摘要： 通過平板對峙實(shí)驗(yàn)、菌絲生長速率抑制實(shí)驗(yàn)，測試細(xì)菌對禾谷鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌、香蕉枯萎病菌、油茶炭疽病菌、巴西曲霉的抑菌活性，并通過固氮解磷實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)γ-聚谷氨酸實(shí)驗(yàn)探究增肥潛力。結(jié)果表明：細(xì)菌YY9，暹羅芽孢桿菌T1，T6，貝萊斯芽孢桿菌T3對菌絲生長速率抑制率均達(dá)到80%以上；細(xì)菌YY6～YY12表現(xiàn)出較強(qiáng)的固氮能力，細(xì)菌YY9產(chǎn)γ-聚谷氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到（6.57±0.34） g·L-1。

關(guān)鍵詞： 貝萊斯芽孢桿菌； 暹羅芽孢桿菌； 抑菌活性； 固氮能力； γ-聚谷氨酸

中圖分類號： S 476文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A"" 文章編號： 1000-5013（2024）05-0654-07

Evaluation of Antibacterial Activity and Fertilization Potential of Bacteria Derived From Mangrove Forests

Abstract： The antibacterial activity of bacteria against Fusarium graminearum， Fusarium pesudograminearum， banana wilt fungus， Camellia oleifera， and Aspergillus brasiliensis were tested through plate confrontation experiments and mycelial growth rate inhibition experiments. The fertilization potential was explored through nitrogen fixation and phosphorus removal experiment， as well as γ-polyglutamic acid production experiment. The results show that bacteria YY9， Bacillus siamensis T1 and T6， Bacillus velezensis T3 have inhibition rate" over 80% on mycelial growth rate. Bacteria YY6-YY12 show stronger nitrogen fixation ability， and the mass concentration of γ-polyglutamic acid produced by bacteria YY9 can reach （6.57±0.34） g·L-1.

Keywords： Bacillus velezensis； Bacillus siamensis； antibacterial activity； nitrogen fixation ability； γ-polyglutamic acid

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對維護(hù)人類糧食安全和社會穩(wěn)定起到了重要的作用。然而，植物病蟲害的不斷蔓延對農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量造成了嚴(yán)重威脅，限制了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，如假禾谷鐮刀菌（Fusarium pesudograminearum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）等病原真菌綜合侵染引起的小麥莖基腐?。?］，鐮刀菌或腐霉菌單獨(dú)侵染、鐮刀菌和腐霉菌復(fù)合侵染引起的玉米莖腐病［2］，古巴尖鐮孢菌侵染引起的香蕉枯萎病［3］， 油茶炭疽病菌（Camellia oleifera）則是危害油茶植株生長和產(chǎn)量的主要病害［4-5］。

防控植物病害的方法一般采用化學(xué)防控手段，但殺菌劑的長期使用會導(dǎo)致環(huán)境污染、生態(tài)失衡及“3R”問題的產(chǎn)生等，而生物防控對環(huán)境友好，病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，符合可持續(xù)發(fā)展需求。因此，開發(fā)綠色微生物農(nóng)藥有現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

微生物農(nóng)藥因具備選擇性高、對人畜無害、對自然環(huán)境污染小、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞，是目前發(fā)展最迅速、推廣應(yīng)用最成功的一類生物農(nóng)藥產(chǎn)品。與真菌和病毒等其他微生物農(nóng)藥相比，細(xì)菌易于培養(yǎng)，農(nóng)藥活性評價(jià)也相對容易。更重要的是細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝成熟，工業(yè)化生產(chǎn)成本可控，更加便于產(chǎn)業(yè)化利用。所以，細(xì)菌類微生物農(nóng)藥一直受到科研單位和企業(yè)的青睞，成為微生物農(nóng)藥研發(fā)創(chuàng)制和商業(yè)化開發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。在2010-2020年全球新登記的微生物農(nóng)藥中，細(xì)菌種類占比超過40%［6］。目前，我國主要生物農(nóng)藥品種多樣［7］，包括細(xì)菌類微生物農(nóng)藥、真菌類微生物農(nóng)藥、病毒類微生物農(nóng)藥、基因工程菌類微生物農(nóng)藥等，在植物保護(hù)、蟲害防治方面發(fā)揮著重要作用。

細(xì)菌不僅可以開發(fā)為生物農(nóng)藥，而且還有增肥效果。如某些細(xì)菌具有合成γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的能力。γ-PGA是由多種桿菌產(chǎn)生的一種胞外多肽，具有優(yōu)良生物相容性、生物降解性及無毒無污染性，廣泛用作藥物緩釋材料、食品的水凝劑及高強(qiáng)度纖維［8］。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面，γ-PGA可以用于改良酸化植煙土壤［9］，調(diào)節(jié)土壤微生物群落變化和促進(jìn)作物生長，富集有益微生物，在作物采摘后依舊維持較高的土壤生物活性［10］，與化學(xué)肥料合用，起到明顯提高肥效的作用［11］。目前，暹羅芽孢桿菌［12-13］、地衣芽孢桿菌［14］、枯草芽孢桿菌［11，15］等細(xì)菌均具有產(chǎn)γ-PGA的能力?；诖?，本文對紅樹林來源細(xì)菌抑菌活性及增肥潛力進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

