【關鍵詞】人類蛋白酶體激活劑1/2；細胞周期蛋白依賴性激酶15；子宮內膜癌；增殖；侵襲

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是最常見的婦科癌癥，近幾年來新發(fā)病例逐年增長，嚴重影響著廣大女性朋友的生命健康。在世界范圍內，EC占所有新發(fā)癌癥病例總數(shù)的3.5%[1-2]。我國每年大約有5萬新發(fā)EC患者，死亡率36%[3]。高?；颊咧蠩C的復發(fā)率約為13%[4]。因此，發(fā)現(xiàn)新的標志物篩查手段、延緩或控制腫瘤的進展及開發(fā)新的治療方案對改善患者的預后有非常重大的意義。

人類蛋白酶體激活劑（proteasome activator subunit，PSME）為蛋白酶多肽酶活性的激活因子，調節(jié)蛋白酶體的功能，是普遍存在于真核細胞胞漿和胞核中具有降解細胞內蛋白質作用的蛋白酶體的激活劑之一，其家族成員共有4 個，分別是PSME1（PA28α）、PSME2（PA28β）、PSME3（PA28γ）和PSME4（PA200）[5]。PSME1和PSME2常優(yōu)先形成異二聚體，結合于蛋白酶體的開放點，激活酶體，通過促進外來抗原降解產(chǎn)生抗原肽，參與主要組織相容性復合體Ⅰ類抗原（mhci antigen integrity Ⅰ，MHCⅠ）的提呈 [6]。而多項研究表明，PSME1 和PSME2在多種癌癥中表達失調，提示其可能作為疾病治療的潛在靶點及預后指標[7]。細胞周期蛋白依賴性激酶15（cyclin-dependentkinase 15，CDK15）是細胞周期依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDKs）家族成員之一，CDK家族的一些家族成員參與細胞轉錄調節(jié)，而CDK15 的具體作用還尚未明確，既往研究發(fā)現(xiàn)其與CDK14具有同源性，存在于PFTAIRE和PCTAIRE家族中[8]，并且可能與抑制癌癥的侵襲、遷移和轉移相關[9]。

PSME1/2在乳腺癌中表達增高，PSME2在子宮內膜癌中的也呈現(xiàn)高表達[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)PSME1/2的上調抑制了CDK15的表達，促進了乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移[12]。而在EC中，少見相關研究報道。因此，本研究檢測了PSME1/2、CDK15在hEEC 人正常子宮內膜細胞系、人子宮內膜腺癌細胞（human endometrial adenocarcinoma cells，HEC1B）和HEC-251 EC細胞系、原代細胞中表達情況，分析了二者之間的相關性，以及其對EC細胞系惡性生物學行為的影響；并且通過對本中心98例EC患者標本檢測及隨訪數(shù)據(jù)的分析，探究了二者表達水平與臨床病理因素和患者預后的相關性，為EC治療提供新的靶點和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年至2020年重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院婦產(chǎn)科EC患者的手術標本（分別取EC組織和癌旁正常組織），共98例，記錄好患者的基本信息（包括性別、年齡、住院號、聯(lián)系方式）、術中浸潤深度、病理編號、術后治療方案等。標本采集征得患者及家屬同意，本研究獲重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：2020年科倫審145號）。所有的子宮內膜癌患者術前未接受新輔助治療，依據(jù)FIGO指南行手術治療，其中腺癌95例，漿液性癌3例；高分化32例，中分化49例，低分化17例；I期72例，Ⅱ期7例，Ⅲ期17例，Ⅳ期2例；這些組織的病理結果經(jīng)本院病理科醫(yī)師診斷證實。收集的組織一部分用福爾馬林固定石蠟包埋用于免疫組織化學染色技術（immunohistochemical staining technique，IHC），其余另一部分存儲于-80℃冰箱中用于信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白質提取。

