摘要： 為挖掘更多的西瓜花藥、花粉發(fā)育相關(guān)基因，解析其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究以西瓜雄性不育植株和可育植株為材料，構(gòu)建遺傳分離群體，并利用BSA-seq和RNA-seq進(jìn)行基因定位和育性相關(guān)基因篩選。結(jié)果表明，雄性不育性狀由單個(gè)隱性細(xì)胞核基因控制，該基因被定位在6號(hào)染色體的5 766 829 bp至21 366 400 bp之間。結(jié)合SNP/InDel變異位點(diǎn)、基因注釋及表達(dá)分析，獲得1個(gè)關(guān)鍵候選差異表達(dá)基因Cla97C06G117840以及受該基因表達(dá)影響的20個(gè)其他差異表達(dá)基因。生物信息學(xué)分析推測(cè)Cla97C06G117840由于部分編碼序列缺失導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)提前終止，進(jìn)而引起花粉敗育。此外20個(gè)其他差異表達(dá)基因被富集在花藥壁絨氈層發(fā)育和花粉壁組件基因集通路中，可能形成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來影響花藥、花粉發(fā)育。本研究為后期基因功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 西瓜；雄性不育；育性相關(guān)基因；基因定位

中圖分類號(hào)： S651"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-4440（2024）06-1089-09

Screening and mapping of genes related to recessive nuclear male sterility in watermelon

ZHANG Gaoyuan， WEI Bingqiang

（College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Abstract： To explore more genes related to watermelon anther and pollen development and analyze its regulatory network， the genetic segregation population was constructed using watermelon male sterile materials and male fertile materials. And the gene mapping and fertility related gene screening were carried out by using BSA-seq and RNA-seq. The results showed that male sterility trait was controlled by a single recessive nuclear gene， which was mapped between 5 766 829 bp and 21 366 400 bp on chromosome 6. In combination with SNP/InDel variation site， gene annotation and expression analysis， one key candidate differentially expressed gene Cla97C06G117840 and 20 other differentially expressed genes affected by the expression of this gene were obtained. Bioinformatics analysis suggested that the deletion of some coding sequences of Cla97C06G117840 led to premature termination of the coding protein， resulting in pollen abortion. In addition， 20 other differentially expressed genes were enriched in the gene pathway of anther wall tapetum development and pollen wall assembly. These genes might form a gene regulatory network to affect anther and pollen development. This study can lay a foundation for later gene function verification.

Key words： watermelon；male sterility；fertility related genes;gene mapping

西瓜（Citrulus lanatas L.）是葫蘆科的園藝作物，因其果肉美味、營(yíng)養(yǎng)豐富，在世界各地廣泛種植。西瓜雜種一代具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，目前其雜交種多采用人工去雄套袋授粉獲得，不僅成本高而且難以保證種子純度，影響育種單位和生產(chǎn)者的利益。利用西瓜雄性不育系進(jìn)行制種可有效解決以上問題，但是西瓜雄性不育品種選育比較滯后。挖掘雄性不育相關(guān)基因是西瓜雄性不育分子育種的基礎(chǔ)。1962年Watts報(bào)道了西瓜雄性不育植株以后，人們開始對(duì)西瓜雄性不育進(jìn)行研究。細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果顯示西瓜雄性不育植株的絨氈層細(xì)胞多層，體積小，過早降解，無法為小孢子發(fā)育提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響小孢子四分體的形成[1-3]?？寡趸讣凹に匮芯拷Y(jié)果顯示在花藥發(fā)育過程中，不育株抗氧化酶活性變化和內(nèi)源激素含量異?？赡芘c西瓜雄性不育的發(fā)生密切相關(guān)[4]。遺傳標(biāo)記研究結(jié)果表明，利用RAPD技術(shù)對(duì)西瓜雄性不育株和可育株基因組DNA進(jìn)行比較分析，確定了特異片段A123k與育性基因的遺傳距離為8.1 cM[5]。POD同工酶分析結(jié)果顯示雄蕊中不育株較可育株多2條活性強(qiáng)的酶帶[6]。利用AFLP標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合BSA法，確定了特異片段 E31M50與西瓜雄性不育基因的遺傳距離為5.0 cM[7]。利用mRNA差異顯示技術(shù)，在雄性不育花蕾與可育花蕾中獲得了與育性相關(guān)的差異cDNA片段[8-9]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)1 259個(gè)基因在西瓜雄性不育花蕾和可育花蕾中差異表達(dá)[10]?；蚨ㄎ缓捅磉_(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)Cla006625和Cla001608是影響西瓜花藥花粉發(fā)育的關(guān)鍵基因[11-12]。

