摘要：基于多糖及熵權-逼近理想解排序法（TOPSIS）建立靈芝藥材綜合定量評價模型，為靈芝藥材質(zhì)量評價及優(yōu)選最佳批次提供參考。首先測定同產(chǎn)地多批次靈芝藥材粗多糖得率、糖組成、總糖含量、蛋白含量和糖醛酸含量，其次將數(shù)據(jù)進行無量綱化，最后采用熵權-TOPSIS法綜合評價不同批次靈芝粗多糖得率質(zhì)量并建立優(yōu)選標準。根據(jù)各批次靈芝粗多糖得率、成分含量檢測及聚類熱圖分析得出不同批次間靈芝藥材粗多糖得率、總糖、糖醛酸含量差異較大，糖組成、蛋白含量差異相對較小，靈芝藥材粗多糖得率及內(nèi)在指標與基源無關聯(lián)。熵權法賦權分析計算粗多糖得率權重系數(shù)最大為23.68%，其次為總糖21.35%及糖醛酸含量13.24%。TOPSIS排序結果及分組顯示，栽培靈芝子實體、赤靈芝多糖綜合評分較優(yōu)。綜上，同產(chǎn)地不同批次間靈芝藥材質(zhì)量差異較大，基于多指標綜合評價的熵權-TOPSIS法可實現(xiàn)對靈芝多糖提取物藥材來源快速、高效且準確的優(yōu)選，在生產(chǎn)和質(zhì)量全面評價中有廣泛的應用前景，也可為其他中藥材或飲片質(zhì)量評價提供參考。

關鍵詞：靈芝；熵權-逼近理想解排序法；聚類分析；質(zhì)量評價；粗多糖得率；糖組成；糖醛酸

中圖分類號：R282文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2024）06-0031-11

靈芝，別名“靈芝草”“菌靈芝”“木靈芝”等，是多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst．或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實體［1］。靈芝始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為名藥之首。其味甘、性平，有補氣安神、止咳平喘之功，臨床用于眩暈不眠、心悸氣短、虛勞咳喘等。物質(zhì)組成分析顯示靈芝主要含有靈芝三萜、靈芝多糖、甾體、蛋白質(zhì)、核苷、氨基酸、維生素及微量元素等［2］，現(xiàn)代藥理學研究顯示其提取物有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、強心降血壓、抗血小板聚集及抗血栓、鎮(zhèn)咳祛痰、抗組胺、抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗衰老、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用，毒理學研究顯示其安全性良好，對生長發(fā)育、肝功能、心電圖等毒性指標均無影響［3-4］。靈芝由于其豐富的物質(zhì)基礎，良好的藥理活性，豐富的人用經(jīng)驗及優(yōu)越的安全性，廣泛運用于中藥復方制劑，且納入“藥食同源目錄”。然而由于國內(nèi)靈芝產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，導致靈芝品種多樣性、形態(tài)質(zhì)地不均一，活性成分含量存在差異，且有效成分的控制方法也呈現(xiàn)多樣化［5-6］。種質(zhì)資源多樣性、繁育品種多樣及良好農(nóng)業(yè)示范（good agricultural practice，GAP）種植水平不一等因素共同導致靈芝藥材質(zhì)量不統(tǒng)一［7］。

逼近理想解排序法（technique for order preference by similarity to an ideal solution，TOPSIS）為一種基于實際數(shù)據(jù)的決策方法，可減少主觀因素影響，評價更為客觀、全面，現(xiàn)已被廣泛應用于中藥質(zhì)量評價［8］。已有學者就靈芝水分、灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、指紋圖譜、靈芝多糖、三萜、甾醇、重金屬等方面對靈芝藥材進行質(zhì)量評價［6-7，9］，而未就粗多糖得率及內(nèi)在質(zhì)量進行綜合評價。靈芝多糖作為靈芝主要活性物質(zhì)基礎，目前廣泛用于保健食品及藥物制劑開發(fā)。靈芝多糖的需求量日益增加，而目前靈芝多糖提取物缺乏統(tǒng)一質(zhì)量標準，因而提高靈芝粗多糖提取率及確保質(zhì)量為亟需解決的問題。本研究基于靈芝粗多糖得率、糖組成、總糖含量、蛋白含量等指標［10-11］，采用熵權-TOPSIS對靈芝藥材進行綜合評價，以期滿足靈芝藥材快速、高效且準確評價、篩選、質(zhì)量控制的需求。

