摘"要：華木蓮是木蘭科的珍貴瀕危樹種，具有重要的潛在應(yīng)用價值。本研究采用華木蓮葉片為實(shí)驗(yàn)材料，通過單因素實(shí)驗(yàn)，探究華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳消毒時長、最適宜激素濃度配比及最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明：（1）以0.1%的升汞溶液（HgCl2）作為消毒劑，消毒時長為8 min時，華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)外植體污染率最低；（2）MS培養(yǎng)基為華木蓮葉片組織培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基；（3）華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織形成最適激素配比為MS + 2.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L IBA。研究結(jié)果是對華木蓮組織培養(yǎng)技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，同時對華木蓮的保護(hù)與利用有一定的實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞：華木蓮；愈傷組織；消毒時長；激素濃度配比；培養(yǎng)基

中圖分類號：S792.99""""""文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A""""""文章編號：20959699（2024）03002305

華木蓮（Sinomanglietia glauca Q. Y. Zheng）又稱為落葉木蓮，是木蘭科木蓮屬落葉喬木，目前僅孤島狀分布于江西省宜春市的明月山和湖南省永順縣的朗溪鄉(xiāng)[1]，野外群體的面積不足36 km2，1996年被列為國家一級保護(hù)植物，收錄于《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》中。華木蓮是中國特有單屬種，其在木蘭科中的獨(dú)特進(jìn)化地位，對于研究木蘭科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化有重要作用[2]；同時，華木蓮樹形端莊優(yōu)美，花大芬芳、花香沁人心脾，具有較高的園林觀賞價值，已逐漸成為園林綠化的優(yōu)良樹種，被江西省宜春市評為市花[3-4]。然而，野生華木蓮種子萌發(fā)率和結(jié)實(shí)率較低，傳統(tǒng)的實(shí)生繁育手段無法滿足社會對華木蓮日益增長的需求[5-6]。

植物組織培養(yǎng)指的是在無菌條件下，將離體植物組織接種在特定培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的一種技術(shù)手段。目前，植物組織培養(yǎng)已經(jīng)成為獲得可再生完整植株的重要技術(shù)手段，同時也普遍應(yīng)用于生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)效益的植物衍生產(chǎn)品[7]。將植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到華木蓮的繁育中，不僅可實(shí)現(xiàn)華木蓮種苗的規(guī)?；a(chǎn)，提升華木蓮快速繁育能力，對華木蓮野生資源的保護(hù)以及開發(fā)利用亦有重要意義[8-10]。

近年來，組培技術(shù)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因育種、果蔬苗木栽植以及珍稀植物種質(zhì)資源保存中得到廣泛推廣和應(yīng)用，特別是在對瀕危植物的離體快速繁殖體系的構(gòu)建中，取得較大進(jìn)展[11-14]。但是，針對華木蓮組織培養(yǎng)技術(shù)尚未取得突破性進(jìn)展。本研究采用華木蓮葉片為實(shí)驗(yàn)材料，通過單因素實(shí)驗(yàn)，探究華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳消毒時長、最適宜激素濃度配比及最佳培養(yǎng)基，以期為華木蓮種質(zhì)資源保護(hù)及創(chuàng)新、苗木生產(chǎn)及繁育提供實(shí)驗(yàn)參考。

1"材料與方法

1.1"實(shí)驗(yàn)外植體準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)材料取自景德鎮(zhèn)學(xué)院苗圃地正常生長的華木蓮苗木，挑選生長健壯的華木蓮植株，剪取若干帶葉柄的嫩葉，先用自來水簡單沖洗后，然后用洗衣粉溶液洗去表面灰塵和雜質(zhì)，再用清水沖洗20～30 min，將葉片放入事先準(zhǔn)備好的蒸餾水中浸泡10 min，不斷搖晃，以便充分清潔。用0.1%的升汞溶液（HgCl2）浸泡30 s，以75%的酒精浸泡10 s，用無菌水沖洗1～2 min。用剪刀去除葉片主脈和葉緣，修剪成2.5 cm見方的方形葉片。將經(jīng)過處理的葉片放入培養(yǎng)皿中，置于超凈工作臺，打開紫外線燈照射消毒殺菌30 min后待用。

1.2"實(shí)驗(yàn)試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，來源于Phyto Technology Laboratories（簡稱Phyto Tech）的Murashige amp; Skoog（含維生素）；B5培養(yǎng)基、富鹽平衡培養(yǎng)基和高硝態(tài)氮培養(yǎng)基等按照陳世昌和徐明輝的方法進(jìn)行配制[15]；凝固劑采用瓊脂，來源于MicroanalysisInc 的Agar Powder；細(xì)胞分裂素使用6芐氨基嘌呤（6BA），即6Benzyil aminopurine；生長素使用吲哚乙酸（IBA），即Indole Acetic Acid。

1.3"實(shí)驗(yàn)方法

將處理好的材料放入高溫滅菌的無菌錐形瓶中，用濃度為75%的酒精浸泡30 s，去離子水沖洗3～5次，使用濃度為0.1%的升汞溶液進(jìn)行殺菌消毒。分別進(jìn)行如下處理：

