摘" 要： 對(duì)存在于德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和嗜熱鏈球菌（Lactobacillus delbrueckii）中的 3類(lèi)ISL3家族轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了篩選和定位，確定了各自的反向重復(fù)序列（IRs）和其外部的正向重復(fù)序列（DRs）. 觀察到 3類(lèi)轉(zhuǎn)座子的IRs有部分相同（5’-GGCTCTATAATTT-3’//5’- TTGACAAAGAGCC-3’），堿基A和T豐富的8 bp的DRs中保守堿基均為第5位T. 3類(lèi)轉(zhuǎn)座子中，轉(zhuǎn)座酶之間約30%的相同性，與IRs的部分相同性以及對(duì)最保守堿基的識(shí)別有關(guān). 分析結(jié)果為后續(xù)進(jìn)行相關(guān)的分子實(shí)驗(yàn)與研究或建立簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的數(shù)據(jù)庫(kù)打下基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞： 德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）； 嗜熱鏈球菌（Lactobacillus delbrueckii）； ISL3家族轉(zhuǎn)座子； 反向重復(fù)序列（IRs）； 正向重復(fù)序列（DRs）保守堿基

中圖分類(lèi)號(hào)： Q 933""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A""" 文章編號(hào)： 1000-5137（2024）03-0409-18

Comparison and analysis of the ISL3 family between Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus

DUAN Jingxiu， SONG Lei*

（College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract： In this study， three types of ISL3 family transposons in Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus are screened and localized. Their inverted repeat sequences （IRs） and external direct repeat sequences （DRs） were determined. Notably， the IRs of the three types of IRs partially shared the sequence 5'-GGCTCATAATTT-3'//5'-TTGACAAGAGCC-3'， and the 5th T was identified as the most conserved base in the 8 bp AT-rich DRs. Approximately 30% similarity among the three types of transposases in the ISL3 family transposons was attributed to the partial similarity of IRs and the recognition of the most conservative base of DRs. These findings will serve as a foundation for subsequent molecular experiments， research， or the establishment of a database on simple transposons.

Key words： Lactobacillus delbrueckii； Streptococcus thermophilus； ISL3 family transposons； inverted repeat sequences （IRs）；" conservative base of the direct repeat sequences （DRs）

0" 引言

德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）均屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes），德氏乳桿菌是乳桿菌屬（Lactobacillus）的代表種之一［1］，而嗜熱鏈球菌是鏈球菌屬（Streptococcus）中唯一的食用菌種［2］.

細(xì)菌通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件，如原噬菌體和轉(zhuǎn)座子等發(fā)生水平轉(zhuǎn)移后的基因占自身基因組中極其重要的一部分，在基因組的進(jìn)化中發(fā)揮重要作用［3-4］. 插入序列（IS）是原核生物基因組中最小和含量最豐富的自主轉(zhuǎn)座子，通常大小為700～3 000 bp，僅攜帶一或兩個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因［5-6］. IS兩端是反向重復(fù)序列（IRs），是轉(zhuǎn)座酶結(jié)合、供體DNA切除和DNA鏈轉(zhuǎn)移所必需的［6］. 通常，目標(biāo)DNA在插入位點(diǎn)處會(huì)產(chǎn)生2～14 bp的正向重復(fù)序列（DRs）［7-8］. BENDER等［9］對(duì)Tn10，以及HU等［10］對(duì)IS903的研究均表明，IRs外部的DRs結(jié)構(gòu)是非常重要的.

2006年，SIGUIER等［11］建立了ISfinder（www-is.biotoul.fr）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的或上傳到NCBI的IS進(jìn)行存儲(chǔ). 之后KICHENARADIA等［12］為該數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)了一個(gè)窗口并增加了一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（截至2017年11月）. 目前，幾乎所有可用于檢測(cè)原核生物中的IS的工具，如ISQuest等都是基于同源性的方法并依賴(lài)ISfinder中的數(shù)據(jù)［13］. 只有pnaISa［14］是基于IS的結(jié)構(gòu)特征，不需要參考數(shù)據(jù)庫(kù)，但相同轉(zhuǎn)座子的外部DRs不唯一. 2021年，PUTEROVá等［5］開(kāi)發(fā)了digIS軟件來(lái)監(jiān)測(cè)原核生物基因組中遠(yuǎn)緣和假定的新插入的IS. 雖然IS可基于不同的參數(shù)進(jìn)行分類(lèi)，但轉(zhuǎn)座酶中氨基酸的相同性仍然是一個(gè)主要參數(shù)［4，8，15］.

