摘要：目的"探討乙酰"化STAT3對(duì)DIRAS2基"因表達(dá)的調(diào)控及其在三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）細(xì)胞增殖中的作用。方法"通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢、Western blotting和qRT-PCR分析TNBC組織和細(xì)胞中DIRAS2和乙?；疭TAT3的表達(dá)水平。選取TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231和SUM159，通過(guò)慢病毒或質(zhì)粒構(gòu)建DIRAS2過(guò)表達(dá)及STAT3野生或Lys685位點(diǎn)突變的細(xì)胞株。利用CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估DIRAS2和STAT3乙酰化對(duì)TNBC細(xì)胞增殖的影響。應(yīng)用Western blotting、焦磷酸測(cè)序、ChIP和IP技術(shù)研究乙?；疭TAT3對(duì)DIRAS2表達(dá)的調(diào)控作用及機(jī)制。結(jié)果"DIRAS2在TNBC組織和細(xì)胞中表達(dá)較低。焦磷酸測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，TNBC細(xì)胞中DIRAS2啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化水平升高，并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。此外，TNBC細(xì)胞中STAT3的乙?；潭仍黾樱鳧IRAS2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)隨著STAT3乙?；脑黾佣l(fā)生改變。ChIP和IP實(shí)驗(yàn)表明，乙?；疭TAT3可與DIRAS2啟動(dòng)子結(jié)合，而STAT3 Lys685位點(diǎn)突變會(huì)破壞STAT3與DNMT1的相互作用。結(jié)論"在TNBC中，乙酰化STAT3通過(guò)招募DNMT1誘導(dǎo)DIRAS2基因啟動(dòng)子甲基化，從而導(dǎo)致DIRAS2表達(dá)缺失和癌細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：三陰性乳腺癌（TNBC）；乙?；疭TAT3；DIRAS2；甲基化；增殖

中圖分類號(hào)：R737.9""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202405007

Acetylated STAT3-induced DIRAS2 deletion promotes the proliferation of

triple-negative breast cancer cells

ZHANG Lifen""1"，WANG Lu""1"，ZHAO Lin""1"，LUO Minna""2"，SHAO Shan""1"，GU Shanzhi""3

（1. Department of Oncology， The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong

University， Xi’an 710061; 2. Department of Hematology， The First Affiliated

Hospital of Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710061; 3. Department of Forensic

Medicine， Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710061，China）

ABSTRACT： Objective"To explore the regulation of DIRAS2 gene expression by acetylated STAT3 and its involvement in the proliferation of triple-negative breast cancer （TNBC） cells. Methods"The expression levels of DIRAS2 and acetylated STAT3 in TNBC tissues and cells were analyzed by database query， Western blotting， and qRT-PCR. TNBC cell lines MDA-MB-231 and SUM159 were selected， and lentivirus or plasmid was used to construct DIRAS2 overexpression and STAT3 wild or Lys685 mutation cell lines. The CCK-8 assay was used to evaluate the effect of DIRAS2 and STAT3 acetylation on the proliferation of TNBC cells. Western blotting， pyrosequencing， ChIP and IP were employed to investigate the regulatory effect and mechanism of acetylated STAT3 on DIRAS2 expression. Results"The expression of DIRAS2 was decreased in TNBC tissues and cells. Pyrosequencing analysis found that the methylation level of CpG islands in the DIRAS2 promoter was increased in TNBC cells compared with normal breast epithelial cells， which promoted the growth of cancer cells. Furthermore， TNBC cells showed an increase in STAT3 acetylation， which was accompanied by a shift in the methylation status of the DIRAS2 promoter. ChIP and IP experiments showed that acetylated STAT3 could bind to the DIRAS2 promoter， and the STAT3 Lys685 mutation disrupted the interaction between STAT3 and DNMT1. Conclusion"Acetylated STAT3 induces DIRAS2 promoter methylation by recruiting DNMT1， leading to loss of DIRAS2 expression and cancer cell proliferation in TNBC.