1.2 試劑與抗體

人永生化正常子宮內膜細胞hEEC、子宮內膜腺癌細胞株HEC1B、HEC-251購自上海雅吉生物科技，原代細胞為由高表達PSME1/2的低分化腺癌患者標本培養(yǎng)的原代細胞系；siRNA干粉購自北京擎科生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)基購自武漢普諾賽公司；新生胎牛血清購自美國Scitecher公司；轉染試劑購自美國Thermo Fisher公司；用于免疫組化的兔抗人PSME1、PSME2、CDK15 抗體及DAB 試劑盒購自北京ZSGB-BIO公司；RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、蛋白免疫印跡試劑盒購自美國Gibco公司；蛋白提取試劑盒購自北京諾博萊德公司；GAPDH引物購自美國CST公司；CCK-8試劑盒購自上海語純生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色 新鮮組織標本離體后，用中性福爾馬林浸泡，石蠟包埋后切成薄片。組織切片于60 ℃下烘烤1 h，用二甲苯進行脫蠟、梯度酒精水化處理，用檸檬酸鹽浸泡置于微波爐中加熱進行抗原修復。3％過氧化氫去離子水孵育，消除內源性過氧化物酶活性；滴加非免疫性動物血清室溫孵育；滴加PSME1、PSME2、CDK15抗體（1∶200），4 ℃過夜。次日洗滌后，滴加二抗，37 ℃孵育；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶孵育；濃縮型二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染，脫水，樹膠封片。用圖像分析（Image-Pro Plus，IPP）軟件分析圖像，對細胞染色強度和著色百分比共同評定量化。

1.3.2 細胞培養(yǎng)及細胞轉染 HEC-1B細胞用含10%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，F(xiàn)BS）、RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2、90%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液進行下一步實驗。將生長良好的細胞依照轉染試劑說明轉染細胞。將配置好的混合液Ⅰ（無酶水重懸siRNA干粉至濃度為100 μmol/L，加入基礎培養(yǎng)基稀釋siRNA濃度至20 μmol/L）和混合液Ⅱ（100 μL 基礎培養(yǎng)基+Lipo20002 μL）加在一起混合，輕輕搖勻，靜置；將6孔細胞培養(yǎng)基的細胞加入其中，并加入基礎培養(yǎng)基，使siRNA 的終濃度為100 nmol/L；轉染4～6 h，更換完全新鮮培養(yǎng)基。轉染24～48 h，收取細胞，用于其他細胞功能實驗。

1.3.3 實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測mRNA 水平 按照TRIzol說明書提取子宮內膜組織的總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書對提取的RNA 進行逆轉錄。以cDNA為模板，分別檢測PSME1/2、CDK15在癌旁正常細胞和EC組織中mRNA的表達水平。GAPDH為內參。引物序列PSME1上游5’-CCAGTGCCTGATCCAGTCAAG-3’，下游5’-ACCACGATCTTTTCATTGCAGT-3’；引物序列PSME2上游5’-GCAAGAGGACTCCCTCAATGT-3’，下游5’-CTTCTGGCTTAACCAGGGCA-3’；引物序列CDK15上游5’- TGGCCCAGTATATGTCTCAGC-3’，下游5’-GGCCCCGCAAAAGTTGAAAC-3’；基因內參上游5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。Real-time PCR反應體系包括：SYBR Premix12.5 μL、引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA模板0.5 μL和ddH2O 10 μL。Real-time PCR 反應條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)，再95 ℃ 10 s、65 ℃ 5 s、95 ℃ 5 s。目的基因結果用2-ΔΔCt表示。

1.3.4 Western blot檢測蛋白水平 根據(jù)蛋白提取試劑盒和BCA試劑盒說明書分別進行蛋白提取和蛋白濃度的測定。按照試劑比說明，配置分離膠、濃縮膠，按適當比例進行蛋白上樣、電泳，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上進行轉膜后，放入5%脫脂牛奶中封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日三羥甲基氨基甲烷緩沖液（trisbuffered saline with tween，TBST）洗膜后室溫下孵育二抗1 h，然后洗膜，用ECL試劑盒進行反應并拍攝。GAPDH為內參。

1.3.5 CCK8實驗檢測細胞的增殖活性 各組子宮內膜癌細胞培養(yǎng)36 h后，選取96孔板，每組均設置3個復孔，分別均勻的接種于96孔板中（6 000～9 000個/孔）。分別于每天的同一時間點（0 h、24 h、48 h和72 h）嚴格避光條件下對實驗組和對照組加入10% CCK-8試劑10 μL，孵育3 h，用儀器檢測每孔在波長450 nm下的吸光光度值（OD 值），來反映細胞增殖的活性。