嗜熱鏈球菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種之間存在著復(fù)雜的關(guān)系［16］，通常作為發(fā)酵劑在酸奶生產(chǎn)中使用. 對(duì)兩者的研究大多集中在發(fā)酵方面，例如菌株篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化以及共生等，而在轉(zhuǎn)座子方面的研究相對(duì)較少. GERMOND等［17］在鑒定存在于牛奶發(fā)酵中的酶的基因關(guān)系時(shí)，在德氏乳桿菌中發(fā)現(xiàn)了ISL3，其大小為1 494 bp，兩側(cè)有38 bp的IRs，插入時(shí)產(chǎn)生8 bp的DRs.

本研究對(duì)存在于德氏乳桿菌與嗜熱鏈球菌全測(cè)序基因組中的ISL3家族轉(zhuǎn)座子的邊界序列及其DRs的保守堿基T進(jìn)行了比較與分析，確定其保守堿基的規(guī)律，從而了解ISL3家族轉(zhuǎn)座子在兩菌株之間的異同，為后續(xù)了解兩菌之間ISL3家族的親緣關(guān)系及其進(jìn)化規(guī)律提供依據(jù)，也可為后續(xù)進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究以及建立轉(zhuǎn)座子的數(shù)據(jù)庫(kù)打下基礎(chǔ).

1" 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載的德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌基因組全測(cè)序的基因注釋文件（GenBank文件）和核酸序列文件（FASTA文件）作為基本材料. 德氏乳桿菌共有26個(gè)亞種（截至2020年11月），嗜熱鏈球菌共有72個(gè)亞種（截至2021年3月）.

1.2 研究工具

使用的數(shù)據(jù)庫(kù)是NCBI.

使用軟件包括：文本編輯器、Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）、DNA反向互補(bǔ)工具（https：//www.vectorbuilder.cn/tool/dna-reverse-complement.html）.

1.3 研究方法及步驟

1.3.1 ISL3家族轉(zhuǎn)座子的篩選及分類(lèi)

（1） 任意選取一個(gè)德氏乳桿菌（或嗜熱鏈球菌）菌株中含有ISL3家族轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶序列為基準(zhǔn)（附表1），在NCBI全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行種內(nèi)比對(duì)，選出相同性為100%和99%的轉(zhuǎn)座酶序列位置.

（2） 分別用所獲取的轉(zhuǎn)座酶的上邊界上游400 bp，或下邊界下游400 bp堿基序列在NCBI的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)或部分測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中，按標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)進(jìn)行種內(nèi)比對(duì)，確定上邊界（或下邊界）的比對(duì)結(jié)果小于400 bp，且離其遠(yuǎn)的菌株作為陰性菌. 將陰性菌中的比對(duì)結(jié)果上下游各延伸1 kb的序列進(jìn)行種內(nèi)比對(duì)（Match/Mismatch中選擇（1，-2））. 在目標(biāo)轉(zhuǎn)座酶所在菌株的比對(duì)結(jié)果中，如果發(fā)現(xiàn)有序列重疊區(qū)，則可以大概預(yù)測(cè)該轉(zhuǎn)座子在該菌株的位置，同時(shí)嘗試是否能前后延長(zhǎng)邊界序列（允許存在3個(gè)不連續(xù)堿基的不匹配）.

