［摘要］ 目的

探究長鏈非編碼RNA（lncRNA）AL365181.2在膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）中的表達水平及其對CHOL細胞功能學的影響。

方法 對腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫中有關CHOL患者癌組織和癌旁組織的lncRNA AL365181.2表達情況的資料進行比較，對lncRNA AL365181.2表達水平與CHOL組織免疫細胞浸潤情況的關系進行分析，并對lncRNA AL365181.2進行GSEA和KEGG富集分析。通過EdU實驗、劃痕實驗、Transwell實驗和裸鼠成瘤實驗分別檢測lncRNA AL365181.2對CHOL細胞增殖、遷移、侵襲和成瘤能力的影響。

結果 對TCGA數據庫所涉資料的分析結果顯示，與癌旁組織相比，CHOL組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2顯著高表達（Z=4.00，Plt;0.05），且lncRNA AL365181.2與CHOL組織的記憶T細胞及樹突狀細胞浸潤水平顯著相關（r=0.28、－0.34，Plt;0.05）；GSEA分析結果顯示lncRNA AL365181.2在CHOL細胞免疫調節(jié)相關通路中顯著富集，KEGG富集分析結果顯示lncRNA AL365181.2在細胞因子受體互作通路和血管壁細胞表面互作通路中顯著富集。體內外實驗結果顯示，敲低lncRNA AL365181.2后，CHOL細胞的增殖、遷移、侵襲及體內成瘤能力均顯著降低（t=4.23～173.34，Plt;0.05）。

結論 lncRNA AL365181.2在CHOL組織中較癌旁組織中高表達，并且表達水平與免疫細胞浸潤程度密切相關；lncRNA AL365181.2的表達水平與CHOL細胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力密切相關。

［關鍵詞］ 膽管腫瘤；RNA，長鏈非編碼；基因表達；細胞增殖；細胞運動；腫瘤浸潤；致癌作用

［中圖分類號］ R735.8

［文獻標志碼］ A

Expression and biological characteristics of long non-coding RNA AL365181.2 in cholangiocarcinoma

WANG Qinlei， SUN Zhaowei， GUO Jingyun， LI Haoran， FENG Yujie， ZHANG Bingyuan

（Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the expression level of long non-coding RNA （lncRNA） AL365181.2 in cholangiocarcinoma （CHOL） and its effect on the functional characteristics of CHOL cells.

Methods The Cancer Genome Atlas （TCGA） database was used to compare the expression level of lncRNA AL365181.2 between cancerous tissue and paracancerous tissue in CHOL patients， and the association between the expression level of lncRNA AL365181.2 and immune cell infiltration in CHOL tissue was analyzed. The Gene Set Enrichment Analysis （GSEA） and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis were performed for lncRNA AL365181.2. EdU assay， wound healing assay， Transwell assay， and xenograft tumor formation experiment were used to investigate the impact of lncRNA AL365181.2 on the proliferation， migration， invasion， and tumorigenic abilities of CHOL cells.

Results The analysis of TCGA data showed that the expression level of lncRNA AL365181.2 in CHOL tissue was significantly higher than that in paracancerous tissue （Z=4.00，Plt;0.05）， and lncRNA AL365181.2 was significantly associated with the infiltration of memory T cells and dendritic cells in CHOL tissue （r=0.28，-0.34，Plt;0.05）. The GSEA analysis showed that lncRNA AL365181.2 was significantly enriched in immune regulation pathways in CHOL cells， while the KEGG enrichment analysis showed significant enrichment of lncRNA AL365181.2 in cytokine receptor interaction pathways and cell surface interactions at the vascular wall. In vitro and in vivo experiments showed that after the knockdown of lncRNA AL365181.2， there were significant reductions in the proliferation， migration， invasion， and tumorigenic abilities of CHOL cells （t=4.23-173.34，Plt;0.05）.

Conclusion lncRNA AL365181.2 is highly expressed in CHOL tissue compared with paracance-

rous tissue， and its expression level is closely associated with the degree of immune cell infiltration. In addition， the expression level of lncRNA AL365181.2 is closely associated with the proliferation， migration， and invasion abilities of CHOL cells.