本研究前期鑒定出1個(gè)西瓜雄性不育材料，細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)絨氈層細(xì)胞發(fā)育不正常是導(dǎo)致花粉敗育的主要原因，并且在可育花蕾和不育花蕾中共發(fā)現(xiàn)4 011個(gè)差異表達(dá)基因[13]。為了明確導(dǎo)致雄性不育的原因，本研究以雄性不育材料為母本，雄性可育材料為父本構(gòu)建遺傳分離群體并進(jìn)行遺傳規(guī)律分析，然后結(jié)合集團(tuán)分離分析法（BSA-seq）以及轉(zhuǎn)錄組分析法（RNA-seq）進(jìn)行育性相關(guān)基因篩選和關(guān)鍵候選基因定位，為后期基因功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以雄性不育材料M0012為母本（P1），雄性可育材料WF-2018為父本（P2）構(gòu)建遺傳群體（F1和F2）。2021年4月23日，將35粒P1、35粒P2 、35粒F1 和400粒F2種子直播在甘肅省蘭州市甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田中，田間常規(guī)管理，待植株雄花顯現(xiàn)時(shí)進(jìn)行育性調(diào)查。利用SPSS17.0中的卡方檢驗(yàn)對(duì)西瓜雄性不育性狀的遺傳分析進(jìn)行適合度檢驗(yàn)。從F2分離群體中分別采集40株雄性不育單株葉片和40株雄性可育單株葉片構(gòu)建子代雄性不育混合池（MS-pool）和雄性可育混合池（MF-pool），親本P1和P2分別挑選1株并采集葉片構(gòu)建親本池，用于雄性不育相關(guān)基因定位。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 由上海歐易生物科技服務(wù)有限公司完成樣本DNA的提取、建庫(kù)和測(cè)序。采用CTAB法對(duì)P1、P2、MS-pool和MF-pool的葉片進(jìn)行DNA提取。利用NanoDrop核酸定量分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)。檢測(cè)合格的DNA樣品先經(jīng)過Covaris超聲波DNA破碎儀隨機(jī)打斷成350～500 bp的片段，然后利用TruSeq DNA LT Sample Prep kit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)構(gòu)建合格后利用測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用Fastp軟件[14]對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)（Raw data）進(jìn)行質(zhì)量控制，然后利用BWA軟件[15]將過濾后數(shù)據(jù)（Clean reads）比對(duì)到西瓜參考基因組（http：//cucurbitgenomics.org/ftp/genome/watermelon/97103/v2/）上，比對(duì)結(jié)果經(jīng)過SAMtools軟件[16]轉(zhuǎn)換格式后再利用Picard軟件（http：//broadinstitute.github.io/picard）去除冗余，并用Qualimap軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。使用GATK4軟件[17]的Haplotypecaller模塊進(jìn)行SNP和InDel檢測(cè)。為降低SNP和InDel檢測(cè)的錯(cuò)誤率，選用QD（經(jīng)過深度校正的質(zhì)量值）≥2.0的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾，只保留滿足該條件的突變位點(diǎn)。利用 Annovar軟件[18]對(duì)SNP和InDel檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行注釋。

