、析油率，以及常溫（25±2）℃ 放置30 d 的析水、析油率，后續(xù)貯存試驗(yàn)設(shè)計(jì)同此。

1.3.3 乳化劑復(fù)配

基于1.3.2 的試驗(yàn)結(jié)果，單一乳化劑或多或少均有水析出，因此，選擇析水量較少的2 款乳化劑S-20 和EL-40 進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)，復(fù)配（EL-40∶S-20）體積比例設(shè)置為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 和1∶9，共9 組，重復(fù)3 次。計(jì)算水乳劑在常溫、低溫和高溫貯存下的析水和析油率。

1.3.4 剪切轉(zhuǎn)速確定

轉(zhuǎn)相法制備水乳劑，考察剪切轉(zhuǎn)速對乳化效果的影響，剪切轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 r/min，以各貯存條件下產(chǎn)品析水、析油情況及其粒徑分布為評價(jià)指標(biāo)。

1.3.5 粒徑測定

采用Zeta 電位及納米粒徑分析儀測定1.3.4 中各個(gè)剪切轉(zhuǎn)速下所制備水乳劑的粒徑，設(shè)定D10，D50 和D90 等3 個(gè)特征指標(biāo)，分別表示乳劑粒徑在累積分布曲線中所占百分比為10%、50% 和90% 時(shí)所對應(yīng)制劑的平均粒徑，計(jì)算δ 值（（D90‐D10）/D50）。

1.3.6 消泡劑用量

向水相中分別添加0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3% 的有機(jī)硅消泡劑，制備該水乳劑，在第0、1、2、3、4、5 min 吸取泡沫，測量體積，考察消泡效果。

1.3.7 乙二醇用量

向水相中分別添加0%、1%、2%、3%、4% 和5% 的乙二醇，制備水乳劑，并放于-18 ℃冰箱冷凍過夜，次日取出放常溫下自然溶解，觀察水乳劑析水、析油情況，測量其體積，計(jì)算析水、析油率。

1.3.8 水乳劑性能指標(biāo)測試

以上述試驗(yàn)確定的配方和工藝制備辣椒素納米型水乳劑，開展該產(chǎn)品性能指標(biāo)測試。根據(jù)GB/T 1603—2001《農(nóng)藥乳液穩(wěn)定性測定方法》，考察該產(chǎn)品在標(biāo)準(zhǔn)硬水中的穩(wěn)定性和分散性。按照GB/T 19136—2021《農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測定方法》和GB/T 19137—2003《農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測定方法》對產(chǎn)品的熱貯、冷貯穩(wěn)定性進(jìn)行測定，并計(jì)算其析出率。

1.3.9 水乳劑殺蟲濃度考察

按照篩選出的配方和工藝配制100 mL 水乳劑（辣椒素稀釋液占比為2%），取適量水乳劑，分別稀釋至100、250、500、1 000 倍液備用。按照1.8% 阿維菌素乳油的說明書將其稀釋成750 倍液，作為陽性對照組。通過5 點(diǎn)取樣法隨機(jī)選取10 株受害的杜鵑蘭植株（每個(gè)點(diǎn)取2 株），每組試驗(yàn)區(qū)間隔2 m，統(tǒng)計(jì)每組的蟲口數(shù)量，作為本組的本底蟲口數(shù)。于2022年9月22日，分別將辣椒素水乳劑100（6.3 μg/mL）、250（2.52 μg/mL）、500（1.26 μg/mL）、1 000（0.63 μg/mL）倍稀釋液和阿維菌素乳油750 倍稀釋液均勻噴灑于受害植株葉片的背面和正面，每隔1 d 統(tǒng)計(jì)每組杜鵑蘭葉上紅葉螨存活的蟲口數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計(jì)8 d，計(jì)算各組的趨避殺蟲率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 整理后，采用SPSS26.0 和GraphPad Prism 9.0 軟件對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及作圖。

析水率=析水體積/水相總體積×100% （1）

析油率=析油體積/油相總體積×100% （2）

趨避滅殺率=（本底蟲口數(shù)-存活蟲口數(shù)）/本底蟲口數(shù)×100% （3）

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒素稀釋液的制備及乳化劑種類篩選

3 次辣椒素提取液濃縮恒質(zhì)量后平均質(zhì)量為1.576 7 g，RSD 值為6.01%，小于10%，說明提取方法重現(xiàn)性好，可行。冬青油復(fù)溶至50 mL 的辣椒素稀釋液質(zhì)量濃度為31.5 mg/mL。

