摘要：目的"探究SARS-CoV-2靶向親環(huán)素A（CypA）/細胞外金屬蛋白酶誘導劑（CD147）受體途徑誘導心肌細胞凋亡的可能機制。方法"構建pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag重組載體質粒轉染H9c2細胞，TUNEL實驗、流式細胞術和DNA ladder分析細胞凋亡，免疫共沉淀（CoIP）驗證CD147與SARS-CoV-2 S蛋白之間相互作用，Western blotting法檢測細胞凋亡信號通路相關蛋白表達。結果"與對照組比較，TUNEL實驗和流式細胞術結果顯示轉染組細胞凋亡顯著增加（Plt;0.05），DNA ladder分析發(fā)現(xiàn)DNA降解明顯。Western blotting法檢測顯示Caspase12、DR3表達顯著升高（Plt;0.001），F(xiàn)AS表達升高（Plt;0.01），TRF1、DR4表達降低（Plt;0.01）。結論"SARS-CoV-2 S蛋白靶向CypA/CD147受體入侵宿主細胞，激活內(nèi)質網(wǎng)通路（Caspase12）和死亡受體通路（DR3、FAS），以內(nèi)源性和外源性凋亡途徑誘導心肌細胞凋亡。

關鍵詞：新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）；新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）；親環(huán)素A（CypA）/細胞外金屬蛋白酶誘導劑（CD147）；心肌細胞；信號通路；凋亡

中圖分類號：R373""""文獻標志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202405006

SARS-CoV-2 induces cardiomyocyte apoptosis by targeting

the CypA/CD147 receptor pathway

MA Mingren，MA Ling，LIU Yan，WANG Fei

（Department of Cardiology， the 940th Hospital of Joint Logistics Support

Force of Chinese PLA， Lanzhou 730050， China）

ABSTRACT： Objective"To explore the possible mechanism of apoptosis induced by SARS-CoV-2 targeting cyclophilin A （CypA）/CD147 receptor pathway. Methods"The pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag recombinant plasmid was constructed and transfected into H9C2 cells. Apoptosis was analyzed by TUNEL assay， flow cytometry and DNA ladder. The interaction between CD147 and SARS-CoV-2 S protein was verified by CoIP. The expressions of apoptosis-related proteins were detected by Western blotting. Results"Compared with the control group， TUNEL assay and flow cytometry showed that apoptosis was significantly increased in transfection group （"Plt;0.05"）， and DNA ladder analysis showed that DNA degradation was obvious. The expression levels of Caspase12 and DR3 were significantly increased （Plt;0.001）， the expression level of FAS was slightly increased （Plt;0.01）， while the expression levels of TRF1 and DR4 were decreased （Plt;0.01）. Conclusion"SARS-CoV-2 S protein targets CypA/CD147 receptor to invade host cells， activate endoplasmic network pathway （Caspase12） and death receptor pathway （DR3， FAS）， and induce apoptosis of cardiomyocytes through endogenous and exogenous apoptotic pathways.

KEY WORDS： severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS-CoV-2）; coronavirus disease 2019 （COVID-19）; cyclophilin A （CypA）/CD147; cardiomyocyte; signaling pathway; apoptosis