KEY WORDS： triple-negative breast cancer （TNBC）; Ac-STAT3; DIRAS2; methylation; proliferation

乳腺癌已經(jīng)超過(guò)肺癌成為全球女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤""［1］"。在我國(guó)，乳腺癌位列癌癥相關(guān)死亡原因的前五位，女性乳腺癌的死亡率逐年增長(zhǎng)""［2］"。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一種亞型，缺乏激素受體和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2的表達(dá)。TNBC具有高度惡性、易于局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、對(duì)內(nèi)分泌和靶向治療不敏感等特性""［3］"。未經(jīng)治療的晚期TNBC患者的總生存期僅約6個(gè)月""［4］"。因此，研究TNBC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以確定有效的治療靶點(diǎn)，有助于制定全面的治療方案，從而改善TNBC患者的生存及預(yù)后。

GTP結(jié)合RAS樣蛋白（DIRAS）家族的成員在卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等癌癥類型中，可能作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。DIRAS蛋白表達(dá)的丟失或減少對(duì)于這些腫瘤的進(jìn)展具有關(guān)鍵性影響""［5］"。DIRAS2作為該家族中的一個(gè)功能基因，在腫瘤領(lǐng)域的研究尚屬匱乏，且在不同類型腫瘤中的作用各異。在腎癌中，DIRAS2通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶途徑促進(jìn)腎細(xì)胞癌的形成""［6］"。而YING等""［7］"研究發(fā)現(xiàn)，DIRAS2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低，與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。DIRAS2能夠阻斷活化B細(xì)胞信號(hào)通路的核因子κ輕鏈增強(qiáng)子，誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。然而，DIRAS2在乳腺癌中的致癌或抑癌作用及其相關(guān)機(jī)制仍待研究。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一種眾所周知的轉(zhuǎn)錄激活因子，其功能調(diào)節(jié)中的磷酸化修飾一直以來(lái)都是研究的核心焦點(diǎn)。然而，研究發(fā)現(xiàn)STAT3還能夠被乙酰化甚至抑制基因表達(dá)"nbsp;［8］"。該項(xiàng)研究在黑色素瘤和TNBC組織中均觀察到STAT3的賴氨酸乙酰化水平升高。值得注意的是，TNBC中乙酰化STAT3的降低可能導(dǎo)致雌激素受體-α基因的去甲基化和再激活，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)抗雌激素治療敏感。然而，STAT3乙酰化在TNBC進(jìn)展中的作用和具體機(jī)制仍不明了。因此，本研究的目的是探究DIRAS2及其啟動(dòng)子甲基化在TNBC細(xì)胞增殖中的作用。同時(shí)，本研究還探討了乙?；疭TAT3在調(diào)節(jié)DIRAS2表達(dá)及其甲基化中的潛在作用機(jī)制，以期為TNBC的治療靶點(diǎn)提供新的思路。

1"材料與方法

1.1"細(xì)胞株與主要試劑

人TNBC細(xì)胞系（MDA-MB-231、SUM159和BT549）和正常乳腺上皮細(xì)胞系（MCF-10A）均購(gòu)自武漢普諾賽生物有限公司。胎牛血清來(lái)源于以色列BI公司，L-15培養(yǎng)基由江蘇凱基公司提供，RPMI-1640和DMEM/F12培養(yǎng)基來(lái)自于美國(guó)HyClone公司。人DIRAS2抗體、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1［DNA （cytosine-5-）-methyltransferase 1，DNMT1］抗體和STAT3抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物公司，人Ac-STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)Immunoway公司，人p-STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。人GAPDH抗體、蛋白A/"G-Plus瓊"脂糖均源自美國(guó)Santa Cruz公司。白藜蘆醇和曲古抑素購(gòu)自上海陶術(shù)生物有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative Realtime PCR，qRT-PCR）試劑盒均購(gòu)自Takara公司。GAPDH和DIRAS2引物由北京鼎國(guó)生物有限公司合成。