1.3.2 利用CLUSTALW確定IRs

利用CLUSTALW將德氏乳桿菌（或嗜熱鏈球菌）得出的轉(zhuǎn)座子堿基序列，按照其相同性分別進(jìn)行序列比對(duì)，利用反向互補(bǔ)工具將所有轉(zhuǎn)座子堿基序列的方向調(diào)整為一致，可得出其IRs的起始點(diǎn)和終末點(diǎn)，從而確定IRs，手動(dòng)確定IRs外側(cè)的DRs.如果與轉(zhuǎn)座酶序列相同性一致的轉(zhuǎn)座子中，DRs包含IRs中的堿基的情況出現(xiàn)頻率大于25%，就將被包含堿基統(tǒng)計(jì)為DRs中的堿基.

1.3.3 DRs保守堿基的確定

以序列的方向，即5’到3’確定堿基位次. 首先，依次數(shù)出德氏乳桿菌（或嗜熱鏈球菌）中相同性一致的轉(zhuǎn)座子DRs各個(gè)位點(diǎn)中堿基T出現(xiàn)的頻次，統(tǒng)計(jì)其占總轉(zhuǎn)座子數(shù)量的百分比（即為其頻率）. 另外，將德氏乳桿菌（或嗜熱鏈球菌）中相同性一致的轉(zhuǎn)座子，按其整合位點(diǎn)進(jìn)行歸類(lèi)（即DRs相同，并且在不同菌株的同一整合位點(diǎn)為同一類(lèi)），統(tǒng)計(jì)DRs各個(gè)位點(diǎn)中堿基T出現(xiàn)的頻次，統(tǒng)計(jì)其占相同性一致轉(zhuǎn)座子的總類(lèi)數(shù)的百分比（即為其頻率）.

2" 結(jié)果與分析

2.1 3類(lèi)ISL3家族基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

德氏乳桿菌ISL3基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子Ld-KCTC3034ISL3-1-1大小為1 517 bp（表1），反向重復(fù)序列大小為38 bp，如圖1（a）所示；嗜熱鏈球菌ISL3基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子St-LMD9ISL3-1-1大小為1 429 bp（表3），IRs大小為24 bp，如圖1（b）所示；嗜熱鏈球菌基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子St-13496ISL3-2-1大小為1 433 bp（表5），IRs大小為28 bp，如圖1（c）所示. 由圖1可知， 3類(lèi)ISL3家族基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的IRs（波浪線(xiàn)部分）均為不完美反向重復(fù)（上游以GG開(kāi)頭，下游以CC結(jié)尾），中間包含一個(gè)ISL3家族轉(zhuǎn)座酶（斜線(xiàn)框部分），同時(shí)IRs外部均有8 bp的DRs（橫線(xiàn)部分）.

2.2 Ld-ISL3-1轉(zhuǎn)座子的分析

在德氏乳桿菌的26個(gè)亞種菌株中，與Ld-KCTC3034ISL3-1-1含有的轉(zhuǎn)座酶比對(duì)結(jié)果100%相同的共有15個(gè)拷貝，與其為99%相同的有10個(gè)拷貝，分別從中確定了10個(gè)和7個(gè)有陰性菌并且大小為1.5 kb 左右的Ld-ISL3-1. 剩下的8個(gè)（約30%）沒(méi)有被定位的原因是轉(zhuǎn)座酶假基因化、沒(méi)有找到陰性菌或能找到陰性菌但其大小明顯大于1.5 kb. 在17個(gè)Ld-ISL3-1中，Ld-KCCM 34717 ISL3-1 和Ld-NWC_1_2 ISL3-1分別有5個(gè)拷貝（表1，2）.

利用CLUATALW確定Ld-ISL3-1的IRs完全相同，包括基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子Ld-KCTC3034ISL3-1-1（圖1（a）、附圖1（a）和1（b））；在IRs外部，也均有8 bp富含堿基A和T的DRs（圖1（a）、表1和表2、附圖1（a）和1（b））.按DRs各位點(diǎn)中堿基T出現(xiàn)的頻次占總轉(zhuǎn)座子數(shù)量的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果為：在與基準(zhǔn)轉(zhuǎn)座子相同性為100%的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中，第5位和第6位堿基T出現(xiàn)的頻率均為100%；在與其相同性為99%的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中，第5位和第6位堿基T出現(xiàn)的頻率分別為85.71%和71.43%（表1，2）. 按整合位點(diǎn)類(lèi)別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得出結(jié)果與其一致. 由此推斷，該類(lèi)Ld-ISL3-1的DRs的保守堿基為第5位T.