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）暴發(fā)至今，已對全球公共衛(wèi)生構成前所未有的嚴重挑戰(zhàn)""［1］"。雖然當前疫情傳播得到有效遏制，然而COVID-19相關并發(fā)癥以及“長新冠綜合征”給健康帶來的負面效應仍不容忽視""［2］"。SARS-CoV-2首先侵犯呼吸系統(tǒng)，進而累及心血管系統(tǒng)引發(fā)心肌損傷、心律失常、心肌炎等心血管疾?。╟ardiovascular diseases， CVD）""［3-4］"。而對于CVD患者而言感染SARS-CoV-2會加重病情致使病死率激增""［5］"。SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike，S）通過結合細胞表面關鍵受體血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2， ACE2）以內(nèi)吞方式入侵宿主細胞""［6］"。盡管有些器官幾乎不表達ACE2，但所有人體組織中都發(fā)現(xiàn)有SARS-CoV-2的存在，單細胞測序數(shù)據(jù)也表明SARS-CoV-2 RNA存在于不表達ACE2的各種免疫細胞中，由此可見SARS-CoV-2入侵宿主細胞可能存在其他受體或共受體途徑""［7-8］"。親環(huán)素A（cyclophilin A，CypA）屬于細胞內(nèi)伴侶蛋白，具有促進病毒感染的功能，主要分布于內(nèi)皮細胞（"endothelial""cells，ECs）、血管平滑肌細胞、心肌成纖維細胞等多種類型的細胞""［9］"。細胞外基質金屬蛋白酶（CD147）是CypA的主要細胞表面受體，在CypA介導的信號傳導中發(fā)揮重要作用""［10］"，大量研究表明CypA/CD147信號通路參與了CVD發(fā)生、發(fā)展過程""［11-12］"。WANG等""［13］"和BEHL等""［14］"的研究發(fā)現(xiàn)，CD147通過胞吞作用介導SARS-CoV-2進入宿主細胞新途徑，且CD147促進SARS-CoV-2觸發(fā)的進行性肺纖維化""［15］"，CD147的缺失或通過Meplazumab 阻斷CD147可有效抑制SARS-CoV-2復制，并緩解肺纖維化進展""［16］"。CypA的受體CD147在心肌細胞和周細胞（pericytes，PCs）中都有表達""［17］"，在急性COVID-19患者中S蛋白從SARS-CoV-2顆粒中分離，經(jīng)呼吸系統(tǒng)釋放進入血液循環(huán)抵達機體各個器官，S蛋白與心臟PCs表面受體CD147相互作用觸發(fā)ERK1/2信號通路引發(fā)PCs功能障礙""［18］"，SARS-CoV-2 S蛋白可能不依賴于病毒感染而直接對PCs造成損傷""［19］"。上述證據(jù)表明，SARS-CoV-2、CypA/CD147、心肌細胞之間密切相關，然而SARS-CoV-2以何種受體途徑入侵心肌細胞以及是否會誘發(fā)凋亡的研究卻鮮有報道?；诖?，本研究擬構建SARS-CoV-2 S蛋白載體，以H9c2細胞為研究模型，通過檢測SARS-CoV-2 S蛋白與CD147親和力以及相互作用、H9c2細胞凋亡率、凋亡信號通路關鍵調(diào)控蛋白表達變化，探究SARS-CoV-2靶向CypA/CD147受體途徑誘導心肌細胞凋亡機制，旨在為COVID-19并發(fā)CVD的診療提供新靶點。

1"材料與方法

1.1"SARS-CoV-2 S蛋白載體的構建

從GenBank獲得SARS-CoV-2 S全基因序列后，經(jīng)過堿基優(yōu)化加上融合標簽序列后合成pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag載體。將SARS-CoV-2 S蛋白與不同融合標簽載體分別連接構建重組質粒，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a并挑選單菌落擴大培養(yǎng)，用質粒小提試劑盒提取構建好的重組載體質粒，成功連接的陽性菌液送生物公司測序鑒定（江蘇賽索菲生物技術有限公司）。

1.2"細胞培養(yǎng)和轉染

H9c2細胞（中國科學院上海細胞庫：http：//www.cellbank.org.cn/）培養(yǎng)于添加100 g/L胎牛血清（Gibco，USA）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素（武漢普諾賽生命科技有限公司）雙抗和20 "g/L L-谷氨酰胺的DMEM（Hyclone）培養(yǎng)基中，在37 ℃和50 mL/L CO"2"條件下孵育。選取對數(shù)生長期"H9c2細"胞，以"0.25％""Trypsin消化，用含100 g/L胎牛血清（"Gibco"，USA）的DMEM培養(yǎng)基將H9c2細胞制成密度為3×10""5 "個/mL單細胞懸液接種于6孔板培養(yǎng)。培養(yǎng)"24 h后"細胞生長至約80％融合時進行轉染。通過Lipofectamine2000（Thermo Fisher，USA）將pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag（2 μg/孔）重組載體質粒轉染入H9c2細胞，同時將空白質粒（negative control， NC）轉染H9c2細胞作為陰性對照，轉染"48 h后"用于以下實驗。

1.3"TUNEL實驗

PBS洗滌轉染細胞，40 g/L多聚甲醛固定"30 min"后收集細胞懸液用PBS洗滌3次，丙酮脫水、二甲苯透明，常規(guī)制作石蠟切片。按照TUNEL試劑盒（杭州凱基生物股份有限公司）說明書進行標記染色。每組隨機選取6張切片，每張切片選取6個清晰視野（×100）取均值，應用Image J軟件計算細胞凋亡率。