1.2"細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于L15培養(yǎng)基，BT549培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，SUM159和MCF-10A培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基，這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加"100 mL/L胎"牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素。所有細(xì)胞均在37℃和50 mL/L CO"2"的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3"質(zhì)粒/慢病毒感染細(xì)胞

對(duì)于TNBC（MDA-MB-231和SUM159）細(xì)胞，使用來(lái)自Hanbio（中國(guó)上海）的DIRAS2過(guò)表達(dá)慢病毒，MOI為10。質(zhì)粒hSTAT3-pcDNA3.1-HA、hSTAT3-pcDNA3.1-HA K685R、hSTAT3-pcDNA"3.1-Flag和"空載體由百奧普公司（中國(guó)西安）構(gòu)建，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。使用Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)72 h后，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.4"qRT-PCR檢測(cè)

按照RNAfast 200試劑盒（Fastagen，中國(guó)上海）的說(shuō)明書(shū)，提取細(xì)胞總RNA。使用PrimeScript RT試劑試劑盒（Takara，中國(guó)大連）將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在此基礎(chǔ)上，采用SYBR Green PCR Premix Ex Taq""TM"試劑盒（Takara）進(jìn)行qRT-PCR，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定量檢測(cè)。表1列出了qRT-PCR所使用的特異性引物。

1.5"Western blotting和免疫共沉淀

使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液（Solarbio，中國(guó)北京）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，將裂解液混合物在4 ℃下以12 000 g的速度離心15 min，提取蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Beyotime，中國(guó)上海）檢測(cè)所提取的蛋白濃度。在Western blotting實(shí)驗(yàn)中，變性蛋白（每個(gè)泳道20～30 μg）通過(guò)100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜完成后將其在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h。然后用適當(dāng)稀釋的一抗孵育過(guò)夜。第2天，使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗孵育1 h。最后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)可視化蛋白質(zhì)條帶。對(duì)于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，先用與上述相同的裂解程序處理細(xì)胞。在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，將等量的蛋白質(zhì)樣品與蛋白A/G瓊脂糖珠（Santa Cruz，美國(guó)）和一抗或?qū)φ彰庖咔虻鞍祝↖gG）混合過(guò)夜孵育。在徹底清洗后，采用"Western""blotting法檢測(cè)沉淀物。

1.6"CCK-8實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、離心后計(jì)數(shù)。按照每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種入96孔板中，每個(gè)分組設(shè)有5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，分別取出一塊96孔板，在避光條件下，向含細(xì)胞的孔內(nèi)加"10 μL的CCK-8試"劑，混合均勻后放回培養(yǎng)箱中進(jìn)行1～4 h的恒溫反應(yīng)。將96孔板取出，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度。

1.7"染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）

使用超聲處理分別轉(zhuǎn)染了野生型和突變型STAT3的MDA-MB-231細(xì)胞的染色質(zhì)樣本，將其分解為平均DNA長(zhǎng)度在200～500 bp之間。將樣品與抗STAT3的一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。加入蛋白A/G瓊脂糖珠來(lái)分離免疫復(fù)合物。在清洗和去除珠子后，通過(guò)加熱到65 ℃進(jìn)行4 h的交聯(lián)。洗脫DNA，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)免疫沉淀染色質(zhì)的DNA。

1.8"生物信息學(xué)分析DIRAS2的表達(dá)

利用GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cnHYPERLINK\"http：//gepia.cancer-pku.cn\"）網(wǎng)站分析DIRAS2在不同腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況。該網(wǎng)站是基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤和正常樣本的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行在線分析。數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了患者的年齡、性別、種族、腫瘤分期、分級(jí)、基因表達(dá)、臨床終點(diǎn)等基線資料。

1.9"統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0和Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"±s"）表示。對(duì)于連續(xù)變量，采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。多組間均數(shù)差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2"結(jié)""果