γ-PGA（上海市麥克林生化科技股份有限公司）；葡萄糖，磷酸氫二鈉，硫酸鎂等藥品（國產(chǎn)分析純）；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南省長沙市湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)（上海市美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.2 供試試驗(yàn)菌株

油茶炭疽病菌由華僑大學(xué)化工學(xué)院王奇志副教授饋贈。香蕉枯萎病菌（banana wilt fungus）由華僑大學(xué)化工學(xué)院王明元教授饋贈。禾谷鐮刀菌，假禾谷鐮刀菌由江蘇省南京市中旗科技股份有限公司饋贈。巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）購自廣東省廣州市微生物菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基配方

培養(yǎng)基配方，如表1所示。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 細(xì)菌的分離

用無菌藥勺取約5 g福建省廈門市集美大橋紅樹林根部土壤，并將其裝于無菌培養(yǎng)皿中。將約1 g土壤倒入9 mL無菌水試管中，搖勻后，稀釋10倍。取0.5 mL稀釋液涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，30 ℃培養(yǎng)2～5 d。觀察微生物生長情況，依據(jù)菌落特征的差異挑取菌株。純化菌株，直到獲得單一菌落為止。挑選一部分菌株送往北京市擎科生物科技股份有限公司做16S rDNA鑒定。

2.2 固氮解磷效果

細(xì)菌固氮解磷的實(shí)驗(yàn)流程參考文獻(xiàn)［16］，并做略微調(diào)整。挑取一接種環(huán)培養(yǎng)物分別接種到阿須貝無氮培養(yǎng)基、蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基接種3～4株菌，培養(yǎng)5 d后觀察透明圈產(chǎn)生情況。

2.3 對病原真菌的拮抗活性

采用對峙培養(yǎng)法考察各細(xì)菌對病原真菌的拮抗活性［18］。在PDA中央位置接種病原菌菌絲，并在周邊等距接3～4株細(xì)菌，在室溫下培養(yǎng)5 d后觀察其拮抗效果。

2.4 對病原真菌菌絲體生長速率的抑制效果

實(shí)驗(yàn)過程參考文獻(xiàn)［16］，并做一些調(diào)整。取節(jié)2.3具有拮抗效果的菌株接種于裝有30 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)2 d后，取2 mL菌液加入到無菌培養(yǎng)皿中，隨后倒入約50 ℃，20 mL的PDA中，搖勻。待培養(yǎng)基凝固后，往培養(yǎng)基中央接種一環(huán)病原真菌菌絲，室溫下培養(yǎng)7 d，以不接細(xì)菌的PDA為對照。生長結(jié)束后分別測量對照組菌絲直徑、實(shí)驗(yàn)組菌絲直徑及菌絲生長速率抑菌率。菌絲生長速率抑制率計(jì)算式為

2.5 γ-PGA產(chǎn)量

采用比濁法建立γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確配制γ-PGA母液，γ-PGA質(zhì)量濃度為0.500 g·L-1，然后逐步稀釋成0.278，0.227，0.182，0.167，0.154，0.125，0.100 g·L-1溶液，備用。分別取3 mL各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液與等體積十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，0.07 mol·L-1）溶液混勻，室溫下靜置3 min后，測量其在400 nm波長下的吸光度（D（400））［19］。將各細(xì)菌接種于γ-PGA發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d后，發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1離心機(jī)中離心20 min，將1 mL上清液稀釋10，20倍，最終按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算γ-PGA質(zhì)量濃度。每株菌重復(fù)3次，最后計(jì)算平均值。

2.6 復(fù)合菌劑可能性

考察增肥潛力細(xì)菌與抑菌活性的芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)配的可能性。將具有增肥潛力的細(xì)菌YY6，YY11接種于50 mL的LB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h后，各取0.5 mL溶液涂布于PDA培養(yǎng)基上，隨后在培養(yǎng)基表面接種暹羅芽孢桿菌T1，T6（細(xì)菌T1，T6），貝萊斯芽孢桿菌T3（細(xì)菌T3），細(xì)菌YY9，30 ℃培養(yǎng)2 d后觀察是否有透明圈，不產(chǎn)生透明圈，則表明二者可共培養(yǎng)，有制備復(fù)合菌劑的可能。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 菌株分離

從紅樹林根部土壤中共分離到130多株細(xì)菌。取其中3株細(xì)菌T1，T3，T6進(jìn)行16S rDNA鑒定。結(jié)果表明，細(xì)菌T1，T6為暹羅芽孢桿菌 （相似性分別為99.93%和100.00%），細(xì)菌T3為貝萊斯芽孢桿菌（相似性為100%）。