1.2.3 SNP-index計(jì)算及候選基因篩選 篩選親本間純合差異的SNP位點(diǎn)。根據(jù)親本的基因型，對(duì)子代池進(jìn)行SNP檢測(cè)確定突變親本來源的 Read，計(jì)算子代池的SNP-index。同時(shí)將2個(gè)子代池的SNP-index相減獲得△SNP-index。利用二項(xiàng)分布檢驗(yàn)2個(gè)子代池的覆蓋深度，考慮其混池?cái)?shù)量以及群體類型，算出其統(tǒng)計(jì)學(xué)上95%的和99%的置信線，當(dāng)擬合線超出置信線的染色體區(qū)域?yàn)榭赡艿谋硇瓦B鎖區(qū)域。然后在超出置信線的染色體區(qū)域內(nèi)篩選候選基因。

1.2.4 候選基因表達(dá)及功能注釋 利用前期研究發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析候選基因在不育和可育花蕾中的表達(dá)情況，篩選定位區(qū)間內(nèi)的差異表達(dá)基因，并利用基迪奧云平臺(tái)在線分析軟件（https：//www.omicshare.com/tools）進(jìn)行基因本體（Gene Ontology;GO）功能注釋。利用Orthofinder軟件進(jìn)行同源基因分析[19]。利用Exon-Intron Graphic Maker在線軟件（http：//wormweb.org/exonintron）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)繪制?；虮磉_(dá)由R語言中Pheatmap和Ggpolt2包進(jìn)行繪制。Cla97C06G117840基因上游引物為5′-ATGTTTATTTGTTTCTTTGCTCTTTTC-3′，下游引物為5′-TTAATAGGTATTGGATGTGGTGGTG-3′，基因測(cè)序由擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.5 GSEA富集分析及蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè) 利用前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以定位基因表達(dá)模式為篩選標(biāo)準(zhǔn)線，計(jì)算其他基因與該基因的表達(dá)相關(guān)性，以西瓜基因GO功能注釋為背景文件，然后利用R語言進(jìn)行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），篩選重要富集通路中的調(diào)控基因。蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)由STRING在線軟件（https：//cn.string-db.org/）完成。利用Cytoscape軟件[20]進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄性不育表型和遺傳規(guī)律分析

前期表型研究發(fā)現(xiàn)雄性可育花蕾花藥飽滿，開花散粉正常，而不育花蕾花藥瘦小，呈空癟狀，并且細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果顯示花藥絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常是導(dǎo)致花粉敗育的主要原因[13]。遺傳群體育性調(diào)查發(fā)現(xiàn)F1全為可育株，說明不育性狀是由隱性基因控制。F2分離群體中可育單株290個(gè)，不育單株101個(gè)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，該比例符合3∶1的遺傳規(guī)律，說明雄性不育性狀是由單個(gè)隱性細(xì)胞核基因控制（表1）。

2.2 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

本試驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2個(gè)親本池和2個(gè)子代混合池進(jìn)行重測(cè)序。結(jié)果如表2所示，一共產(chǎn)生71.79 G的原始數(shù)據(jù)量，通過質(zhì)量控制過濾后獲得71.15 G的高質(zhì)量Clean read數(shù)據(jù)，有效數(shù)據(jù)比率達(dá)99.80%以上，G+C含量為34.79%～34.89%，Q20含量＞95.70%，Q30含量＞87.44%，說明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠合格，可用于下一步分析。

與參考基因組比對(duì)結(jié)果如表3所示，4個(gè)樣本比對(duì)率為99.35%～99.48%，平均覆蓋深度為39.515 0～49.183 2，平均比對(duì)質(zhì)量＞47，1X覆蓋度＞98.09%，10X覆蓋度＞96.36%，說明過濾后的數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)率和覆蓋度高，可以用于下一步SNP和InDel變異檢測(cè)。

2.3 SNP和InDel變異位點(diǎn)檢測(cè)和注釋

SNP注釋結(jié)果顯示4個(gè)樣本池中平均檢測(cè)注釋到26 521個(gè)SNP變異位點(diǎn)，其中子代池MS-pool最多，為30 900個(gè)，親本池P1最少，為16 063個(gè)；共注釋了10種SNP類型，其中編碼基因區(qū)域內(nèi)非同義SNP突變位點(diǎn)最多，4個(gè)樣本平均檢測(cè)注釋到2 428個(gè)，且子代池MF-pool中最多，為2 835，親本池P1中最少，為1 471（表4）。InDel注釋結(jié)果顯示4個(gè)樣本池中平均檢測(cè)注釋到26 052個(gè)InDel變異位點(diǎn)，其中子代池MS-pool中最多，為28 384個(gè)，親本池P1中最少，為20 715個(gè)。共注釋了14種InDel類型，其中編碼基因區(qū)域內(nèi)移碼缺失突變最多，4個(gè)樣本平均檢測(cè)注釋到155個(gè)，且親本池P2中最多，為172個(gè)，親本池P1中最少，為109個(gè)（表5）。