1.4"流式細胞術檢測

胰蛋白酶（Gibco，USA）消化轉染細胞，1 000 r/min離心5 min收集細胞，棄上清用預冷PBS洗滌細胞2次，加入1×Binding Buffer重懸細胞，使細胞濃度為1×10""6"個/mL，吸取100 μL細胞懸液至離心管中，加入5 μL FITC-AnnexinV和5 μL PI，輕混勻后室溫（25 ℃）避光孵育15～20 min，之后每管加入400 μL 1×Binding Buffer用流式細胞儀（BD Biosciences，USA）上機檢測，并通過FlowJo，v.10.5.3分析H9c2細胞凋亡比率（Q2+Q4）。

1.5"DNA ladder分析

以PBS為陰性對照，取轉染細胞（2×10""6"個/mL）按選擇性凋亡DNA ladder抽提試劑盒（Thermo Fisher）說明書操作抽提DNA，DNA產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，應用Gel 1000凝膠成像儀觀察DNA片段。

1.6"免疫共沉淀（CoIP）

4 ℃ 800 r/min離心3 min后收集轉染細胞。棄上清并用預冷的PBS洗滌細胞2次，完全去除PBS并保留細胞沉淀，用勻漿器勻漿30～50次，每次間隔1 min，重復3次；之后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清液作為細胞裂解液，加預冷RIPA裂解液，冰上靜置裂解15 min；4 ℃ 14 000 r/min離心"15 min"；取30 μL細胞裂解液作為陽性對照，取少量細胞裂解液以備后續(xù)Western blotting分析，轉移其余上清至新的離心管；加沉淀抗體至上清液中，4 ℃緩慢搖動過夜；加入Protein A瓊脂糖珠，4 ℃緩慢搖動過夜；14 000 r/min離心5s后收集沉淀物，用預冷PBS洗滌3次，2×上樣緩沖液重懸沉淀物，煮沸變性5 min；anti-flag（Abcam，USA）和anti-CD147（Abcam，USA）抗體蛋白印跡檢測。

1.7"Western blotting法檢測凋亡信號通路相關蛋白表達

將1.6項中的細胞裂解液采用BCA（上海碧云天生物）法進行蛋白定量并制樣。SDS-PAGE分離蛋白，后轉移至PVDF膜，洗膜液清洗3次（5 min/次），"50 g/L脫"脂牛乳封閉特異性抗原2 h，分別加入一抗TRF1、DR3、DR4、DR5、FAS、Caspase12、Noxa、Bim、GAPDH，4 ℃孵育過夜。次日洗膜液洗膜3次（5 min/次）后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，加入ECL化學發(fā)光液曝光顯影，使用"Image J軟"件分析條帶灰度。

1.8"統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并制圖。兩組間差異比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2"結""果

2.1"SARS-CoV-2促進H9c2細胞凋亡

在48 h轉染高峰期采用TUNEL染色、流式細胞術和DNA ladder分析細胞凋亡變化，驗證pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag重組載體質粒對H9c2細胞凋亡的影響。實驗結果表明：與NC組相比，TUNEL染色（圖1A）和流式細胞術（圖1B、1C）均表明轉染組細胞凋亡顯著增加（P＜0.05），其中以晚期細胞凋亡為主。DNA ladder分析顯示，與NC組相比轉染組DNA降解明顯，提示凋亡增加（圖1D）。上述結果證實，pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag重組載體質粒促進H9c2細胞凋亡。

2.2"SARS-CoV-2 S蛋白與CD147之間的相互作用

為了驗證CD147是否參與SARS-CoV-2入侵宿主細胞過程，通過CoIP實驗檢測SARS-CoV-2 S蛋白和CD147相互作用。結果顯示，在H9c2細胞轉染pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag重組載體質粒48 h后，H9c2細胞表面受體CD147與SARS-CoV-2 S蛋白之間存在相互作用（圖2）。CoIP實驗檢測結果證實了兩者之間的互作關系可能是介導SARS-CoV-2入侵H9c2細胞的信號通路。

2.3"SARS-CoV-2 S蛋白靶向CypA/CD147信號通路誘導凋亡信號通路相關蛋白表達

Western blotting實驗結果顯示，與NC組比較，pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag重組載體質粒轉染組細胞凋亡信號通路相關蛋白Caspase12、DR3表達顯著升高（Plt;0.001），F(xiàn)AS表達升高（Plt;"0.01"），TRF1、DR4表達降低（Plt;0.01，圖3）。