1.3.6 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力 將使用無血清培養(yǎng)基重懸的細胞懸液200 μL 加入已鋪基質膠的24 孔transwell培養(yǎng)板上層小室中，向下層室中每孔加入完全培養(yǎng)基500 μL，孵箱中培養(yǎng)24～48 h。棄掉所有培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗培養(yǎng)板。下室每孔加入500 μL多聚甲醛，放入小室室溫固定30 min，棄去甲醛，PBS清洗后晾干。再次向下室中加入500 μL結晶紫溶液，放入小室染色30 min，棄去溶液，PBS清洗干凈，顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布方差齊性的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）來表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[Md（P25，P75）]表示，采用秩和檢驗，計數(shù)資料采用例和百分比表示，兩組比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 PSME1/2在EC組織中表達升高，CDK15表達下降

比較腫瘤組織與正常癌旁組織的表達情況，根據(jù)細胞染色強度和著色細胞百分比分為高表達組和低表達組。發(fā)現(xiàn)PSME1在98例EC患者腫瘤組織中高表達占85.7%（84/98），低表達占14.3%（14/98），癌旁正常組織不表達；PSME2在EC中高表達占51.0%（50/98），低表達占49.0%（48/98），癌旁正常組織不表達；CDK15在EC中高表達占36.7%（36/98），低表達占63.3%（62/98），癌旁正常組織呈高表達（圖1）。結果表明，在EC癌組織PMSE1/2高表達，CDK15低表達。

2.2 PSME1/2與CDK15表達呈負相關

以人正常子宮內膜細胞系hEEC細胞系為對照，比較人EC 細胞系HEC1B、HEC-251 及原代細胞中PMSE1/2 及CDK15在mRNA和蛋白表達水平。結果表明，與人正常子宮內膜細胞系相比，PMSE1/2 mRNA 水平在人EC 細胞系HEC1B及原代細胞中表達升高，在HEC-251細胞中表達量未見明顯差異，在CDK15 mRNA表達水平在4組內無明顯差異（圖2A）。PMSE1/2蛋白在人EC細胞系HEC1B及原代細胞中表達量升高，而CDK15蛋白的表達量下降（圖2B），提示PMSE1/2與CDK15的表達可能呈負相關關系，PMSE1/2作為一種蛋白酶體激活劑可能影響CDK15表達水平。

2.3 PSME1/2通過CDK15介導促進腫瘤細胞的增殖和侵襲

以高表達PSME1/2 的HEC1B 系使用siRNA 建立PSME1/2 敲低株以及PSME1/2 和CDK15 均敲低的雙敲低株，并通過WB實驗檢測蛋白表達效果（圖3A）。結果表明，與對照組相比，敲低PSME1/2 后，PSME1/2 表達下調，而CDK15 的蛋白表達水平增高。雙敲低株中PSME1/2 和CDK15的表達均下調，提示PSME1/2表達可能與CDK15呈現(xiàn)負相關，且PSME1/2在CDK15在轉錄后水平起負調節(jié)作用。

CCK8細胞增殖實驗和transwell實驗結果表明，與對照組相比，僅敲低PSME1/2的HEC1B細胞的增殖能力和侵襲能力均下降；而在同時敲低PSME1/2及CDK15的HEC1B細胞中，HEC1B細胞受到抑制的增殖和侵襲能力獲得了恢復（圖3B、3C）。這表明PSME1/2的上調通過抑制CDK15蛋白的表達增強了腫瘤細胞的增殖和侵襲能力。

2.4 PSME1/2與CDK15的表達在EC病例中有相關性

根據(jù)患者EC標本PSME1/2、CDK15免疫表達情況，分為高表達組和低表達組，分析PSME1/2、CDK15表達與子宮內膜惡性腫瘤預后的影響。PSME1/2高表達組與低表達組與患者臨床資料如年齡、術后診斷分型、分化程度、術后分期等差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）（表1）。CDK15低表達占PSME1高表達組的65.5%（55/84），占PSME2高表達組的46.0%（23/50），占PSME1/2高表達組的64.3%（63/91），占PSME1/2均高表達44.2%（19/43），提示PSME1和CDK15的表達呈負相關性（表2）。

2.5 PSME1/2、CDK15的表達與EC患者不良預后的關系

比較EC患者PSME1/2和CDK15表達情況對患者不良預后的影響（包括治療期間疾病進展、疾病復發(fā)或因疾病死亡），采用Kaplan Meier 方法和對數(shù)秩和檢驗，結果發(fā)現(xiàn)PSME1/2、CDK15的表達與EC患者的不良預后無明顯相關性（Pgt;0.05）（圖4）。