1材料和儀器設備

1260型高效液相色譜儀、7890B型氣相色譜儀、7693型三重四級桿質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；DHG-9023A型恒溫鼓風烘箱，上海一恒科學儀器有限公司；BOX998型酶標儀，美國伯騰儀器公司；U3900型紫外分光光度計，日本日立公司；DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換樹脂、Superdex系列分子篩凝膠柱，通用電氣GE Healthcare；X1型高速離心機，賽默飛世爾科技等。

由于本研究側重于如何從不同批次篩選優(yōu)質(zhì)靈芝多糖來源，為減少地域差異，靈芝藥材均購自浙江龍泉靈芝基地，其中紫靈芝2批次、赤靈芝4批次、栽培品子實體7批次，共計13批次，經(jīng)上海醫(yī)藥集團中藥研究所教授級研發(fā)工程師葉冠鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst．或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實體；單糖標準品（D-葡萄糖（批號110833-201908）、D-甘露糖（批號140651-201805）、D-半乳糖（批號100226-201807））均購自于中國食品藥品檢定研究院；三氟乙酸（TFA，批號F20110125）購自SIGMA公司；濃硫酸（H2SO4，批號20190514）、苯酚（C6H5OH，批號20170628）、氯仿（CHCl3，批號20141119）、冰醋酸（HOAc，批號20130314）、硼氫化鈉（NaBH4，批號20140325）、乙酸酐（Ac2O，批號F20100511）、丙酮（CH3COCH3，批號20180212）等均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2方法

2.1靈芝性狀鑒別

靈芝樣品每組取適量，基于外觀形狀分析其是否符合藥典描述及用于對比研究。

2.2多糖分析

2.2.1多糖提取

靈芝樣品（粉碎過5號篩，80目），平行3份各取50 g，加樣品8倍質(zhì)量的無水乙醇，浸泡1 h，回流提取2 h，回流完成后，靜置到室溫，離心10 min（10 000 r/min），藥渣置于室溫通風處晾干。晾干后加藥渣量12倍質(zhì)量的水，微沸提取2 h，提取完成后，靜置1 h后過濾，收集濾液。藥渣再次加水重復上述步驟，合并水提液，60 ℃減壓濃縮至相對密度為1.0～1.1，加入體積分數(shù)95%乙醇，邊加邊攪拌，將乙醇體積分數(shù)調(diào)至80%，4 ℃下放置12 h以上，過濾，得到的沉淀用適量蒸餾水復溶，透析紙透析（截留分子量約10 kDa），過夜，袋內(nèi)截留液濃縮至適量，冷凍干燥，得到靈芝粗多糖，參考NYT 1676—2008標準［12］測定粗多糖含量（本文討論含量均為質(zhì)量分數(shù)），計算得率。

2.2.2總糖含量測定

（1）溶液配制

6%苯酚溶液的配制：準確稱取30 g的苯酚，加蒸餾水溶解并定容至500 mL即得；2 mol/L TFA溶液配制：精密稱取TFA 22.8 g，加蒸餾水定容至100 mL即得；葡萄糖標準溶液配制：精密稱取烘干至恒重無水D-葡萄糖10 mg，加水定容至100 mL 容量瓶即得；樣品溶液配制：準確稱取粗多糖樣品10 mg，置10 mL EP管中，加1 mL 2 mol/L TFA溶液溶解，渦旋使其混合均勻即得。

（2）標準曲線繪制

分別移取葡萄糖標準溶液0.0、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6、2.0 mL標準溶液于20 mL 比色管中，分別用純化水稀釋至2.0 mL，混勻；各管依次加入 1.0 mL 6%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，渦旋充分混合，避光放置30 min；于490 nm波長處用分光光度計測定各標準溶液的吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標，吸光度值OD值（Y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。采用如下線性擬合獲得回歸方程：

Y＝7.382 2 X－0.021 3，r＝0.995 0，線性范圍0～0.2 mg。

（3）測定方法

將配制好3組平行樣品溶液，放入50 ℃水浴加熱溶解1 h后取出；加入4 mL的蒸餾水稀釋，混合均勻；取1 mL混合均勻后的上清液于試管中，加入9 mL的蒸餾水稀釋，渦旋混勻；取上述溶液2 mL，各管依次加入 1.0 mL 6%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，混勻，避光放置30 min后測定490 nm吸光度；根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品中的總糖含量［13］。