2.1"DIRAS2在乳腺癌中低表達(dá)

通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析DIRAS2在多種腫瘤組織中的表達(dá)差異（圖1A）。DIRAS2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）和低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤（LGG）組織中的表達(dá)水平低于正常組織，而在腎透明細(xì)胞癌（KIRC）組織中則表達(dá)升高。通過(guò)對(duì)比1 085例乳腺癌組織和291例正常乳腺組織的DIRAS2表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)DIRAS2在乳腺癌組織中的表達(dá)量低于正常乳腺組織（圖1B）。

采用Western blotting檢測(cè)不同細(xì)胞中DIRAS2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231、SUM159和BT549中DIRAS2的表達(dá)量明顯低于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A（圖2A）。同樣，TNBC細(xì)胞中的DIRAS2 mRNA水平顯著降低（"圖2B"）。綜上所述，DIRAS2在TNBC中呈現(xiàn)低表達(dá)"特征。

2.2"DIRAS2啟動(dòng)子甲基化與其表達(dá)和腫瘤增殖"有關(guān)

采用慢病毒構(gòu)建DIRAS2過(guò)表達(dá)及其陰性對(duì)照細(xì)胞系。選取TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231和SUM159，通過(guò)qRT-PCR和Western blotting驗(yàn)證了DIRAS2在兩種細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)效果（圖3A、3B）。接下來(lái)，將轉(zhuǎn)染成功的兩組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并采用CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估DIRAS2過(guò)表達(dá)對(duì)"TNBC細(xì)"胞增殖能力的影響。在MDA-MB-231和SUM159細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DIRAS2后，其A值相較于對(duì)照組明顯降低，且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001，圖3C）。這些結(jié)果表明，DIRAS2的表達(dá)上調(diào)可顯著降低TNBC細(xì)胞的增殖能力，從而發(fā)揮抑癌作用。

既往研究表明，啟動(dòng)子甲基化在抑癌基因的失活中起著至關(guān)重要的作用""［9］"。因此，本研究檢測(cè)了DIRAS2的甲基化狀態(tài)。正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中DIRAS2的CpG島甲基化比例明顯低于MDA-MB-231和SUM159細(xì)胞（圖3D），說(shuō)明TNBC細(xì)胞中CpG島部分甲基化或高甲基化。結(jié)合之前發(fā)現(xiàn)的TNBC細(xì)胞中DIRAS2 mRNA水平遠(yuǎn)低于MCF-10A的結(jié)果，提示啟動(dòng)子高甲基化可能抑制了DIRAS2的轉(zhuǎn)錄。

2.3"STAT3乙?；瘜?duì)腫瘤增殖和DIRAS2基因啟動(dòng)子甲基化的影響

乙?；腟TAT3在腫瘤抑制基因啟動(dòng)子的甲基化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，但其潛在的機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討乙酰化STAT3在DIRAS2基因CpG島甲基化中可能的作用和機(jī)制。鑒于DIRAS2基因啟動(dòng)子在MDA-MB-231細(xì)胞系中的甲基化程度較高，因此，本研究選擇該細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究。首先，通過(guò)Western blotting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，TNBC細(xì)胞中STAT3乙?；@著升高（圖4A）。為了研究STAT3乙酰化是否影響腫瘤細(xì)胞增殖及DIRAS2基因啟動(dòng)子甲基化，在MDA-MB-231細(xì)胞中過(guò)表達(dá)STAT3突變體（K685R），將STAT3的Lys685轉(zhuǎn)化為精氨酸。突變體細(xì)胞構(gòu)建成功：使用STAT3抗體免疫沉淀后進(jìn)行

Western blotting檢測(cè)，證實(shí)Lys685突變導(dǎo)致乙?；疭TAT3（Ac-STAT3）的表達(dá)明顯降低，而對(duì)STAT3磷酸化幾乎無(wú)影響（圖4B）。表達(dá)STAT3 K685R突變體的MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力顯著低于表達(dá)野生型STAT3的對(duì)照組細(xì)胞"（圖4C）"。這些結(jié)果表明，STAT3乙?；軌虼龠M(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

