引用格式：楊林澔，陳淼，李庠，等. 龍牙百合鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)石蠟切片技術(shù)改良研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024（6）：10-13，20.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.006.003

收稿日期：2023-12-13

基金項(xiàng)目：湖南省科學(xué)技術(shù)廳種業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目（2021NK1005）；湖南省自然基金項(xiàng)目（2023JJ30292）

作者簡(jiǎn)介：楊林澔（1998—），男，山西河津人，碩士研究生，主要從事觀賞園藝研究。

通信作者：李玉帆

摘要：為了準(zhǔn)確觀測(cè)龍牙百合鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)的生長(zhǎng)分化過(guò)程，以龍牙百合冷藏期間的鱗莖為試驗(yàn)材料，在傳統(tǒng)石蠟制片法的基礎(chǔ)上，對(duì)脫水、透明等步驟進(jìn)行優(yōu)化并篩選了最佳的甲苯胺藍(lán)染色方法。試驗(yàn)獲得的百合鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)石蠟切片制作改良方法為：將百合鱗莖剝開(kāi)鱗片至可觀察到莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，修整為5 mm大小的立方體投入FAA固定液中，保存一周；用85%乙醇（2 h）、95%乙醇（2 h）、100%乙醇（3 h）進(jìn)行脫水處理，再用二甲苯與乙醇等比例溶液（2 h）、純二甲苯（3 h）進(jìn)行透明處理；將透明好的材料放入石蠟+二甲苯溶液（體積比2∶3）中，在37 ℃的恒溫箱中浸蠟2 d，期間多次少量加入石蠟；之后在60 ℃

恒溫箱更換純石蠟2次，每次4 h，浸蠟后的材料在60 ℃的操作臺(tái)上包埋，再切成厚10 μm的薄片，待蠟片完全伸展，將蠟片粘于均勻涂抹了赫伯特粘片劑的載玻片上，37℃烤片5 h，脫蠟復(fù)水后用1%甲苯胺藍(lán)染液稀釋150倍染色3 min。

關(guān)鍵詞：龍牙百合；鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)；石蠟切片；技術(shù)改良

中圖分類號(hào)：S644.1; Q-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）06-0010-04

Improvement of Paraffin Sectioning Conditions for the Growing Point of Lilium brownii var. viridulum Baker Bulb

YANG Lin-hao1，2，CHEN Miao1，2，LI Xiang3，MA Jie3，LI Yu-fan1，2

（1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Engineering Research Center for the Breeding and Utilization of High-Quality Flowers and Trees in the Mid-Subtropical Zone， Changsha 410128， PRC;

3. Hunan Cotton Science Institute， Changde 415000， PRC）

Abstract： To accurately observe the growth and differentiation process of the growing point of Lilium brownii var. viridulum Baker bulb， this study employed the conventional method to prepare the paraffin sections of the bulbs stored in the refrigerator. The dehydration and transparentizing steps were optimized and the toluidine blue staining method was selected. The conditions for preparing the paraffin sections were improved as follows. First， the scales of a lily bulb were peeled off to expose the growth point， which was then trimmed into a cube of 5 mm × 5 mm × 5 mm. The cube was fixed in FAA solution for one week， dehydrated with 85% ethanol for 2 h， 95% ethanol for 2 h， and 100% ethanol for 3 h， and then transparentized with the mixture of xylene and ethanol （1：1） for 2 h and pure xylene for 3 h. The transparent cube was then immersed in a mixture of paraffin and xylene （volume ratio of 2：3） at 37 °C for 2 days， during which a small amount of paraffin was supplemented multiple times. Afterwards， the mixture medium was replaced with pure paraffin in a thermostat incubator at 60 °C twice， each time for 4 h. After that， the material was embedded at 60 °C. The wax block was sliced into pieces with a thickness of 10 μm. After full extension， each slice was put onto a glass slide evenly coated with Herbert gelatin adhesive， and the slide was then heated at 37 °C for 5 h. After dewaxing and rehydration， the slide was stained with 1% toluidine blue staining solution diluted by 150 times for 3 min.