1.3.1"消毒時長

將處理好的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行消毒，消毒時長分別設(shè)置為3 min、4 min、5 min、6 min、8 min、10 min，消毒后再用去離子水沖洗3～5次，充分洗凈，然后放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在事先配制好的MS + 1.5 mg/L 6BA+0.2 mg/L IBA培養(yǎng)基里面。每個消毒時長處理10瓶，每瓶3～5個葉片。

1.3.2"基本培養(yǎng)基

將處理好的材料分別接種至MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、富鹽平衡培養(yǎng)基、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基處理20瓶，每瓶3～5個葉片。

1.3.3"激素濃度配比

將處理好的材料接種至MS培養(yǎng)基，分別添加6BA（0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L）和IBA（0.05、0.10、0.20、0.40 mg/L）。每個處理20瓶，每瓶3～5個葉片，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下：

（1）MS培養(yǎng)基 + 6BA 0.50 mg/L + IBA 0.05 mg/L；

（2）MS培養(yǎng)基 + 6BA 1.00 mg/L + IBA 0.05 mg/L；

（3）MS培養(yǎng)基 + 6BA 1.50 mg/L + IBA 0.05 mg/L；

（4）MS培養(yǎng)基 + 6BA 1.50 mg/L + IBA 0.10 mg/L；

（5）MS培養(yǎng)基 + 6BA 1.50 mg/L + IBA 0.20 mg/L；

（6）MS培養(yǎng)基 + 6BA 1.50 mg/L + IBA 0.40 mg/L；

（7）MS培養(yǎng)基 + 6BA 2.00 mg/L + IBA 0.20 mg/L；

（8）MS培養(yǎng)基 + 6BA 2.00 mg/L + IBA 0.40 mg/L。

1.3.4"數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2020軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入、整理和方差分析。華木蓮?fù)庵搀w的污染率、存活率、愈傷率等計算公式如下［13-15］：

污染率（%）=污染的外植體個數(shù)÷接種外植體個數(shù)×100%；

存活率（%）=成活的外植體個數(shù)÷接種外植體個數(shù)×100%；

愈傷率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體個數(shù)÷接種外植體個數(shù)×100%。

2"研究結(jié)果

2.1"消毒時長對華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

華木蓮?fù)庵搀w污染率、存活率和愈傷率受葉片消毒時長的影響較為明顯，隨消毒時長增加，華木蓮?fù)庵搀w污染率逐漸下降（表1）。當(dāng)消毒時長為3 min時，污染率達(dá)到了100%；當(dāng)消毒時長增加到4 min時，其污染率降低到了84.22%；當(dāng)消毒時長增加到6 min時，華木蓮?fù)庵搀w污染率降低到43.25%；當(dāng)消毒時長調(diào)整到8 min和10 min時，華木蓮?fù)庵搀w的污染率分別為25.32%和23.58%，明顯低于短時間（3 min、4 min、5 min）消毒處理下的污染率，但是兩者之間的差異不明顯。

隨消毒時長增加，華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織存活率和愈傷率呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢（表1）。當(dāng)消毒時長為3 min和4 min時，華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織存活率較低，分別為23.52%和2517%；當(dāng)消毒時長為5 min和6 min時，華木蓮愈傷組織存活率可提升至34%左右；當(dāng)消毒時長為8 min時，華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織存活率和愈傷率均最高，分別為67.85%和37.82%；當(dāng)消毒時長增加到10 min時，存活率和愈傷率均降低，分別為63.28%和35.67%。綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對比污染率、愈傷率和存活率3個指標(biāo)，本次實(shí)驗(yàn)得出華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳消毒時長為8 min。

2.2"基本培養(yǎng)基對華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

基本培養(yǎng)基對華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生有明顯影響（表2）。MS培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，其污染率為37.50%，存活率達(dá)到了最高的65.82%，而愈傷率也達(dá)到了38.57%，切口有較多的愈傷組織形成，愈傷組織的生長速度較快；B5培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率相比較于MS培養(yǎng)基偏低，污染率為39.53%，存活率為40.37%，愈傷率為23.79%，愈傷組織的生長比較緩慢，且愈傷組織形成較少；富鹽平衡培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率較低，污染率為35.59%，存活率為45.28%，愈傷率為2813%，愈傷組織形成較少，且生長十分緩慢；高硝態(tài)氮培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，污染率很高，污染率達(dá)到了45.76%，愈傷率只有12.18%，幾乎沒有愈傷組織形成，且存活率僅有29.73%。MS培養(yǎng)基是進(jìn)行華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織有效形成的最佳培養(yǎng)基。