在沒(méi)有被定位出簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的8個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因中，1個(gè)被注釋為假基因. 利用現(xiàn)有的方法發(fā)現(xiàn)剩余的7個(gè)中：有陰性菌且大小大于1.5 kb的基因有3個(gè)；沒(méi)有陰性菌的基因，利用IRs比對(duì)確定大小大于1.5 kb的有2個(gè)，等于1.5 kb的有2個(gè). 對(duì)上述大于1.5 kb的基因，在其上下游分別存在IRs，在IRs的外側(cè)也分別確定了8個(gè)堿基的DRs，且第5位都是保守堿基T. 對(duì)上述大小等于1.5 kb的基因，其中一個(gè)在其上下游找到了IRs，另一個(gè)找到的IRs有個(gè)別堿基的突變，但它們均沒(méi)有找到DRs.

2.3 St-ISL3-1轉(zhuǎn)座子的分析

在嗜熱鏈球菌的72個(gè)菌株中，與St-LMD9ISL3-1-1中的轉(zhuǎn)座酶相同性為100%的共有65個(gè)拷貝， 為99%的有34個(gè)拷貝，從中分別確定了62個(gè)和33個(gè)有陰性菌并且大小為1.4 kb左右的拷貝（表3，4）. 極個(gè)別的數(shù)據(jù)沒(méi)有被確定，原因都是沒(méi)有找到陰性菌. 在95個(gè)St-ISL3-1中，St-SMQ301ISL3-1有8個(gè)拷貝（表3，4）.

CLUATALW結(jié)果發(fā)現(xiàn)，95個(gè)St-ISL3-1的IRs絕大多數(shù)完全相同，包括基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的（圖1（b）、附圖2（a）和2（b））. St-STHCIRM1358ISL3-1-1下游IRs的倒數(shù)第二個(gè)堿基由C突變?yōu)門(mén)（附圖2（a））；St-ATCC19258ISL3-1-1和St-NCTC12958ISL3-1-1下游IRs的倒數(shù)第二個(gè)堿基由C突變?yōu)锳（附圖 2（b））. 上述3個(gè)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)由于IRs的突變而對(duì)其轉(zhuǎn)座酶的綁定產(chǎn)生影響. St-ISL3-1的IRs外部也均有8 bp富含AT的DRs，按DRs各位點(diǎn)中堿基T出現(xiàn)的頻次占總轉(zhuǎn)座子數(shù)量的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果是：與基準(zhǔn)轉(zhuǎn)座子相同性為100%的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中，第3位和第5位堿基T出現(xiàn)的頻率分別為87.10%和98.39%；與其相同性為99%的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中，第3位和第5位堿基T出現(xiàn)的頻率分別為90.91%和87.88%. 按整合位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果是：與基準(zhǔn)轉(zhuǎn)座子相同性為100%的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中，第3位和第5位堿基T出現(xiàn)的頻率分別為90.30%和95.65%；與其相同性為99%的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中，第3位和第5位堿基T出現(xiàn)的頻率分別為86.96%和95.65%. 由此推斷，St-ISL3-1的DRs的保守堿基為第5位堿基T（表3，4）.

在沒(méi)有被定位出簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的4個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因中，都沒(méi)有確定出陰性菌，利用IRs比對(duì)只確定出1個(gè)大小為1.5 kb的轉(zhuǎn)座子，但無(wú)DRs，其余的在轉(zhuǎn)座酶的10 kb范圍均不含有IRs.

2.4 St-ISL3-2轉(zhuǎn)座子的分析

在72個(gè)嗜熱鏈球菌的菌株中，與基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子St-13496ISL3-2-1含有的轉(zhuǎn)座酶相同性為100%的共有130個(gè)拷貝，為99%的有59個(gè)拷貝，從中分別確定了122個(gè)和52個(gè)有陰性菌并且大小為1.4 kb左右的拷貝. 其他約10%沒(méi)有被定位的原因是沒(méi)有找到陰性菌，或能找到陰性菌但其大小明顯大于1.4 kb. 在174個(gè)St-ISL3-2中，St-ST3ISL3-2有11個(gè)拷貝，為最多（表5，6）.