Key words： Lilium brownii var. viridulum Baker; growing point of bulb; paraffin section; technical improvement

龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）是

百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）的多年生球根草本植物，是我國(guó)三大食用百合之一，因鱗片飽滿肥厚，形狀似龍牙而得名[1]。龍牙百合在湖南隆回縣有500多年的栽培歷史，后引入江西萬(wàn)載，現(xiàn)已成為兩個(gè)地方的中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品[2]。龍牙百合花型優(yōu)美，氣味清香，有鮮切花、盆花觀賞、或作花境等多種應(yīng)用方式，具有較高的觀賞價(jià)值；龍牙百合還是重要的藥用植物，鱗片含有豐富的生物堿、蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪以及人體所需的各種維生素和微量元素，具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰、清心安神、補(bǔ)中益氣的功效。因此，龍牙百合是一種重要的藥、食、觀賞兼用植物，具有重要的經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)價(jià)值。

百合鱗莖具有自然休眠特性，未解除休眠的鱗莖種植后會(huì)出現(xiàn)發(fā)芽率不高和盲花現(xiàn)象，不同品種的鱗莖需要不同程度的低溫處理，才能打破休眠發(fā)芽生長(zhǎng)。王家艷等[3]研究報(bào)道，不同種類的百合，鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)生長(zhǎng)分化的時(shí)間不同，有的是在冷藏期間發(fā)生，有的是在冷藏打破休眠后在種植期間莖尖開(kāi)始進(jìn)行分化[4]。精確掌握百合鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)分化的進(jìn)程對(duì)于百合的花期調(diào)控和周年生產(chǎn)非常重要[5]，目前還沒(méi)有龍牙百合鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)分化時(shí)間和進(jìn)程的研究報(bào)道[4]。

石蠟切片是觀察植物花芽分化進(jìn)程的常見(jiàn)手

段[5-6]，傳統(tǒng)石蠟切片制作方法在百合石蠟切片的制作過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)無(wú)法形成完整的蠟帶情況，甚至出現(xiàn)斷裂、碎裂問(wèn)題，影響后續(xù)觀察。不少研究者針對(duì)不同植物材料的石蠟切片制片方法進(jìn)行了改良研究[7]，取得了較好效果。本研究以龍牙百合為試驗(yàn)材料，在傳統(tǒng)石蠟切片方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)脫水、透明、浸蠟等步驟進(jìn)行改良，探究適合龍牙百合鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)石蠟切片的制作方法和染色方法，以期為進(jìn)一步研究龍牙百合鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)花芽分化進(jìn)程提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

龍牙百合鱗莖，從湖南隆回一線情農(nóng)業(yè)科技有限公司采購(gòu)，鱗莖整齊飽滿、無(wú)病蟲害、無(wú)損傷，消毒后冷藏保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院8 ℃冷庫(kù)。

FAA固定液、無(wú)水乙醇、二甲苯、固體石蠟、甲苯胺藍(lán)染色劑，采購(gòu)于長(zhǎng)沙市博儀生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固定 按照王原媛等[8]采用的石蠟切片固定與保存方法，隨機(jī)取樣大小統(tǒng)一的百合鱗莖，在顯微鏡下使用解剖針剝開(kāi)鱗片至可觀察到莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，將材料修整為5 mm大小的梯形立方體（圖1），加入約為材料體積15～20倍的FAA固定液，4 ℃保存一周以上。

1.2.2 脫水、透明、浸蠟 針對(duì)龍牙百合莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的特點(diǎn)，以脫水（A）、透明（B）、浸蠟（C）為三

因素，每個(gè)因素設(shè)3種不同的處理方法（表1、表2、

表3），采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共組合成處理1

“A1B1C1”、處理2“A1B2C3”、處理3“A1B3C2”、處理

4“A2B1C3”、處理5“A2B2C2”、處理6“A2B3C1”、處理

7“A3B1C2”、處理8“A3B2C1”、處理9“A3B3C3”，各處理按照“脫水→透明→浸蠟”步驟操作。在脫水后，依據(jù)脫水材料放入二甲苯溶液中的變化判斷脫水是否徹底，若溶液渾濁，出現(xiàn)白色沉淀，則脫水不干凈；沒(méi)有變渾濁則表示脫水干凈。

1.2.3 包埋、切片 提前打開(kāi)恒溫臺(tái)并融化石蠟，取出1.2.2處理好的樣品進(jìn)行石蠟包埋，操作時(shí)將樣品側(cè)放在金屬模具中并在上方放置包埋盒，隨后緩慢注入石蠟，待包埋盒表層石蠟?zāi)Y(jié)，緩慢放入冰水中等待脫模，包埋好的蠟塊放入4℃冰箱中保存。切片前，先將蠟塊邊緣修整齊平，再將蠟塊固定在轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)上，將蠟塊切為薄片，切片厚度為10 μm；將切好的蠟帶按順序排列，待蠟片完全伸展，將蠟片粘于均勻涂抹了赫伯特粘片劑的載玻片上，將載玻片置于37 ℃的展片臺(tái)上烤片5 h。

1.2.4 脫蠟復(fù)水 將裝有載玻片的染色架依次進(jìn)行二甲苯、乙醇浸泡脫蠟至蒸餾水沖洗處理：純二甲苯10 min（2次）→1/2純二甲苯＋1/2無(wú)水乙醇10 min→無(wú)水乙醇10 min→95%乙醇7 min→85%乙醇7 min→70%乙醇7 min→50%乙醇7 min→30%乙醇7 min→蒸餾水流水沖洗10 min，將載玻片上的石蠟溶洗干凈，并選用完整、連貫的切片進(jìn)行染色。