2.4 連鎖區(qū)域分析

利用△SNP-index進(jìn)行基因定位，結(jié)果顯示與雄性不育表型緊密連鎖區(qū)域位于6號(hào)染色體的5 766 829～21 366 400 bp（圖1A）。該區(qū)域在4個(gè)樣本池中共發(fā)現(xiàn)559個(gè)SNP變異位點(diǎn)和108個(gè)InDel變異位點(diǎn)，其中436個(gè)SNP和80個(gè)InDel變異位點(diǎn)位于基因間，50個(gè)SNP和9個(gè)InDel變異位點(diǎn)位于基因上游，27個(gè)SNP和10個(gè)InDel變異位點(diǎn)位于基因下游，35個(gè)SNP和8個(gè)InDel變異位點(diǎn)位于內(nèi)含子處，只有11個(gè)SNP和1個(gè)InDel變異位點(diǎn)位于外顯子（圖1B）。另外，位于SNP和InDel變異位點(diǎn)附近的候選基因共有136個(gè)。

2.5 候選基因篩選

利用前期已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)136個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)只有18個(gè)基因在可育花蕾（MFB_A和MFB_B）和不育花蕾（MSB_a和MSB_b）之間存在差異表達(dá)。在對(duì)比組（MFB_A/MSB_a）中，2個(gè)基因在不育花蕾中明顯上調(diào)表達(dá)，而12個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)。在對(duì)比組（MFB_B/MSB_b）中，4個(gè)基因在不育花蕾中明顯上調(diào)表達(dá)，而9個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá) （圖2A）。SNP、InDel變異位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，17個(gè)差異表達(dá)基因的SNP或InDel變異位點(diǎn)分別位于基因間、基因上游、基因下游和內(nèi)含子處，只有1個(gè)差異表達(dá)基因（Cla97C06G117840，編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子）的InDel變異位點(diǎn)位于外顯子處，而且該基因被注釋到花藥壁絨氈層發(fā)育（Anther wall tapetum development）、程序性細(xì)胞死亡的正調(diào)控（Positive regulation of programmed cell death）、細(xì)胞壁胼胝質(zhì)沉積（Callose deposition in cell wall）等代謝調(diào)控通路上（表6）。與可育花蕾對(duì)比，Cla97C06G117840基因在不育花蕾中下調(diào)表達(dá)，其編碼序列在1 554～1 563 bp處缺失10個(gè)堿基（GAACTGAAAC），其中GAA位于bHLH結(jié)構(gòu)域區(qū)域；由于堿基缺失導(dǎo)致編碼基因發(fā)生移碼，提早出現(xiàn)終止子（TAG），造成無法編碼BIF結(jié)構(gòu)域序列（圖3B）。另外，該基因是擬南芥bHLH91（AT2G31210）同源基因，研究結(jié)果表明該基因參與調(diào)控?cái)M南芥花藥及花粉發(fā)育[21]。因此，Cla97C06G117840基因被推測(cè)為導(dǎo)致西瓜雄性不育的關(guān)鍵基因。

2.6 關(guān)聯(lián)基因表達(dá)及富集通路分析

GSEA分析結(jié)果如圖3A所示，與Cla97C06G117840基因表達(dá)正相關(guān)的基因集的前5個(gè)富集通路主要為花粉壁組件（GO：0010208，富集分?jǐn)?shù)為0.75）、細(xì)胞外基質(zhì)組件（GO：0085029，富集分?jǐn)?shù)為0.75）、乙酰輔酶A代謝過程（GO：0006084，富集分?jǐn)?shù)為0.73）、花藥壁絨氈層發(fā)育（GO：0048658，富集分?jǐn)?shù)為0.72）和花粉外壁形成（GO：0010584，富集分?jǐn)?shù)為0.71）。