CLUATALW結(jié)果表明，St-ISL3-2IRs絕大多數(shù)完全相同，包括基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的IRs（圖1（c）、附圖3（a）和附圖3（b））. St-STHCIRM1121ISL3-2-1上游IRs的第1位堿基由G突變?yōu)锳，可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)產(chǎn)生極大的影響（附圖3（b））. 在IRs外部，絕大部分有8 bp富含AT的DRs，但在S. thermophilus MN-BM-A01和 MN-ZLW-002中各存在一個(gè)僅有7 bp富含AT的DRs，故不對(duì)這兩個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行保守堿基分析.對(duì)按DRs各位點(diǎn)中堿基T出現(xiàn)的頻次占總轉(zhuǎn)座子數(shù)量的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，第4，5和6位數(shù)值接近. 按整合位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果是：在與基準(zhǔn)轉(zhuǎn)座子相同性為100%的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中，第3位和第5位堿基T出現(xiàn)的頻率分別為84.62%和88.46%；在與其相同性為99%的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中，第3位和第5位堿基T出現(xiàn)的頻率均為77.78%. 由此可知，St-ISL3-2的DRs的最保守堿基為第5位T（表5，6）.

在沒(méi)有被定位出簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的15個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因中，利用現(xiàn)有的方法發(fā)現(xiàn)，存在陰性菌且大于1.4 kb的拷貝有6個(gè)；沒(méi)有陰性菌的利用與IRs比對(duì)，確定大小是1.5 kb的有8個(gè)；剩余1個(gè)在轉(zhuǎn)座酶的10 kb范圍內(nèi)不含有IRs. 上述大于1.4 kb的5個(gè)拷貝插入到了IS3-like element ISSth1b轉(zhuǎn)座子的內(nèi)部，此時(shí)找到的DRs均不含有第5位的保守堿基T，推測(cè)原有的IS3-like element ISSth1b轉(zhuǎn)座子影響了其識(shí)別DRs中的保守堿基；1個(gè)被ISL3轉(zhuǎn)座子插入，其兩對(duì)IRs的外側(cè)都有8個(gè)堿基的DRs，且第5位都是T. 上述大小為1.4 kb的8個(gè)中，1個(gè)存在DRs，并且第5位是保守堿基T， 7個(gè)沒(méi)有找到DRs.

3" 討 論

3.1 3類(lèi)ISL3家族簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子IRs ， DRs同轉(zhuǎn)座酶序列的關(guān)系

1995 年，GERMOND等［17］確定了L. delbrueckii N123中ISL3家族簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的IRs大小為38 bp. 1998年，MAHILLON等［7］的研究也有相同的結(jié)果，唯一不同為：其上游IRs第16位堿基為T(mén)，而本研究結(jié)果為C（圖1（a））. 同時(shí)，在L. delbrueckii N123中的，和實(shí)驗(yàn)中所形成的4個(gè)ISL3家族轉(zhuǎn)座子也在IRs的外側(cè)有8 bp的DRs，也是AT豐富區(qū)，而且保守堿基也是第5位T［17］. 實(shí)驗(yàn)中所形成的4個(gè)ISL3家族轉(zhuǎn)座子的IRs與本研究結(jié)果完全一致［17］.

Ld-ISL3-1，St-ISL3-1和St-ISL3-2的IRs在5’或3’均有部分完全相同（圖1的5’-GGCTCTATAATTT-3’//5’-TTGACAAAGAGCC-3’）；而在St-ISL3-1和St-ISL3-2中，IRs幾乎完全相同（圖1的波浪線(xiàn)部分）. 在 3類(lèi)ISL3家族轉(zhuǎn)座子IRs外部均存在8 bp的AT豐富的DRs，并且最保守堿基均為第5位T.