2.2.3糖組成

（1）樣品制備

稱取粗多糖樣品2 mg，置5 mL安瓿瓶中，加3 mL 2 mol/L TFA溶液，充分混懸溶解，封口，120 ℃水解2 h，取出，放冷至室溫。取100 μL水解后樣品于試管中，加入100 μL 2 mol/L NaOH中和后加入1 mL 0.5 mol/L NaBH4的DMSO溶液，混勻，于40 ℃中水浴還原反應90 min。反應后逐滴加入100 μL冰醋酸，混勻，然后加入200 μL 1-甲基咪唑和1 mL乙酸酐，混勻，于40 ℃水浴乙?；?0 min，反應結束后加入2 mL 水溶液，搖勻，室溫放置30 min，加氯仿萃取乙酰化產(chǎn)物，氯仿層用水洗3次，用無水硫酸鈉干燥，備用。

（2）色譜條件

色譜柱：HP-5ms，60 m×0.25 mm×0.25 μm（Agilent）；程序升溫：起始溫度120 ℃，3 ℃/min升溫至190 ℃，2 ℃/min升溫至250 ℃，保溫5 min；進樣體積：1 μL；進樣口溫度：250 ℃；載氣：He；載氣流速：1.0 mL/min；傳輸線溫度：250 ℃。EI離子源，漂移管和離子源溫度分別為250和280 ℃，質(zhì)量掃描范圍為50～350 u。

（3）測定方法

取制備好的樣品溶液，用GC-MS檢測，同時取標準單糖衍生化產(chǎn)物在相同條件下檢測，對比樣品與標準品保留時間和質(zhì)譜圖，確定樣品糖組成，并用面積歸一化法確定各組分相對含量［11，14］。公式如下：

葡萄糖含量=葡萄糖質(zhì)量/（葡萄糖質(zhì)量+甘露糖質(zhì)量+半乳糖質(zhì)量）×100%。

2.2.4糖醛酸含量測定

（1）溶液配制

0.5%氫氧化鈉：稱取0.5 g氫氧化鈉至100 mL容量瓶中，分次加水定容至刻度線，即得；0.15%間羥基聯(lián)苯溶液：稱取37.5 mg間羥基聯(lián)苯至25 mL容量瓶中，分次加入0.5%氫氧化鈉定容至刻度線，即得;0.012 5 mol/L NaBH4濃硫酸溶液：稱取0.478 g NaBH4置燒杯，加濃硫酸50 mL溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加濃硫酸定容至刻度線，即得；半乳糖醛酸標準溶液：稱取10 mg半乳糖醛酸鈉至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度線，即得；樣品溶液配制：稱取粗多糖樣品10 mg，置50 mL EP管中，加20 mL水溶解，即得。

（2）標準曲線

分別移取半乳糖醛酸標準溶液0、50、100、150、200、250 μL至試管中，加蒸餾水定容至250 μL；冰浴冷卻8 min，并在冰浴條件下加入NaBH4硫酸溶液1.5 mL，搖勻；沸水浴加熱5 min，取出，冰水浴冷卻至室溫；加入0.15%間羥基聯(lián)苯溶液25 μL，混勻，靜置15 min至室溫后于520 nm處測吸光度OD值；以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，吸光度值OD值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。采用線性擬合獲得如下回歸方程：

Y=0.004 1 X +0.048 1，r＝0.996 3，線性范圍0～0.025 mg。

（3）測定方法

取多糖溶液250 μL于試管中，平行4份；冰浴冷卻下分別加入1.5 mL NaBH4硫酸溶液，充分混勻；沸水浴加熱5 min，取出，冰水浴冷卻至室溫；其中3份加25 μL 0.15%間羥基聯(lián)苯溶液，1份加25 μL的0.5%氫氧化鈉溶液，混勻，靜置15 min至室溫后測定520 nm處吸光度；根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品中的糖醛酸含量［15］。

2.2.5蛋白含量測定

（1）溶液配制：取BCA蛋白定量分析試劑A 5 mL與BCA蛋白定量分析試劑B 100 μL混勻，配制為工作液。

（2）標準品配制：吸取牛血清白蛋白（BSA）標準品（2 mg/mL）20 μL 加入蒸餾水60 μL得0.5 mg/mL蛋白標準液。

（3）樣品溶液配制：準確稱取多糖樣品10 mg，置50 mL EP管中，加蒸餾水20 mL溶解，渦旋混勻，每組平行3份。

（4）標準曲線及測定方法：將蛋白標準液按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入96孔板中，加蒸餾水補足至20 μL 制作標曲；加入待測樣品20 μL 于96孔板中；各孔加入200 μL 工作液，振蕩30 s，蓋住孔板，37 ℃下反應30 min，酶標儀562 nm波長下測定吸光度，以蛋白含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線；計算得標準曲線回歸方程Y=0.013 9 X+0.074 7，r=0.999 3，線性范圍0～0.01 mg，并根據(jù)標準曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)含量［16］。