1.2.5 染色 脫蠟后的切片選用甲苯胺藍(lán)染色液染色：將1%濃度甲苯胺藍(lán)染色液用蒸餾水分別稀釋50、100、150倍，選用相同脫水處理1.2.4制成的切片分組染色5 s 、10 s 、30 s、1 min 、3 min 、5min（表4），共得到18組不同染色處理的切片，隨后置于37℃烘箱中烤片，等待觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合莖尖石蠟切片不同脫水時(shí)間的效果比較

由圖2可知，A1處理組放入純二甲苯溶液后出現(xiàn)大量白色沉淀（圖2a），A2處理組出現(xiàn)少量白色沉淀（圖2b），A3處理組沒(méi)有沉淀（圖2c）。結(jié)果表明，A3脫水處理的材料脫水效果最好。

2.2 百合莖尖石蠟切片的切片效果比較

由表5可知，脫水處理相同，透明和浸染方法不同的三組處理組內(nèi)比較，處理3、處理6、處理9的蠟塊在切片時(shí)分別優(yōu)于同一脫水處理組其他2個(gè)處理，說(shuō)明在相同脫水條件下，延長(zhǎng)透明時(shí)間、浸蠟時(shí)間的切片效果更好；處理3、處理6和處理9之間相比較，處理9切出的蠟帶無(wú)斷裂卷曲，蠟片無(wú)破碎缺失，切片效果最好，說(shuō)明通過(guò)改良脫水、透明、浸蠟方法，制得的石蠟切片在切片過(guò)程中蠟帶、蠟片的效果明顯提升。結(jié)果表明，在百合莖尖石蠟切片制作中獲得脫水、透明、浸蠟方法的最佳組合是處理9（A3B3C3）：脫水方法是85%、95%乙醇各1次，每次2 h，100%乙醇2次，每次2 h；透明方法是在石蠟+二甲苯溶液（體積比1∶1）中透明2 h，再在二甲苯中透明2次，每次1.5 h；浸蠟方法是石蠟二甲苯溶液（體積比2∶3）在37 ℃恒溫箱停留2 d，期間多次少量加入石蠟，之后在60℃恒溫箱更換純石蠟2次，每次4 h。

2.3 百合莖尖石蠟切片甲苯胺藍(lán)染色的優(yōu)化

由圖3可知，在染液稀釋50倍時(shí)，染色時(shí)間1、3、5 min時(shí)材料呈現(xiàn)深綠色，細(xì)胞界限模糊，且切片部分區(qū)域大量染液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致區(qū)域顏色變深；染色5、10 s時(shí)切片顏色較淺，觀察不清晰；染色30 s較為清晰。染液稀釋100倍時(shí)，5、10、30 s時(shí)細(xì)胞雖然較為清楚，但顏色呈現(xiàn)紫色、較淺，染色不均；染色1 min與3 min的切片效果較為相似，整體呈現(xiàn)深綠色，染色均勻度較好，但橫向比較同一時(shí)間梯度下剩余切片可知其穩(wěn)定性一般，個(gè)別切片還有組織破碎的現(xiàn)象發(fā)生；染色5 min時(shí)著色效果最佳，細(xì)胞均呈淡藍(lán)色且細(xì)胞形態(tài)清晰可見(jiàn)，低倍和高倍鏡下觀察效果均表現(xiàn)良好，所以在稀釋100倍條件下，最適宜的染色時(shí)間為5 min。染液稀釋150倍時(shí)，染色時(shí)間少于3 min的處理染色不均勻，其染色穩(wěn)定性較差；染色時(shí)間為3 min時(shí)切片色彩對(duì)比度高，染色均勻度較好，其穩(wěn)定性也比其他處理組要好；染色5 min組織比較符合預(yù)期，但相同染色時(shí)間的大量切片對(duì)比后，染色5 min組會(huì)出現(xiàn)深淺不一的情況，染色穩(wěn)定性較差；綜合比較下，3 min為稀釋150倍甲苯胺藍(lán)染液的最優(yōu)染色時(shí)間。

將不同染色液稀釋倍數(shù)在最佳染色時(shí)間下的石蠟切片照片在顯微鏡下觀察比較，稀釋50倍（圖3A）與100倍（圖3B）的染色液著色較深，染色后細(xì)胞邊界與稀釋150倍（圖3C）相比更模糊，圖3C清晰度最優(yōu)，可以觀察到完整的組織。結(jié)果表明，甲苯胺藍(lán)染色龍牙百合鱗莖尖石蠟切片最佳的染色處理為1%甲苯胺藍(lán)染液稀釋150倍，染色3 min。