基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子Ld-KCTC3034ISL3-1-1中含有的轉(zhuǎn)座酶氨基酸（aa）數(shù)為427個(gè)，St-LMD9ISL3-1-1 與St-13496ISL3-2-1含有的轉(zhuǎn)座酶均由418個(gè)aa組成. 對(duì) 3類(lèi)ISL3家族轉(zhuǎn)座子中基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中含有的轉(zhuǎn)座酶序列進(jìn)行CLUSTALW比對(duì)，得出三者中有104個(gè)aa是相同的，如圖2（a）所示，該104個(gè)aa與轉(zhuǎn)座酶的部分綁定和對(duì)保守堿基的識(shí)別相關(guān). St-LMD9ISL3-1-1與St-13496ISL3-2-1中含有的轉(zhuǎn)座酶，有245個(gè)aa是相同的，該245個(gè)aa與轉(zhuǎn)座酶的完全綁定相關(guān)，如圖2（b）所示. 所以，轉(zhuǎn)座酶中剩余的141個(gè)aa（245減去104）與非三者共有的IRs的綁定相關(guān).

3.2 DRs不滿(mǎn)足保守堿基規(guī)律的情況

在Ld-SL3-1中，只有Ld-NWC12ISL3-1-4的DRs第5位堿基T不是保守堿基. 可觀察到，其轉(zhuǎn)座酶第310位的G（甘氨酸）突變成了V（纈氨酸），推測(cè)轉(zhuǎn)座酶的點(diǎn)突變可能會(huì)使其對(duì)保守堿基的識(shí)別產(chǎn)生影響.

在St-SL3-1中，只有St-ST64987ISL3-1-2的DRs第5位堿基T不是保守堿基. 其上游DRs前端、DRs和下游DRs后端形成11 bp的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，環(huán)即為DRs（圖3）. St-24740ISL3-1-3，St-13496ISL3-1-2，St-24738ISL3-1-2，St-24739ISL3-1-2這4個(gè)轉(zhuǎn)座子的DRs均相同（為5’-ATATAAAT-3’），在不同菌株的同一整合位點(diǎn)，它們分別在上下游DRs處形成一個(gè)包含完整DRs（圖中的豎線(xiàn)部分：5’-ATATAAAT-3’）的雙層莖結(jié)構(gòu)（圖4）. 特殊結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)可能使保守堿基的位點(diǎn)發(fā)生變化.

與標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子St-13496ISL3-2-1中含有的轉(zhuǎn)座酶相同性為100%的拷貝中，有3類(lèi)邊界DRs的保守堿基不符合所推測(cè)出的規(guī)律，它們的DRs分別為5’-AAATAAAA-3’，5’-AGATATAA-3’，5’-CATTATTT-3’. 對(duì)它們的DRs的旁鄰序列進(jìn)行了分析，并無(wú)明顯的特殊結(jié)構(gòu)而影響其保守堿基的位置，推測(cè)St-ISL3-2中轉(zhuǎn)座酶具有相對(duì)專(zhuān)一性的作用特點(diǎn). 在與標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子中含有的轉(zhuǎn)座酶相同性為99%的拷貝中，也存在類(lèi)似的情況.

3.3 DRs與整合位點(diǎn)的關(guān)系

Ld-KCTC3034ISL3-1-1與Ld-KCCM34717ISL3-1-1的DRs完全相同（5’-CAAATAAA-3’），并且整合在不同菌株的同一位點(diǎn)中. Ld-KCTC3034ISL3-1-3，Ld-KCCM34717ISL3-1-4，Ld-ND02ISL3-1-1雖然DRs完全相同（5’-TTATTTCT-3’），但Ld-KCTC3034ISL3-1-3與Ld-KCCM34717ISL3-1-4整合在同一位點(diǎn)，Ld-ND02ISL3-1-1整合于另一位點(diǎn). Ld-KCTC3034ISL3-1-2和Ld-KCCM34717ISL3-1-5含有的轉(zhuǎn)座酶與基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子Ld-KCTC3034ISL3-1-1含有的轉(zhuǎn)座酶分別具有100%和99%的相同性，但是這2個(gè)轉(zhuǎn)座子均含有相同的DRs（5’-CTTTTTT-3’），并且整合于同一位點(diǎn). St-ISL3-2中有21個(gè)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子含有5’-AGATATAA-3’的DRs，有20個(gè)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子含有5’-AAAAAAAA-3’的DRs，有15個(gè)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子含有5’-TAAAAAGA-3’的DRs，并且它們分別整合于同一位點(diǎn)（間隔序列中），這些位點(diǎn)為該類(lèi)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的整合熱點(diǎn). 黃元銘等［18］的研究表明，可移動(dòng)元件的插入位置越多，代表其轉(zhuǎn)座活性越高，因此在本研究中，St-ISL3-2的轉(zhuǎn)座活性最高，但也可能是由于該轉(zhuǎn)座子在該菌株中存在的時(shí)間過(guò)久，導(dǎo)致其插入位點(diǎn)最多.