K685R突變體細(xì)胞中DIRAS2啟動(dòng)子甲基化水平下降。然而，組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑曲古抑素（TSA）可以抑制STAT3去乙酰化，導(dǎo)致CpG島甲基化增加（圖5A）。qRT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了STAT3 K685R突變體的MDA-MB-231細(xì)胞中DIRAS2在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著增加（圖5B），表明DIRAS2的重新激活與STAT3乙?；降慕档陀嘘P(guān)。綜上所述，乙?；腟TAT3加速了DIRAS2啟動(dòng)子的甲基化，并在調(diào)控DIRAS2的表達(dá)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

2.4"STAT3乙?；赟TAT3-DNMT1相互作用及募集至基因啟動(dòng)子的作用

STAT3能夠與多種關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子、其他轉(zhuǎn)錄因子、輔助激活因子和輔助抑制因子等發(fā)生相互作用，進(jìn)而重編程轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在CD8""+"T細(xì)胞和KAI3 NK細(xì)胞中，STAT3與DNMT1和HDAC1的相互作用調(diào)控DNA甲基化""［10］"。本研究評(píng)估了STAT3 K685R突變是否對(duì)STAT3與DNMT1的相互作用以及抑癌基因DIRAS2啟動(dòng)子的結(jié)合產(chǎn)生影響，分別在MDA-MB-231親本（野生型）細(xì)胞和其內(nèi)源性Lys685突變的變異體（K685R）中進(jìn)行了ChIP實(shí)驗(yàn)，利用腫瘤條件培養(yǎng)基（TCM）激活STAT3，從而檢測(cè)STAT3-DNMT1與啟動(dòng)子的結(jié)合。STAT3與DIRAS2的啟動(dòng)子發(fā)生結(jié)合，然而，這種結(jié)合在STAT3 K685R突變體中受到破壞（圖6A），這說(shuō)明STAT3乙?；瘜?duì)STAT3與DIRAS2啟動(dòng)子的結(jié)合具有調(diào)節(jié)作用。采用抗STAT3抗體進(jìn)行免疫沉淀分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染野生型STAT3的MDA-MB-231細(xì)胞中，STAT3與"DNMT1能"夠相互結(jié)合，然而，在STAT3 K685R突變體細(xì)胞中這種結(jié)合被破壞（圖6B）。進(jìn)一步用HDAC抑制劑TSA處理細(xì)胞后，STAT3乙?；癝TAT3- DNMT1的"結(jié)合均增加（圖6C）。相反，用去乙酰酶激活劑白藜蘆醇（Resveratrol）處理TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231則導(dǎo)致乙酰化STAT3和免疫共沉淀"DNMT1的"減少（圖6D）。這些結(jié)果表明，STAT3乙?；閷?dǎo)STAT3與DNMT1的相互作用，并參與DIRAS2啟動(dòng)子的DNA甲基化。

3"討""論

DIRAS家族蛋白的生物學(xué)功能豐富且錯(cuò)綜復(fù)雜。它們可以與其他蛋白質(zhì)如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、轉(zhuǎn)錄因子以及與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移調(diào)控相關(guān)的因子和酶等相互作用。據(jù)研究報(bào)道，DIRAS1能夠與SmgGDS相互作用，激活多種致癌GTPases的活性，并在乳腺癌和GBM中抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性""［11］"。DIRAS3也被證明在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、腦癌和甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)。DIRAS3的再表達(dá)通過(guò)多種信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)，阻止血管生成""［12］"。盡管眾多研究證實(shí)DIRAS家族在抑制腫瘤方面的作用，但其在有些腫瘤類型中也可以作為腫瘤激活劑。RAO等""［6］"發(fā)現(xiàn)，DIRAS2作為一種致癌基因，在KIRC中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然而，在結(jié)直腸癌、卵巢癌和皮膚黑色素瘤中，DIRAS2則作為腫瘤抑制因子發(fā)揮功能""［14］"。本研究通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤組織和正常組織中，DIRAS2的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且在乳腺腫瘤組織中表達(dá)較低。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)。此外，DIRAS2表達(dá)的降低與TNBC細(xì)胞的增殖具有相關(guān)性。綜上，這些研究結(jié)果揭示了DIRAS2在TNBC中具有抑癌作用。