3綜合評價方法

3.1指標

多糖指標評價體系分別為粗多糖得率、葡萄糖含量、甘露糖含量、半乳糖含量、總糖含量、糖醛酸含量、蛋白質(zhì)含量，共計7個。其中粗多糖得率、葡萄糖含量、總糖含量為高優(yōu)指標，粗多糖的甘露糖含量、半乳糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量為低優(yōu)指標［17］。數(shù)據(jù)歸一化、熵權法及TOPSIS計算均采用WPS Excel 2019計算完成。

3.2構建決策矩陣X研究方法

設共有m個批次藥材，有n個質(zhì)控指標，確定每個批次藥材的各指標的具體定量值，形成原始數(shù)據(jù)矩陣：

其中，X為原始數(shù)據(jù)矩陣;xmn為第m批靈芝藥材的第n個質(zhì)控指標值。

3.3構建數(shù)據(jù)歸一化矩陣Y

數(shù)據(jù)的標準化（normalization）是將數(shù)據(jù)按比例縮放，使之落入一個小的特定區(qū)間。去除數(shù)據(jù)的單位限制，將其轉(zhuǎn)化為無量綱的純數(shù)值，便于不同單位或量級的指標能夠進行比較和加權，而最典型手段即為歸一化處理［18］。本實驗采用min-max法對原始數(shù)據(jù)進行線性變換，使之落入［0，1］區(qū)間，消除不同決策變量數(shù)量級和量綱的影響。

對于高優(yōu)型指標歸一化公式為：

對于低優(yōu)型指標歸一化公式為：

歸一化后構建矩陣Y：

其中，Y為歸一化數(shù)據(jù)矩陣；ymn為歸一化處理后的第m批靈芝藥材的第n個質(zhì)控指標值。

3.4指標權重計算

采用熵權法確定各質(zhì)控指標權重。熵是對不確定性的度量，某個指標的熵越小，就表明該指標的變異程度越大，提供的信息量也就越大，信息效用值越大，則其權重也就越大；反之越小。

首先計算各質(zhì)控指標下各藥材占比pij：

其中，yij為歸一化初始矩陣的第i批靈芝藥材的第j個質(zhì)控指標值；m為藥材批次集合中的藥材批次總數(shù)。

其次計算第j個質(zhì)控指標的熵值ej：

最后計算第j個質(zhì)控指標的權重wj：

3.5構建歸一化加權矩陣Z

對歸一化初始矩陣Y中每一元素分別進行加權處理，得到歸一化加權矩陣Z：

其中Z為歸一化加權矩陣；zmn為歸一化處理后的第m個靈芝藥材批次的第n個質(zhì)控指標值。

3.6優(yōu)劣性排序

計算不同批次靈芝藥材多糖樣品到正向理想解和負向理想解的距離（分別記為Di+和Di-），最終進行相對接近度（Ci）分析，計算公式如下所示。Ci越接近1，表示樣品的綜合評價越好。

4結果

4.1性狀

各批次靈芝藥材種源信息見表1，樣品隨機挑選拍照，見圖1， 13種靈芝藥材樣品性狀均符合藥典標準描述，且抽檢樣品均執(zhí)行《中國藥典》2020版“靈芝”項下標準［1］。

4.2粗多糖得率及內(nèi)在指標

靈芝藥材粗多糖得率及內(nèi)在指標檢測結果（質(zhì)量分數(shù)）見表2，每批次重復3次取均值。

4.3熵權-TOPSIS方法評價

4.3.1構建決策矩陣

設共有m個批次藥材，有n個質(zhì)控指標，確定每個批次藥材的各指標的具體定量值，形成原始數(shù)據(jù)矩陣X（質(zhì)量分數(shù)），原始數(shù)據(jù)整理得表3所示。

4.3.2數(shù)據(jù)歸一化

采用min-max法對按公式（2）～（3）計算得歸一化矩陣Y，見式（4）。歸一化處理后的靈芝粗多糖質(zhì)控指標數(shù)據(jù)導入Origin2018中繪制熱圖見圖2所示。不同批次間靈芝藥材粗多糖得率、總糖、糖醛酸含量差異較大，糖組成、蛋白含量差異相對較小，靈芝藥材粗多糖得率及內(nèi)在質(zhì)量與種質(zhì)資源無關。