比較PSME1/2高表達的患者中，CDK15的表達情況對患者不良預后的影響，采用Kaplan Meier方法和對數(shù)秩和檢驗，結果發(fā)現(xiàn)PSME2高表達的患者中，CDK15低表達的患者不良預后的比例較高，但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），在PSME1高表達及PSME1/2均高表達的2組中，CDK15的表達對患者預后的影響差異也無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）（圖5）。

3 討論

EC作為女性婦科患者常見惡性腫瘤之一，起源于子宮內膜上皮細胞。近幾年來EC發(fā)病率逐漸升高，可能與缺乏早期篩查手段有關[13]。與組織的生物學標志物相比，基于血液的生物標志物獲取較為便捷，如CA-125，可以反映治療效果及提示患者復發(fā)[14-15]。但到目前為止，預測性的生物標志物尚未被識別[16]。在發(fā)展靶向治療方面，EC幾乎落后于每一種原發(fā)性癌癥類型。腫瘤發(fā)生發(fā)展的核心離不開細胞周期調控，作為細胞周期的關鍵調節(jié)因子，CDKs（細胞周期蛋白依賴性激酶）與癌癥發(fā)生密切相關。CDKs作為腫瘤治療靶點早已有很多相關的研究，CDKs作為癌基因不僅在細胞調控周期中發(fā)揮著重要作用，而且在轉錄過程中也有極其重要的作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，CDKs將成為乳腺癌和卵巢癌治療新的靶點[12]。而PSME基因在消化道惡性腫瘤（如胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌）、肺癌、甲狀腺惡性腫瘤和婦科惡性腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌）等多種腫瘤中均有表達，存在各種不同的通路促進腫瘤形成或抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[7]。在BC 中，李勝男等[12]實驗證明PSME1/2 有促腫瘤作用，而乳腺癌細胞中CDK15在蛋白水平和RNA 水平表達不一致，而干擾CDK15能夠增加乳腺癌細胞的侵襲和侵襲能力。與乳腺癌同為激素依賴性腫瘤的EC中，PSME1/2、CDK15提及甚少。

對98 例患者EC 標本的免疫組化結果分析PSME1/2、CDK15表達確實存在負相關性。而進一步的隨訪卻未發(fā)現(xiàn)PSME1/2及CDK15的表達水平與患者的不良預后具有相關性，可能存在以下幾種可能：①作為單中心樣本可能因樣本量過少而存在偏倚；②臨床分期早、中期患者占比較高；③患者隨訪時間較短，欠缺長期隨訪結果；④PSME1/2-CDK15途徑介導的對EC增殖和侵襲能力提高的途徑并非存在于所有類型的子宮內膜癌患者中，該影響可能僅存在于某一類患者中，而其中的分類依據(jù)仍需進一步的研究發(fā)現(xiàn)。課題組將繼續(xù)對患者進行隨訪，觀察PSME1/2、CDK15 的表達對患者長期預后的影響。

此外，有研究表明CDK15 具有抑癌基因的作用[12]。然而，本研究只證明PSME1/2在轉錄后水平對CDK15 的抑制作用，其具體的作用機制以及CDK15在EC發(fā)展的過程中是否起到抑制作用尚需進一步研究。有研究通過組織型蛋白酶體抑制劑和免疫型蛋白酶體抑制劑誘導乳腺癌細胞后檢測CDK15蛋白的表達[12]，證明乳腺癌中使用了免疫型蛋白酶體抑制劑后不僅能使乳腺癌的侵襲和轉移能力降低，同時CDK15 蛋白表達也增加了，詮釋CDK15抑制乳腺癌侵襲轉移的上游調控機制。證實該通路可能在多種癌種中發(fā)揮作用，具有作為泛癌種靶點的潛質。

本研究發(fā)現(xiàn)在EC患者標本中，CDK15的表達與PSME1/2呈負相關關系。進一步的實驗室研究發(fā)現(xiàn)，PSME1/2對CDK15的表達呈現(xiàn)負性調節(jié)，并通過實驗表明PSME1/2通過抑制CDK15的蛋白表達促進了EC細胞的增殖和侵襲。這提示PSME1/2具有促EC作用，可能在腫瘤形成、進展、復發(fā)和轉移過程中發(fā)揮重要的作用，PSME1/2作為新的腫瘤標志物及藥物靶點具有潛在的可行性。但仍需要更多的實驗來進一步探索PSME1/2、CDK15的相互影響過程以及在EC發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中的具體作用機制，為EC的早期篩查、診斷和治療提供新方向和途徑。