本研究深入探討了啟動(dòng)子甲基化在調(diào)控DIRAS2表達(dá)中的潛在功能。研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，DIRAS2啟動(dòng)子在癌細(xì)胞中呈現(xiàn)部分或高度甲基化。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)高甲基化抑制了TNBC細(xì)胞中DIRAS2啟動(dòng)子的活性，并導(dǎo)致DIRAS2的表達(dá)降低。DNA甲基化以一種類似開(kāi)關(guān)的方式發(fā)揮作用，與基因表達(dá)缺失和低水平的額外激活的表觀遺傳標(biāo)記密切相關(guān)。雖然DNA甲基化在基因沉默中的明確作用已經(jīng)被廣泛研究，但啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)被修飾的確切機(jī)制仍不清楚。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合有助于招募染色質(zhì)修飾機(jī)制，該機(jī)制負(fù)責(zé)DNA的修飾和表達(dá)""［15］"。既往研究證明了STAT3乙酰化時(shí)會(huì)增加CpG島的甲基化""［8］"。本研究探討了STAT3乙酰化是否與甲基化誘導(dǎo)的DIRAS2沉默有關(guān)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了乙?；腟TAT3與DIRAS2啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，并招募DNMT1來(lái)抑制DIRAS2的表達(dá)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇特異性抑制STAT3乙酰化后，可逆轉(zhuǎn)DIRAS2的失活和抑制癌細(xì)胞的增殖。HDAC的激活或乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制可能有望消除甲基化誘導(dǎo)的腫瘤抑制沉默，未來(lái)需要進(jìn)一步闡明Ac-STAT3的修飾機(jī)制。

通常認(rèn)為，蛋白質(zhì)乙?；峭ㄟ^(guò)對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整來(lái)實(shí)現(xiàn)活性基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵翻譯后修飾。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)STAT3發(fā)生乙?；揎棔r(shí)，能抑制DIRAS2基因的表達(dá)，并增強(qiáng)DIRAS2啟動(dòng)子的DNA甲基化程度。通過(guò)使用突變體轉(zhuǎn)染來(lái)抑制STAT3乙酰化，可以逆轉(zhuǎn)TNBC細(xì)胞中腫瘤抑制基因DIRAS2啟動(dòng)子的異常甲基化。反之，若采用曲古抑素抑制去乙?；瑒tDIRAS2啟動(dòng)子甲基化水平會(huì)上升。之前的研究已經(jīng)證實(shí)，HDAC抑制劑能夠引發(fā)關(guān)鍵致癌轉(zhuǎn)錄因子如STAT3""［16］"和NF-κB""［17］"的高乙?；@進(jìn)一步增強(qiáng)了它們的致癌活性，推動(dòng)腫瘤的進(jìn)展。因此，特異性抑制STAT3乙酰化可能會(huì)提高HDAC抑制劑在抗癌治療中的效果。此外，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在包括TNBC在內(nèi)的癌癥治療中展示出巨大的潛力""［18-19］"。

本研究探討了TNBC中乙?；疭TAT3對(duì)DIRAS2基因表達(dá)的調(diào)控及細(xì)胞增殖的影響。雖然仍需深入探討乙?；疭TAT3如何調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子的CpG島甲基化，但本研究證實(shí)了靶向致癌轉(zhuǎn)錄因子的乙?；瘜?duì)抑癌基因CpG島甲基化的影響，從而為TNBC的治療提供了新思路。

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（編輯"陳"波）