2.3"激素濃度配比對華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織形成與激素的濃度配比組成具有較大相關(guān)性（表3）。在IBA濃度一定時，6BA濃度的增加會導(dǎo)致華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織污染率略有降低，同時存活率和愈傷率出現(xiàn)不同程度的增加（表3處理1-3）。當(dāng)6BA濃度一定時，IBA濃度增加則會使得華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的污染率呈現(xiàn)先降低后增加的變化趨勢，同時伴隨著愈傷組織存活率和愈傷率先增大后降低（表3處理3-6）。當(dāng)培養(yǎng)基激素配比分別為（2.0 mg/L6BA + IBA 0.2 mg/L）時，愈傷組織誘導(dǎo)率較高（約36.25%），切口的愈傷組織形成數(shù)量較為可觀，生長速度較快，呈乳白色、疏松，形成的愈傷組織的質(zhì)量較好。綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以得出本次實(shí)驗(yàn)華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織形成最適激素配比為MS + 6BA 2.0 mg/L + IBA 0.2 mg/L。

3"討論

經(jīng)過數(shù)十年的研究、探索與發(fā)展應(yīng)用，植物的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，形成了材料選擇與前處理、外植體制備、接種和培養(yǎng)、移栽煉苗等四個主要階段。其中，接種和培養(yǎng)過程中無菌體系的建立是組織培養(yǎng)的核心，而外植體制備過程中的消毒處理又是重中之重[15]。外植體消毒時長直接影響愈傷組織污染率和存活率。0.1%升汞溶液是進(jìn)行組織培養(yǎng)時的常用消毒劑，但是不同植物材料的最適消毒時長存在明顯差異，例如桂花嫩葉組織的最佳消毒時長約為5 min[16]；中華枸杞的最適消毒時長約為8 min[17]；華木蓮莖段最佳消毒時長為7 min [18]。

MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的常用培養(yǎng)基之一，根據(jù)研究目的不同，學(xué)者們又開發(fā)出不同種類的培養(yǎng)基類型，例如林志魁等[18]指出，改良MS培養(yǎng)基可有效誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生；吳幼媚等[19]在MS培養(yǎng)基中加入Ca（NO3）2能夠誘導(dǎo)初始芽的產(chǎn)生，促進(jìn)芽的正常生長。研究發(fā)現(xiàn)，與其他類型的培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基接種的華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織污染率較低，成活率最高（約為65.82%），同時切口有較多的愈傷組織形成，愈傷組織生長較快，因此MS培養(yǎng)基是進(jìn)行華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基類型。

外源激素可有效誘導(dǎo)外植體不定芽分化以及芽苗生根培養(yǎng)，對植物組織培養(yǎng)有重要作用。6BA和IBA是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣的激素類型。辜夕容等[20]發(fā)現(xiàn)，低濃度的6BA有利于香樟莖段愈傷組織的形成與生長。外源激素不僅可以單獨(dú)起作用，激素間的不同配比對植物外植體愈傷組織形成有較大影響。任菲宏等[21]發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加6BA或生長素NAA均可誘導(dǎo)沙子空心李芽的分化；但是以適當(dāng)比例配置6BA與生長素NAA時，誘導(dǎo)增殖效果明顯提升。研究發(fā)現(xiàn)， 2.0 mg/L6BA + IBA 0.2 mg/L的配比是適用于華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織形成的最適激素配比，在這種激素水平下，華木蓮葉片外植體污染率最低，同時能夠維持最高的存活率。

4"結(jié)論

文章研究了不同消毒時間、激素配置和培養(yǎng)基對瀕危植物華木蓮組織培養(yǎng)的影響，測定了不同處理?xiàng)l件下華木蓮愈傷率、污染率和存活率等關(guān)鍵指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)表明：以0.1%的升汞溶液作為消毒劑，伴隨消毒時間增加，華木蓮愈傷組織污染率逐漸降低，綜合考慮污染率、愈傷率和存活率等指標(biāo)，8 min是華木蓮葉片組織培養(yǎng)的最適時間；MS培養(yǎng)基可作為華木蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基類型；2.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L IBA是適用于華木蓮葉片植物組織培養(yǎng)的最佳外源激素配比，在此條件下，華木蓮葉片誘導(dǎo)形成的愈傷組織污染率最低，同時能夠保持較高的存活率。

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責(zé)任編輯：肖祖銘

Preliminary Study on Leaf Tissue Culture of Endangered Plant Sinomanglietia glauca

YU Yiliang， DONG Xia， LING Yu， CHENG Ranran

（Jingdezhen University， Jingdezhen 333400， China）

Abstract： Sinomanglietia glauca is a precious and endangered tree species in Magnoliaceae family， with important potential application value. In this study， the optimal disinfection time， optimal hormone concentration ratio and optimal culture medium to induce callus were explored with leaves of Sinomanglietia glauca through single factor experiment. The results showed that： （1） 8 minutes was the optimal disinfection time， with 0.1% mercuric chloride solution （HgCl2） as disinfectant; （2） MS medium was the optimal basic medium for tissue culture of leaves of Sinomanglietia glauca; （3） The optimal hormone ratio for inducing callus formation in leaves was MS+2.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L IBA. These results are a summary of experience in tissue culture techniques of Sinomanglietia glauca， and have practical significance for its protection and utilization.

Keywords： Sinomanglietia glauca; disinfection duration; hormone concentration ratio; culture medium