暹羅芽孢桿菌于2010年被刊物International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology收錄為有效種名，屬芽孢桿菌科芽孢桿菌屬。研究表明，暹羅芽孢桿菌可用于治療煙草赤星?。?0-21］、花生白絹?。?2］，分解原油，降解土壤中化合物等，有著廣泛的應(yīng)用前景［23］。

貝萊斯芽孢桿菌對辣椒褐腐?。?4］、油菜根腫病和稻瘟?。?5］、禾谷鐮刀菌［26］均表現(xiàn)出良好的抑菌效果。目前僅有四川省成都市百事東旺生物科技有限公司登記的貝萊斯芽孢桿菌為生物農(nóng)藥（http：∥www.icama.org.cn/），貝萊斯芽孢桿菌還有較大的開發(fā)空間。

3.2 菌株固氮解磷效果

細(xì)菌YY5～YY12固氮解磷效果，如圖1所示。

由圖1可知：細(xì)菌YY6～YY12的透明圈直徑與菌落直徑的比值為2.0～5.2，具有較強(qiáng)的固氮效果；細(xì)菌YY7，YY11具有其他菌株不具備的解無機(jī)磷和有機(jī)磷效果，具有較強(qiáng)的增肥潛力研究價(jià)值。

3.3 對病原真菌拮抗活性的考察

各細(xì)菌對病原真菌拮抗效果，如圖2所示。由圖2可知：各菌株對5種植物病原菌表現(xiàn)出較明顯的抑菌效果，有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

3.4 植物病原真菌菌絲生長速率抑制實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌對病原真菌菌絲生長速率抑制效果圖，如圖3所示。

植物病原真菌菌絲生長速率抑制率，如圖4所示。

由圖3，4可知：4株細(xì)菌對5種植物病原真菌菌絲生長速率抑制率均在80%以上，其中細(xì)菌T3的抑制效果最佳，對5株植物病原菌菌絲生長速率抑制率均在90%以上。

菌株zk1的菌液對膠孢炭疽菌的抑制率達(dá)到91.63%，對哈茨木霉的抑制率也接近80%［27］。細(xì)菌Vel-HNGD-F2抑菌物質(zhì)粗提物對禾谷鐮刀菌抑菌率達(dá)到（63.21±0.94）%［26］。細(xì)菌Pm9對禾谷鐮刀菌、小麥全蝕病菌、小麥紋枯病菌、君子蘭莖基腐病菌、番茄灰霉病菌和南天竹炭疽病菌6 種供試植物病原菌抑制率在55.5%～87.5%之間［28］。細(xì)菌T3對植物病原菌的抑制率與文獻(xiàn)報(bào)道的一致，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

3.5 產(chǎn)γ-PGA的能力

γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3.355 74X-0.020 95，R2=0.995 3，其中Y為γ-PGA質(zhì)量濃度，X為D（400）。各菌株γ-PGA產(chǎn)量，如圖5所示。圖5中：ρ（γ-PGA）為γ-PGA質(zhì)量濃度。

由圖5可知：8株菌具有合成γ-PGA的產(chǎn)量，其中，細(xì)菌YY9合成的γ-PGA質(zhì)量濃度達(dá)到（6.57±0.34） g·L-1。 細(xì)菌CAU83的γ-PGA最高產(chǎn)量為30.10 g·L-1［29］，細(xì)菌LBY-7的γ-PGA最高產(chǎn)量為23.15 g·L-1［13］，細(xì)菌LW-1的γ-PGA最高產(chǎn)量為44.78 g·L-1［12］。因此，細(xì)菌YY9的γ-GPA產(chǎn)量還有很大的提升空間。

3.6 復(fù)合菌肥配制可能性評估

細(xì)菌與芽孢桿菌拮抗關(guān)系，如圖6所示。

由圖6（a）可知：細(xì)菌YY6與4株生防細(xì)菌有一定的拮抗關(guān)系，不能用于復(fù)配復(fù)合菌劑用，而細(xì)菌YY11可與細(xì)菌YY9進(jìn)行復(fù)配。

4 結(jié)論

1） 分離到的細(xì)菌具有固氮功能，其透明圈直徑與菌落直徑的比值在2.0～5.2，具有較強(qiáng)的固氮效果，對無機(jī)磷和有機(jī)磷的溶解效果則較弱。

2） 通過對峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，分離到的細(xì)菌T1，T6，T3，細(xì)菌YY9對5株植物病原真菌（禾谷鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌、香蕉枯萎病菌，油茶炭疽病菌、巴西曲霉）有抑制作用。通過菌絲體生長速率抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，4株細(xì)菌對5株植物病原真菌菌絲生長速率抑制率達(dá)到80%以上，尤其細(xì)菌T3的抑制率達(dá)到90%以上，有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。

3） 多株細(xì)菌具有合成γ-PGA的能力，細(xì)菌YY9合成γ-PGA的質(zhì)量濃度為（6.57±0.34） g·L-1，還有很大的提升空間。參考文獻(xiàn)：

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