花藥壁絨氈層發(fā)育基因集通路中包含14個(gè)基因，其中11個(gè)基因包含在領(lǐng)頭亞基中（圖3A）。蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)結(jié)果顯示10個(gè)基因可能存在蛋白質(zhì)互作，其中8個(gè)基因在MFB-A/MSB-a對(duì)比組均差異表達(dá)。例如Cla97C02G030840與擬南芥AMS（AT2G16910）同源，下調(diào)88.7%，與bHLH91、MYB33、EMS1、MYB80、TDF1和MS1可能存在蛋白質(zhì)互作；Cla97C06G117840與擬南芥bHLH91同源，下調(diào)67.7%，與MYB80、TDF1和MS1可能存在蛋白質(zhì)互作；Cla97C11G207430、Cla97C11G207440和Cla97C11G207480與擬南芥MS1（AT5G22260）同源，分別下調(diào)61.5%、88.6%和92.1%，與TDF1和MYB80可能存在蛋白質(zhì)互作（圖3B）。因此，推測(cè)這8個(gè)基因在花藥絨氈層細(xì)胞發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。

花粉壁組件基因集通路中包含38個(gè)基因，其中22個(gè)基因包含在領(lǐng)頭亞基中（圖3A）。蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)顯示20個(gè)基因可能存在蛋白質(zhì)互作，其中16個(gè)基因在MFB-A/MSB-a對(duì)比組均差異表達(dá)。例如Cla97C10G188910與擬南芥ABCG26（AT3G13220）同源，下調(diào)85.3%，與CYP703A2、LAP6、ACOS5、TKPR2、CYP704B1、CALS5、FAR2、QRT3、LAP5、AT3G23770和MS1可能存在蛋白質(zhì)互作；Cla97C02G031180與擬南芥LAP5（AT4G34850）同源，下調(diào)86.2%，與TKPR2、QRT3和MS1可能存在蛋白質(zhì)互作；Cla97C04G069450與擬南芥FAR2（AT3G11980）同源，下調(diào)83.6%，與LAP6、TKPR2、LAP3、QRT3、LAP5和MS1可能存在蛋白質(zhì)互作；Cla97C05G088990與擬南芥LAP3（AT3G59530）同源，下調(diào)92.2%倍，與LAP5、LAP6和SWEET4可能存在蛋白質(zhì)互作（圖3C）。因此，推測(cè)這16個(gè)基因在花粉壁發(fā)育方面起著重要的調(diào)控作用。

3 討論

雖然Cla006625和Cla001608基因已被報(bào)道影響西瓜花藥、花粉發(fā)育 [11-12]，但其他的相關(guān)基因仍需挖掘。本研究利用BSA-seq方法在西瓜6號(hào)染色體的5 766 829～21 366 400 bp初步定位到1個(gè)雄性不育性狀相關(guān)的關(guān)鍵候選基因（Cla97C06G117840），并結(jié)合RNA-seq篩選出受該基因表達(dá)影響的20個(gè)其他差異表達(dá)基因。通過生物信息學(xué)分析推測(cè)這些基因在西瓜花藥、花粉發(fā)育過程中可能具有重要的調(diào)控作用。

擬南芥AtbHLH91與AtbHLH10 （AT2G31220）和AtbHLH89 （AT1G06170）存在功能冗余，可以通過BIF基序與DYT1互作，是DYT1激活花藥相關(guān)基因正常表達(dá)所必需的[21]。Cla97C06G117840是AtbHLH91同源基因，但該基因在西瓜中無旁系同源基因，無功能冗余現(xiàn)象，在雄性不育植株中發(fā)現(xiàn)該基因的編碼序列缺失10 bp，發(fā)生移碼突變，提早出現(xiàn)終止子，導(dǎo)致BIF基序缺失。因此，推測(cè)該基因由于BIF基序缺失，無法激活下游花藥相關(guān)基因的正常表達(dá)，最終導(dǎo)致花藥發(fā)育異常和花粉敗育。