從表1 可以看出，601 組出現(xiàn)油水分層現(xiàn)象，說明該乳化劑10% 的用量未能乳化辣椒素稀釋液，其他組在10% 的用量下，存在一定程度的析水、析油問題。如By140、500 和2301 等3 種乳化劑在熱貯和冷貯均有析水、析油的情況，平均最低析油率為2.23%，最高達(dá)8.83%；比較發(fā)現(xiàn)，EL-40 和S-20 的乳化效果較好，在冷貯條件下均無析水、析油情況，常溫條件下EL-40 無析水、析油現(xiàn)象，S-20有少量析水、析油，最高析油率為1.50%，熱貯條件下均存在析水、析油現(xiàn)象，最高析油率為2.17%。這表明在不增加乳劑用量的情況下，單用一種乳化劑均不能制備合格的水乳劑，可考慮將EL-40與S-20 進(jìn)行復(fù)配，改善乳化效果。

2.2 乳化劑復(fù)配比例篩選

從表1 和2 可以看出，EL-40 與S-20 復(fù)配與單用相比，對冷貯無影響，復(fù)配比例大于6∶4 時(shí)，能改善單用S-20 的析水問題，隨著EL-40 所占比例增加，析水量在冷貯、常溫、熱貯時(shí)逐漸減少，故選擇乳化劑比例為EL-40∶S-20＝9∶1。

2.3 剪切轉(zhuǎn)速對乳化效果的影響

為解決復(fù)配熱貯析油的問題，通過增加剪切轉(zhuǎn)速，獲得適宜乳液顆粒粒徑，提高乳劑的穩(wěn)定性。由表3 可知，隨著剪切轉(zhuǎn)速的增加，熱貯析油量逐漸減少。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到8 000 r/min 時(shí)，水乳劑在冷貯、常溫貯存和熱貯時(shí)均無油析出。由表4 可知，相較于8 000 r/min，轉(zhuǎn)速為9 000 r/min 時(shí)水乳劑的D50 和D90 粒徑小，δ 值小，粒徑跨度?。▓D1），水乳液穩(wěn)定性增強(qiáng)。結(jié)合析油率、粒徑和δ 值結(jié)果，水乳劑的剪切轉(zhuǎn)速確定為9 000 r/min。

2.4 消泡劑用量考察

從圖2 可以看出，在0.1%、0.2%、0.3% 的消泡劑添加量的情況下消泡速率相差不大，在0、0.05%的消泡劑添加量下消泡速率較低，故選擇0.1% 的消泡劑添加量。

2.5 乙二醇防凍效果考察

本研究結(jié)果表明，水乳劑在-18 ℃條件下冷凍并恢復(fù)到室溫后，不添加乙二醇和添加量為1%時(shí)，凍融析油量分別為4.00% 和1.11%；添加2%、3%、4%、5% 乙二醇后均無水、無油相析出，故選擇添加2% 的乙二醇。

2.6 水乳劑性能指標(biāo)測定結(jié)果

乳液滴入硬水中呈云霧狀，有顆粒下沉，但能基本分散，其在200 倍硬水中靜置1 h 后未明顯出現(xiàn)浮油、沉淀和分層的現(xiàn)象，熱貯和冷貯離心后均有極少量的析出物，析出率分別為0.62% 和0.24%，輕輕搖晃后能混合均勻（圖3）。綜上說明，該水乳劑在硬水中的穩(wěn)定性、分散性以及存貯穩(wěn)定性均表現(xiàn)良好。

2.7 產(chǎn)品殺蟲效果評價(jià)

辣椒素乳劑對紅葉螨的殺滅效果如圖4 所示。

由圖4 可知，施藥后前4 天紅葉螨蟲口數(shù)量持續(xù)減少，在第4 天趨避滅殺率達(dá)到了第1 次高峰，辣椒素水乳劑稀釋100（6.3 μg/mL）、250（2.52 μg/mL）、500（1.26 μg/mL）、1 000（0.63 μg/mL）倍和阿維菌素乳油稀釋750 倍后的驅(qū)避滅殺率分別為94.9%、78.4%、78.45、75.8%、80.4%，該產(chǎn)品稀釋100 倍時(shí)的趨避滅殺率高于阿維菌素。第5 天，各濃度下趨避滅殺率均下降約20%，說明有蟲卵大量孵化，也間接說明該產(chǎn)品對紅葉螨蟲卵無滅殺效果。此后，趨避滅殺率又快速升高，說明藥效還在持續(xù)發(fā)揮作用。第7 天，該產(chǎn)品的100、250、500 倍稀釋液和阿維菌素的趨避滅殺率達(dá)到了第2 次高峰，趨避滅殺率分別為95.0%、94.6%、92.8%、93.2%。第8 天趨避滅殺率趨于達(dá)到平衡狀態(tài)，且均達(dá)到90% 以上。由于紅葉螨蟲卵時(shí)有孵化，趨避殺滅率未達(dá)100%，需要在第10 天左右第2 次給藥。