［KEY WORDS］ Bile duct neoplasms; RNA， long noncoding; Gene expression; Cell proliferation; Cell movement; Neoplasm invasiveness; Carcinogenesis

膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）是一種起源于膽管上皮細胞的，具有高度侵襲性且預后較差的惡性腫瘤。盡管近年來臨床上在CHOL的手術、化療及靶向治療方面取得了一定進展，但CHOL患者的總體生存率仍然很低［1］。根治性手術目前仍是治療CHOL并延長患者生存期的主要手段，但僅有極少數患者在確診為CHOL時具備手術適應證。為提高CHOL的早期診斷率和治療效果，深入研究CHOL發(fā)生發(fā)展的分子機制顯得尤為重要。長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為一類超過200個核苷酸且不編碼蛋白質的RNA分子，近年來在癌癥研究中受到了廣泛關注［2-3］。lncRNA在細胞基因表達調控、染色質修飾、轉錄后調控等方面發(fā)揮著重要作用，其參與了癌細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等關鍵過程，在多種腫瘤中表達異常［4-5］。因此，本研究通過分析lncRNA AL365181.2在CHOL組織中的表達水平及探究其表達水平對CHOL細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，以期為尋找CHOL的診斷和治療靶點提供新方向。

1 材料與方法

1.1 數據的獲取與處理

從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）獲得44例CHOL患者的轉錄組數據。使用R語言的ggplot2、stats和car包對患者癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2的表達水平進行差異性分析。

1.2 CHOL組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2表達水平與免疫細胞浸潤情況關系分析

以LM22基因簽名矩陣為參考，使用CIBERSORT工具計算TCGA數據庫中44例CHOL患者癌組織中各種免疫細胞類型的富集比例，并且對lncRNA AL365181.2表達水平與免疫細胞浸潤情況進行相關性分析，使用R語言中的ggplot2包對分析結果進行可視化。

1.3 CHOL組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2的GSEA和KEGG富集分析

利用GSEA的預定義基因集合庫c5.all.v7.0.symbols.gmt和c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt文件，使用GSEA（4.2.3）軟件對TCGA數據庫中44例CHOL患者癌組織的轉錄組數據進行GSEA分析，根據標準化富集得分來評估基因集顯著性。通過lncRNA AL365181.2的單基因差異分析篩選出顯著差異表達的基因（Plt;0.05），并將這些基因輸入KEGG數據庫（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）中進行通路富集分析。

1.4 人CHOL細胞系的分組及轉染

將人CHOL細胞系HUCCT1、QBC939以及RBE細胞（均購自中國科學院上海細胞庫）分別接種于6孔板中，在培養(yǎng)至細胞密度為50%～70%時將三種細胞分別分為非轉染組和轉染組。轉染組轉染si-lncRNA AL365181.2，非轉染組轉染陰性對照小干擾RNA（siRNA），然后將轉染完成的細胞置于

37 ℃、相對濕度95%、含體積分數0.05的CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用于后續(xù)實驗。

1.5 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（EdU）增殖實驗檢測各組細胞增殖能力

將1.4中處于對數生長期的非轉染組和轉染組HUCCT1、QBC939、RBE細胞分別接種于96孔板中（每孔2 000個），待細胞貼壁后于每孔加入20 μL預熱的2×EdU工作溶液孵育2 h；吸棄工作液，使用4%多聚甲醛固定細胞30 min，隨后使用含3% BSA的PBS溶液作為洗滌液繼續(xù)清洗細胞3次。使用含0.3% TritonX-100的PBS溶液通透細胞膜15 min，使用Click反應溶液和1×Hoechst 33342染色溶液分別標記增殖細胞及所有細胞的細胞核，用熒光顯微鏡觀察并記錄每視野下熒光信號。計算EdU陽性細胞率評估細胞增殖情況。EdU陽性細胞率=（EdU陽性細胞數/總細胞數）×100%。

1.6 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力

將含有8 μL孔徑的Transwell小室的上室預先用Matrigel基質膠涂層，并在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h；將Transwell小室放入24孔板中，并在下室添加含體積分數0.1胎牛血清的完全培養(yǎng)基500 μL。將1.4中分組細胞使用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，并把細胞懸液加入上室，培養(yǎng)24 h后使用棉簽輕輕擦拭上室內未遷移的細胞。使用4%多聚甲醛固定Transwell小室中已遷移至下室的細胞30 min，然后用0.1%結晶紫染色30 min。通過顯微鏡觀察并計數侵襲至下室的細胞數，以評估細胞侵襲能力。細胞侵襲率=（侵襲細胞數/接種細胞數）×100%。