在其他差異表達(dá)基因中，7個(gè)差異表達(dá)基因被富集在花藥壁絨氈層發(fā)育基因集通路中，分別與擬南芥TDF1、AMS、MYB80和MS1同源。研究結(jié)果顯示這些基因可構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（TDF1-AMS-MYB80-MS1），影響絨氈層細(xì)胞發(fā)育。其中TDF1編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，tdf1突變株中絨氈層細(xì)胞異常增大并液泡化，導(dǎo)致花粉敗育[22]。AMS編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，其突變體中絨氈層發(fā)育不正常而導(dǎo)致小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂失敗，隨后在四分體時(shí)期小孢子降解[23]。MYB80編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，其突變株出現(xiàn)絨氈層細(xì)胞過早降解，導(dǎo)致小孢子敗育[24]。MS1編碼PHD-finger核蛋白，突變后導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞分泌物合成及分泌異常，花粉外壁結(jié)構(gòu)改變，引起植物雄性不育[25]。因此，推測(cè)這7個(gè)差異表達(dá)基因可能構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在西瓜花藥絨氈層細(xì)胞發(fā)育過程中起著重要調(diào)控作用。

此外，13個(gè)差異表達(dá)基因被富集在花粉壁組件基因集通路中，分別與擬南芥CALS5、ARF17、LAP3、ACOS5、LAP5、FAR2、LAP6、CYP703A2、CYP704B1、TKPR2、ABCG26、QRT3和AT3G23770同源。研究結(jié)果顯示這些基因在胼胝質(zhì)合成、孢粉素前體形成等方面發(fā)揮著重要作用，基因突變后造成花粉壁發(fā)育異常，導(dǎo)致花粉敗育[26]。其中CALS5編碼胼胝質(zhì)合成酶，其突變后導(dǎo)致花粉外壁外層缺失[27]。ARF17為生長(zhǎng)素反應(yīng)因子，可以調(diào)控CALS5基因表達(dá)，影響胼胝質(zhì)合成[28]。LAP3屬于鈣依賴性磷酸三酯酶家族成員，其突變后導(dǎo)致花粉外壁形成異常[29]。8個(gè)基因可構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（FAR2-ACOS5-CYP703A2/CYP704B1-LAP5/LAP6-TKPR2-ABCG26），在孢粉素前體形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，基因突變后會(huì)導(dǎo)致孢粉素沉積受阻，進(jìn)而引起花粉敗育[30]。QRT3編碼聚半乳糖醛酸酶，基因突變后導(dǎo)致花粉母細(xì)胞壁降解缺陷，造成花粉發(fā)育后期小孢子分離失敗[31]。因此推測(cè)這13個(gè)基因在西瓜花粉壁發(fā)育過程中可能起著重要調(diào)控作用。

4 結(jié)論

通過BSA-seq方法在西瓜6號(hào)染色體的5 766 829～21 366 400 bp初步定位到1個(gè)雄性不育性狀相關(guān)的關(guān)鍵候選基因（Cla97C06G117840），推測(cè)該基因由于編碼序列部分缺失，提前出現(xiàn)終止子，造成BIF基序缺失，導(dǎo)致下游花藥相關(guān)基因表達(dá)異常，最終引起花粉敗育。此外結(jié)合RNA-seq方法篩選出受該基因表達(dá)影響的20個(gè)其他差異表達(dá)基因，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些基因可能存在互作關(guān)系，形成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在西瓜花藥、花粉發(fā)育中可能起著重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果將為后期西瓜雄性不育相關(guān)基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）

收稿日期：2023-05-06

基金項(xiàng)目：甘肅省教育廳創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2022B-102）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（GSCS-2020-09）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)公開招聘博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2017RCZX-30）

作者簡(jiǎn)介：張高原 （1987-），男，河南漯河人，博士，講師，研究方向?yàn)槲鞴嫌N及分子生物學(xué)。（E-mail）zhanggy@gsau.edu.cn