將3個(gè)基準(zhǔn)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的核酸序列在ISfinder［11］數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)出的3種ISL3轉(zhuǎn)座子與ISfinder數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)的ISL3家族轉(zhuǎn)座子具有幾乎完全相同的IRs. Ld-ISL3-1的高同源序列ISL3（即E.value等于0）就是GERMOND等［17］在1995年的研究結(jié)果，該簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子可以發(fā)生轉(zhuǎn)位；St-ISL3-2的高同源序列ISSth1是MONNET等［19］在2004年的研究結(jié)果，該簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子可以發(fā)生轉(zhuǎn)位，并且該ISSth1的DRs中第5位堿基也是T；St-ISL3-1的高同源序列是ISSmu2［20］，IS1193D，IS1193，ISSth8［21-22］，但沒(méi)有這些簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子是否發(fā)生轉(zhuǎn)位的數(shù)據(jù)，從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)表現(xiàn)可知，這個(gè)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子極大概率是可以轉(zhuǎn)位的.

本研究結(jié)果表明：可利用ISL3轉(zhuǎn)座子作為基本元件構(gòu)建復(fù)合轉(zhuǎn)座子，從而實(shí)現(xiàn)大片段的基因轉(zhuǎn)移，也可以利用其活躍的“跳躍”能力建立基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，為全面分析基因組中基因的功能做準(zhǔn)備. 同時(shí)，也可為建立簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子的數(shù)據(jù)庫(kù)提供數(shù)據(jù).

4" 結(jié) 論

本研究對(duì)存在于德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌中的3類(lèi)ISL3家族轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了分析，得出德氏乳桿菌中ISL3家族轉(zhuǎn)座子與嗜熱鏈球菌中的2類(lèi)轉(zhuǎn)座子的IRs部分相同，嗜熱鏈球菌中2類(lèi)轉(zhuǎn)座子的IRs則幾乎完全相同. 3類(lèi)ISL3家族轉(zhuǎn)座子DRs大小均為8 bp，且是AT豐富區(qū)，最保守堿基均為第5位堿基T. 由此推斷出，3類(lèi)轉(zhuǎn)座子中，轉(zhuǎn)座酶之間約30%的相同性，與IRs的部分相同性和對(duì)最保守堿基的識(shí)別有關(guān).

參考文獻(xiàn)：

［1］""" 文偉， 楊泰， 韋良開(kāi)， 等. 德氏乳桿菌的生物學(xué)功能及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用 ［J］. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2019，31（4）：1533-1539.

WEN W， YANG T， WEI L K， et al. Biological functions of Lactobacillus delbrueckii and its application in animal production ［J］. Journal of Animal Nutrition， 2019，31（4）：1533-1539.

［2］""" GOH Y J， GOIN C， O'FLAHERTY S， et al. Specialized adaptation of a lactic acid bacterium to the milk environment： the comparative genomics of Streptococcus thermophilus LMD-9 ［J］. Microbial Cell Factories， 2011，10：1-22.

［3］""" DOBRINDT U， HOCHHUT B， HENTSCHEL U， et al. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms ［J］. Nature Reviews Microbiology， 2004，2（5）：414-424.