1.7 劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力

將1.4中分組細胞接種于6孔板中，當細胞鋪滿6孔板底部時，使用200 μL濾芯吸頭尖端進行垂直劃痕操作。隨后使用PBS清洗細胞3次，并于37 ℃、相對濕度95%、含體積分數0.05的CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的第0、48小時于同一視野下使用熒光顯微鏡進行拍攝并測量劃痕面積。細胞遷移率=（劃痕面積0 h－劃痕面積48 h）/劃痕面積0 h×100%。

1.8 動物實驗檢測各組細胞的體內成瘤能力

將6只4周齡裸鼠（購于北京維通利華科技有限公司）隨機分為對照組和實驗組（每組3只），在無菌條件下用PBS將1.4中非轉染組和轉染組RBE細胞的200 μL（約3×106個細胞）細胞懸液分別經右側腋下注射至對照組和實驗組裸鼠皮下。每周觀察裸鼠體表腫瘤生長情況，于第5周時采用CO2法使裸鼠安樂死，取出裸鼠體內腫瘤組織并測量腫瘤體積。腫瘤體積=0.5×腫瘤長度×腫瘤寬度2。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用R 4.2.1及GraphpadPrism軟件對數據進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x-±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2的表達水平差異分析采用R語言中軟細胞進行Mann-Whitney U檢驗；lncRNA AL365181.2表達水平與免疫細胞浸潤之間的關系采用Pearson法分析。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結" 果

2.1 CHOL組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2的表達水平分析

Mann-Whitney U檢驗結果顯示，CHOL組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2的表達水平顯著高于癌旁組織（Z=4.00，Plt;0.05）。

2.2 CHOL組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2的GSEA和KEGG富集分析

GSEA結果顯示，lncRNA AL365181.2在白細胞介素對信號傳導的負調節(jié)、利什曼原蟲感染、血管壁細胞表面相互作用、FCε受體信號傳導以及淋巴和非淋巴細胞間的免疫調節(jié)相互作用等通路中顯著富集；KEGG富集分析表明lncRNA AL365181.2在細胞因子受體互作通路和血管壁細胞表面互作通路中顯著富集。

2.3 CHOL組織中l(wèi)ncRNA AL365181.2表達水平與免疫細胞浸潤間關系

使用CIBERSORT分析lncRNA AL365181.2在CHOL組織中表達水平與22種免疫浸潤細胞的相關性，結果表明記憶T細胞（Tem）及樹突狀細胞（DC）的浸潤與lncRNA AL365181.2相關性最為顯著（r=0.28、－0.34，Plt;0.05）。見圖1。

2.4 lncRNA AL365181.2表達水平對CHOL細胞增殖、侵襲和遷移的影響

EdU實驗結果表明，轉染組與非轉染組比較，HUCCT1、QBC939和RBE細胞的增殖能力顯著下降（t=4.23～7.14，Plt;0.05），見圖2；劃痕實驗結果表明，轉染組與非轉染組比較，HUCCT1、QBC939和RBE細胞的遷移能力顯著下降（t=9.56～31.06，Plt;0.05），見圖3；Transwell實驗結果表明，轉染組與非轉染組比較，HUCCT1、QBC939和RBE細胞的侵襲能力顯著下降（t=4.76～9.27，Plt;0.05），見圖4、表1。

2.5 lncRNA AL365181.2的表達水平對裸鼠體內腫瘤增殖的影響

裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示，第5周時對照組與實驗組裸鼠腫瘤體積分別為（1 700.35±8.41）、（459.72±9.11）mm3，實驗組裸鼠第5周時腫瘤體積顯著小于對照組（t=173.34，Plt;0.05）。見圖5。