3 結(jié)論與討論

單一乳化劑在轉(zhuǎn)相過程中所形成的界面膜往往不夠穩(wěn)定。本試驗(yàn)得出，使用單一乳化劑或多或少存在析水、析油的問題，可利用不同乳化劑的理化特性產(chǎn)生乳化協(xié)同效應(yīng)，提高界面膜的機(jī)械強(qiáng)度，抵抗液滴聚集變大，以提高乳劑的各項(xiàng)性能和制劑的穩(wěn)定性[22]。本研究表明，當(dāng)使用乳化劑EL-40 與S-20 復(fù)配時(shí)，可很大程度上改善析水、析油問題，復(fù)配比例為（9∶1）時(shí)僅可見少量析油現(xiàn)象。

隨著乳化機(jī)剪切轉(zhuǎn)速的增大，其乳劑穩(wěn)定性先增大后逐漸趨于平穩(wěn)[23]。乳液平均粒徑及其粒徑跨度（δ）是表征乳液穩(wěn)定性的重要物理指標(biāo)[24-25]，其平均粒徑越小，沉降速率越慢，分布越集中，乳液越穩(wěn)定；δ 值越小，表明粒徑分布越窄，分散性能越好，所制備的乳劑穩(wěn)定性越好，則體系越穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速在8 000 r/min 后穩(wěn)定性趨于平穩(wěn)，水乳劑熱貯不再析油，且9 000 r/min 的δ 值更小，在該剪切轉(zhuǎn)速下的水乳劑更穩(wěn)定，這與張永康等[26]的研究結(jié)果一致。

乳劑附加防凍劑可使水乳劑在低溫時(shí)保持良好的流動(dòng)性和穩(wěn)定性[24]，有機(jī)硅類消泡劑能降低液體表面張力，增加氣泡合并、破裂和釋放到空氣中的速度[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1% 消泡劑和2% 乙二醇能達(dá)到最佳效果，這與王秦等[28]、苑璐等[29]的研究結(jié)果一致。

有研究報(bào)道，當(dāng)辣椒素質(zhì)量濃度大于8.0 mg/mL時(shí)，對害蟲赤擬谷盜和谷蠹均表現(xiàn)出較好的驅(qū)避殺滅效果，而在糙米中質(zhì)量濃度為1.0 mg/g 時(shí)，對上述2 種害蟲則表現(xiàn)出明顯的拒食作用[30]。據(jù)報(bào)道，LC30 亞致死濃度（1 400 mg/L）的辣椒素提取物能顯著抑制朱砂葉螨卵的孵化，且少數(shù)孵化出的幼螨也不能正常發(fā)育到成螨[31]。本試驗(yàn)通過該產(chǎn)品4 個(gè)稀釋度試樣和阿維菌素陽性對照試樣對紅葉螨驅(qū)避滅殺效果的比較，發(fā)現(xiàn)第4 天時(shí)，100 倍的水乳劑稀釋液殺蟲效果優(yōu)于阿維菌素陽性組，第8 天該試驗(yàn)組與阿維菌素陽性組殺蟲效果相當(dāng)。另外，研究表明該產(chǎn)品對紅葉螨蟲卵無明顯殺滅活性，后續(xù)擬采取純化辣椒提取物及優(yōu)化配方等策略，改善該產(chǎn)品對蟲卵膜的穿透能力，以達(dá)到殺滅蟲卵的作用。

本研究通過對辣椒素水乳劑制備工藝的研究，獲得了較適宜的配方及制備工藝，即2% 辣椒素稀釋液（31.5 mg/mL）、8% 冬青油、2% 乙二醇、0.1%消泡劑、10% 復(fù)配乳化劑（EL-40∶S-20=9∶1）、80% 蒸餾水，剪切轉(zhuǎn)速為9 000 r/min。相較阿維菌素抗蟲效果，該產(chǎn)品展現(xiàn)出較好的殺滅紅葉螨蟲體的作用，具有極高的開發(fā)潛力。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82260741） ；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐［2021］一般251，黔科合基礎(chǔ)-ZK［2022］一般478）；2021年國家自然科學(xué)基金后補(bǔ)助資金科研創(chuàng)新探索專項(xiàng)（2018YFC170610519）