3 討論與結(jié)論

材料的脫水是石蠟切片制備中重要的步驟，植物組織中含有大量水分，水和石蠟是不能溶合的，脫水能使組織中的水分完全除去，并使組織變硬，有研究表明脫水時(shí)間過(guò)久會(huì)造成材料硬化，切片時(shí)會(huì)碎裂[9]。本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同的乙醇濃度、時(shí)間來(lái)探究最適的脫水時(shí)間，得到最適的脫水方法為85%乙醇、95%乙醇脫水，再替換為100%乙醇脫水，提高了脫水質(zhì)量，也減少了后續(xù)切片中組織破碎的風(fēng)險(xiǎn)，這與康云艷等[10]對(duì)黃瓜幼嫩莖段切片制作改良的結(jié)果一致，同時(shí)相比傳統(tǒng)石蠟制片法，極大減少了脫水時(shí)間[5， 11]。

透明過(guò)程中使用的二甲苯具有一定毒性，操作時(shí)需要做好防護(hù)，透明步驟的時(shí)間也要適中，時(shí)間太短，酒精無(wú)法完全置換干凈，會(huì)導(dǎo)致石蠟無(wú)法浸入材料，但是透明太久也可能造成組織硬化，影響切片。本試驗(yàn)將透明方法改良后，相比傳統(tǒng)石蠟制片法[5]進(jìn)一步縮短了透明時(shí)間，方便后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。但在實(shí)際操作時(shí)，對(duì)于不同種類的植物材料，脫水和透明方法應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況改變[8]。

浸蠟是石蠟制片中另一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，本試驗(yàn)的材料為龍牙百合鱗莖莖尖，其特性是質(zhì)地柔軟、較為脆弱，根據(jù)這種特性應(yīng)選擇熔點(diǎn)為56～58 ℃的純凈石蠟。由于石蠟不易溶于二甲苯，故而需要延長(zhǎng)浸蠟時(shí)間，另外第一次浸蠟要最好少量多次添加石蠟，并在之后經(jīng)常更換純蠟，以保證石蠟?zāi)軌蚋耆珴B透入材料，再與組織之間形成更為緊密的結(jié)合，形成一個(gè)整體，提升蠟塊與切片的質(zhì)量，這與李澤華等[12]的研究結(jié)果一致。在浸蠟的同時(shí)，要維持恒溫箱內(nèi)的溫度穩(wěn)定，防止出現(xiàn)溫度變化過(guò)大的情況。操作時(shí)可以考慮將鑷子先預(yù)熱，再和材料一同放入恒溫箱內(nèi)操作，避免鑷子插入或取出時(shí)，因石蠟的溫度過(guò)低而凝固，影響效果[11]。

甲苯胺藍(lán)作為較常見(jiàn)人工合成染料其染色效果與蘇木精相類似，在觀察組織結(jié)構(gòu)時(shí)，染液過(guò)淺或過(guò)深會(huì)致使染色對(duì)比度不高，效果不佳，所以要根據(jù)材料特性配置染色液。在本次試驗(yàn)中，比較了不同染色液濃度及染色時(shí)間對(duì)石蠟切片制備效果的影響，結(jié)果表明最佳甲苯胺藍(lán)染色體系為將1%濃度的甲苯胺藍(lán)染液稀釋150倍，在染缸中染色3 min。另外需留心溶液調(diào)制技巧，如染料現(xiàn)配現(xiàn)用等；染色期間還需特別注意水流清洗速度及操作時(shí)間，可以使用較低水流速度沖洗樣品，顯微切片效果更好。

本試驗(yàn)獲得的百合鱗莖生長(zhǎng)點(diǎn)石蠟切片制作改良方法為：將百合鱗莖剝開(kāi)鱗片至可觀察到莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，修整為5 mm大小的立方體投入FAA固定液中，保存一周；使用85%乙醇（2 h）、95%乙醇（2 h）、100%乙醇（3 h）進(jìn)行脫水處理，再用二甲苯與乙醇等比例溶液（2 h）、純二甲苯（3 h）進(jìn)行透明處理；將透明好的材料放入石蠟+二甲苯溶液（體積比2∶3）中，在37 ℃的恒溫箱中浸蠟2 d，期間多次少量加入石蠟；之后在60℃恒溫箱更換純石蠟2次，每次4 h，浸蠟后的材料在60 ℃的操作臺(tái)上包埋，切成厚10 μm的薄片，待蠟片完全伸展，將蠟片粘于均勻涂抹了赫伯特粘片劑的載玻片上，將載玻片置于37℃的展片臺(tái)上烤片5 h，脫蠟復(fù)水后用1%甲苯胺藍(lán)染液稀釋150倍染色3 min。

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（責(zé)任編輯：謝培庚）