4.3.3熵權法計算權重

基于熵權法按公式（5）～（7）計算各質(zhì)控指標權重系數(shù)如表4所示。

4.3.4歸一化后加權矩陣Z

對歸一化初始矩陣Y中每一元素分別進行加權處理，得到歸一化加權矩陣。加權歸一化后的靈芝粗多糖質(zhì)控指標數(shù)據(jù)見表5。

4.3.5各批次靈芝藥材品質(zhì)指標綜合考察結果

采用TOPSIS法按公式（9）～（11）計算不同批次靈芝藥材的綜合評分并按照相對接近度大小進行優(yōu)劣性排序，結果見表6。整體上栽培靈芝子實體多糖綜合評分排名靠前，其次為赤靈芝。

5討論

由于國內(nèi)的靈芝多糖市場產(chǎn)品沒有統(tǒng)一的質(zhì)量控制標準以及靈芝提取物質(zhì)量因產(chǎn)地、菌種、栽培條件、加工工序不一，造成產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，再加上檢測方法的多樣性，導致結果存在一定差異，因此基于多種活性成分、多種分析方法綜合評價靈芝藥材并優(yōu)選其多糖來源批次顯得尤為重要。

本研究就13批次靈芝藥材樣品多糖部位進行粗多糖得率及內(nèi)在質(zhì)量分析，結果顯示，靈芝多糖質(zhì)量與靈芝藥材基源無明顯關聯(lián)性。不同批次間靈芝粗多糖的得率差異較大，最低和最高之間相差近4倍。糖組成分析顯示，多糖糖組成分析顯示葡萄糖含量占比最高，甘露糖含量占比最低，兩者在總多糖中含量穩(wěn)定。半乳糖含量與甘露糖相近，但波動范圍較大。聚類及相關性分析顯示，多批次中，葡萄糖和半乳糖含量極強相關（rgt;0.8），甘露糖和蛋白含量、葡萄糖含量強相關（0.6≤rlt;0.8），聚類分析顯示上述指標聚為一組。葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蛋白含量在各批次間相對穩(wěn)定，因而包含信息量較少，綜合評價中提供信息量較少；粗多糖得率、糖醛酸、總糖指標距離較遠，各自成組，包含信息量大，綜合評價中提供信息量更多。其次，不同批次靈芝多糖樣品并未就基源聚為3簇，表明基源對靈芝多糖影響較小。數(shù)據(jù)進行加權歸一化處理后，采用熵權法對粗多糖得率及內(nèi)在指標進行權重系數(shù)計算，結果顯示，粗多糖得率權重系數(shù)最高，其次為糖醛酸、總糖等，表明這些指標在不同批次靈芝藥材間變異范圍較大，是質(zhì)量評價體系中的重要因素，進一步驗證聚類結果。采用TOPSIS法對13批次藥材進行排序，并根據(jù)數(shù)值范圍對多批次藥材篩選。結果綜合評分排名靠前的靈芝藥材中，栽培靈芝子實體占比最高，其次為赤靈芝，最后為紫靈芝，表明栽培品靈芝子實體多糖品質(zhì)佳且相對穩(wěn)定，可作為靈芝多糖提取優(yōu)選來源。文獻［19-20］對多批次靈芝藥材基于多指標評價得出，不同來源靈芝子實體中多糖含量存在顯著差異，赤芝含量較紫芝高。蔡迎豐［21］指出不同來源的靈芝中，多糖含量差異顯著，自然環(huán)境中生長的野生靈芝多糖含量平均值要明顯低于人工栽培靈芝含量，與栽培條件、土壤質(zhì)量、采收時間等因素相關。本研究與上述結果結論基本一致，栽培靈芝子實體多糖綜合評分排序相對于靠前，其次為赤靈芝，最后為紫靈芝。

中藥的質(zhì)量控制和評價一直是中藥研究與發(fā)展的關鍵問題之一，也是難點和熱點問題。靈芝多糖結構多樣且復雜，現(xiàn)有原料及其制劑標準尚處于早期開發(fā)階段，企業(yè)在優(yōu)選過程中應當將粗多糖得率、糖組成、雜質(zhì)含量等因素納入質(zhì)量控制、藥材優(yōu)選考察范圍，其中粗多糖得率、糖醛酸、總糖可作為優(yōu)先考察指標。運用數(shù)學模型，從單一指標到綜合評價，可以排除主觀干擾，快速、準確且直觀對靈芝藥材質(zhì)量進行評價、優(yōu)選，也可為其他中藥材或飲片優(yōu)選及質(zhì)量評價提供參考。

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