3 討" 論

lncRNA是一類總長度超過200個核苷酸的RNA分子［6-8］，它們不編碼蛋白質，但在基因表達調

控、染色質重塑、轉錄后調控和細胞內信號傳導等方面發(fā)揮重要作用［9-10］。lncRNA在腫瘤中的作用機制多種多樣，其可通過調控關鍵信號通路（如PI3K/

Akt、MAPK等）影響腫瘤細胞的增殖、凋亡以及遷移［11］，也可以通過與微小RNA（miRNA）相結合調控下游基因的表達，從而影響腫瘤細胞的行為［12-14］。lncRNA同樣參與了多種生理和病理過程，包括細胞的增殖、分化、凋亡，以及腫瘤、神經退行性疾病等的發(fā)生和發(fā)展［15-16］。

lncRNA AL365181.2在乳腺導管內上皮癌和胃惡性腫瘤的進展中扮演著重要調節(jié)角色［17-19］。然而目前尚無研究能夠證實lncRNA AL365181.2與CHOL的相關性。本研究通過分析TCGA數據庫中CHOL患者的轉錄組數據，結果發(fā)現(xiàn)lncRNA AL365181.2在CHOL組織中表達水平較癌旁組織更高。免疫細胞浸潤在腫瘤的發(fā)展中起關鍵作用［20-22］，本研究對CHOL組織中免疫細胞浸潤情況的分析表明，lncRNA AL365181.2表達水平與多種免疫細胞亞群的浸潤程度相關，特別是與Tem及DC的相關性最為顯著。隨著lncRNA AL365181.2表達水平的增加，Tem的浸潤程度也增加，而DC的浸潤程度則減少，這表明lncRNA AL365181.2對于CHOL中免疫細胞浸潤可能具有調控作用，但其具體機制尚不明確。因此本研究進一步分析了lncRNA AL365181.2的富集通路，其中GSEA結果顯示，lncRNA AL365181.2在多條免疫調節(jié)相關信號通路當中顯著富集，而KEGG富集分析結果表明，lncRNA AL365181.2在細胞因子受體互作通路和血管壁細胞表面互作通路中顯著富集。盡管上述通路未表明lncRNA AL365181.2與CHOL的發(fā)生直接相關，但它們可能是未來研究的重要方向之一。

為進一步驗證lncRNA AL365181.2表達水平對CHOL進展的影響，本研究進行了CHOL細胞的體內外實驗。EdU實驗、劃痕實驗和Transwell實驗結果均表明，敲低CHOL細胞中的lncRNA AL365181.2能顯著抑制CHOL細胞的增殖、遷移和侵襲能力；裸鼠體內實驗的結果則表明，lncRNA AL365181.2表達水平下降能夠抑制CHOL細胞在裸鼠體內的成瘤能力，為CHOL腫瘤抑制策略的研究提供了重要實驗依據。

本研究揭示了lncRNA AL365181.2在CHOL中的潛在作用，但其具體機制仍需進一步探索，根據目前研究推測有如下機制：①lncRNA AL365181.2可能通過自身與染色質重塑復合物（如polycomb抑制復合物2）相互作用調節(jié)特定靶基因表達，從而影響了CHOL細胞的增殖和存活［23］；②lncRNA AL365181.2可能作為競爭性內源RNA［24］，通過吸附某些miRNA（例如miR-34a），從而釋放靶基因（例如BCL2、CDK6），以促進CHOL細胞的增殖和侵襲［25］。

本研究存在一些局限性。首先，本研究樣本量較少，可能導致研究結果產生一定偏差。其次，研究數據主要來源于TCGA數據庫，缺乏對不同種族、地域和臨床背景的廣泛覆蓋。因此，我們未來的研究應擴大樣本量，納入更多的臨床樣本數據，從而提高結果的可信度。另外，lncRNA AL365181.2作為CHOL的潛在生物標志物，其在CHOL臨床診斷和治療中的應用價值有待進一步驗證。未來的研究也應聚焦于lncRNA AL365181.2作為CHOL診斷和預后評估標志物的可行性。

綜上所述，lncRNA AL365181.2在CHOL組織中顯著上調，其表達水平與CHOL中免疫細胞浸潤情況密切相關，并且可能通過調節(jié)免疫相關通路影響CHOL的發(fā)生發(fā)展；敲低裸鼠體內lncRNA AL365181.2表達水平可顯著抑制CHOL細胞的增殖、遷移、侵襲與成瘤能力。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫(yī)學倫理委員會的審核批準（文件號AHQU-MAL202209-02）。所有實驗過程均遵照《赫爾辛基宣言》和中國有關臨床試驗研究規(guī)范法規(guī)進行。

作者聲明：王欽磊、孫兆偉、郭敬允、李浩然參與了研究設計；王欽磊、馮玉杰、張炳遠參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）