［4］""" CATHERINE G， PHAN T N L， MICHAEL C， et al. Detection and characterization of transposons in bacteria ［J］. Methods in Molecular Biology， 2020，2075：81-90.

［5］""" PUTEROVá J， MARTINEK T. DigIS： towards detecting distant and putative novel insertion sequence elements in prokaryotic genomes ［J］. BMC Bioinformatics， 2021，22（1）：258.

［6］""" VANDECRAEN J， CHANDLER M， AERTSEN A， et al. The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability ［J］. Critical Reviews in Microbiology， 2017，43（6）：709-730.

［7］""" MAHILLON J， CHANDLER M. Insertion sequences ［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 1998，62（3）：725-774.

［8］""" SIGUIER P， GOURBEYRE E， CHANDLER M. Bacterial insertion sequences： their genomic impact and diversity ［J］. FEMS Microbiology Reviews， 2014，38（5）：865-891.

［9］""" BENDER J， KLECKNER N. Tn10 insertion specificity is strongly dependent upon sequences immediately adjacent to the target-site consensus sequence ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1992，89（17）：7996-8000.

［10］" HU W Y， DERBYSHIRE K M. Target choice and orientation preference of the insertion sequence IS903 ［J］. Journal of Bacteriology， 1998，180（12）：3039-3048.

［11］" SIGUIER P， PEROCHON J， LESTRADE L， et al. ISfinder： the reference centre for bacterial insertion sequences ［J］. Nucleic Acids Research， 2006，34：32-36.

［12］" KICHENARADIA P， SIGUIER P， PEROCHON J， et al. ISbrowser： an extension of ISfinder for visualizing insertion sequences in prokaryotic genomes ［J］. Nucleic Acids Research， 2010，38：62-68.

［13］" BISWAS A， GAUTNIER DT， RANJAN D， et al. ISQuest： fnding insertion sequences in prokaryotic sequence fragment data ［J］. Bioinformatics， 2015，31（21）：3406-3412.

［14］" TREEPONG P， GUYEUX C， MEUNIER A， et al. PanISa： ab initio detection of insertion sequences in bacterial genomes from short read sequence data ［J］. Bioinformatics， 2018，34（22）：3795-3800.

［15］" SIGUIER P， FILEE J， CHANDLER M. Insertion sequences in prokaryotic genomes ［J］. Current Opinion in Microbiology， 2006，9（5）：526-531.

［16］" HERVE-JIMENEZ L， GUILLOUARD I， GUEDON E， et al. Physiology of Streptococcus thermophilus during the late stage of milk fermentation with special regard to sulfur amino-acid metabolism ［J］. Proteomics， 2008，8（20）：4273-4286.

［17］" GERMOND J E， LAPIERRE L， DELLEY M， et al. A new mobile genetic element in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ［J］. Molecular and General Genetics， 1995，248（4）：407-416.

［18］" 黃元銘， 李臻鵬， 程倩， 等.河弧菌可移動(dòng)遺傳元件的預(yù)測(cè)與分析 ［J］. 疾病監(jiān)測(cè)， 2022，37（5）：591-597.

HUANG Y M， LI Z P， CHENG Q， et al. Prediction and analysis of mobile genetic elements in Vibrio fluvialis ［J］. Disease Monitoring， 2022，37（5）：591-597.

［19］" MONNET C， PERNOUD S， SEPULCHRE A， et al. Selection and properties of Streptococcus thermophilus mutants deficient in urease ［J］. Journal of Dairy Science， 2004，87（6）：1634-1640.

［20］" AJDIC D， MCSHAN W M， MCLAUGHLIN R E， et al. Genome sequence of Streptococcus mutans UA159， a cariogenic dental pathogen ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2002，99（22）：14434-14439.

［21］" FLECHARD M， LUCCHETTI-MIGANEH C， HALLET B， et al. Intensive targeting of regulatory competence genes by transposable elements in streptococci ［J］. Molecular Genetics and Genomics， 2019，294（3）：531-548.

［22］" MAKAROVA K， SLESAREV A， WOLF Y， et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006，103（42）：15611-15616.

（責(zé)任編輯：顧浩然）