3"討""論

COVID-19可能已被遺忘，但它并未消失""［20］"，尤其是從感染期的病理改變轉移到治愈后的“長新冠綜合征”對機體造成的慢性損傷更是值得持續(xù)關注""［21］"。SARS-CoV-2可突破呼吸系統(tǒng)屏障進入心肺循環(huán)對心血管系統(tǒng)造成不同程度的損傷""［22］"。尸檢結果顯示，SARS-CoV-2感染心肌細胞最常見的慢性病理改變是心肌細胞凋亡、肥大和纖維化""［23］"。SARS-CoV-2直接入侵心肌細胞破壞了心肌細胞收縮力、引發(fā)電生理異常、并打破腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的平衡，導致心肌損傷及細胞凋亡""［24］"。

SARS-CoV-2入侵宿主細胞主要是通過受體介導的膜融合途徑， SARS-CoV-2 S蛋白可以與靶細胞表面ACE2、CD147、酪氨酸蛋白激酶受體UFO（tyrosine-protein kinase receptor UFO，AXL）、葡糖糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、去唾液酸糖蛋白受體1（asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1）、KREMEN1等受體結合，在宿主多種蛋白酶的輔助下完成病毒和細胞的膜融合""［25］"，其中ACE2是SARS-CoV-2侵入宿主細胞的主要受體""［26］"。ACE2屬于腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）的重要組成部分，經(jīng)典的RAS ACE-Ang Ⅱ-AT1R調(diào)控軸和ACE2-Ang 1-7-MasR反調(diào)控軸在維持機體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用""［27］"，SARS-CoV-2入侵宿主細胞后顯著下調(diào)ACE2受體，ACE2的缺失會激活RAS導致炎癥反應和血栓形成""［28］"。以ACE2為靶點研發(fā)的病毒載體或"mRNA疫"苗可能與血小板減少癥和心肌炎等并發(fā)癥相關，這引起了全球對COVID-19疫苗安全性的擔憂""［29］"。此外，ACE2受體抗體能夠顯著抑制SARS-CoV-2蛋白的表達、復制和細胞死亡，但人誘導多能干細胞衍生的心肌細胞（human "induced""pluripotent stem cell-derived "cardiomyocytes"，hiPSC-CMs）仍然易受SARS-CoV-2感染，表明SARS-CoV-2存在內(nèi)化的潛在替代機制""［30］"。將ACE2作為SARS-CoV-2唯一受體途徑不足以解釋COVID-19對多器官組織嗜性、嚴重的并發(fā)癥以及“長新冠綜合征”對機體的長期影響。推測SARS-CoV-2在不同類型細胞中通過多受體途徑入侵宿主細胞，不同受體之間存在協(xié)同或拮抗作用，且SARS-CoV-2與受體結合力有強弱之分、主次之別。

CD147屬于免疫蛋白超家族的一種跨膜糖蛋白，可以作為信號受體與親環(huán)素相互作用，介導細胞外CypA的信號和趨化活性""［31］"，已證實CypA/CD147相互作用可以成為抗炎治療的新靶點，并且在心臟重塑中發(fā)揮重要作用""［32］"。COVID-19疫情暴發(fā)后，陳志南院士團隊通過對SARS-CoV-2與CD147系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2靶向CD147入侵宿主細胞，并且促進進行性肺纖維化""［13，15］"。本課題組前期已通過文獻綜述論證了循環(huán)中SARS-CoV-2 S蛋白通過靶向心臟周細胞及心肌細胞表面CypA/CD147受體，引發(fā)炎癥反應和細胞損傷""［17］"，然而SARS-CoV-2通過CypA/CD147受體途徑入侵心肌細胞是否會誘導細胞凋亡，以及凋亡機制仍未"闡明。

HUANG等""［33］"在hiPSC-CMs中證實SARS-CoV-2感染導致心肌細胞凋亡和細胞周期停滯，內(nèi)在促凋亡基因BAD、BAX和BBC3的表達在感染后顯著增加，靶向ACE2的降壓藥可以減輕SARS-CoV-2感染心肌細胞的炎癥反應和凋亡。本研究構建pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag重組載體質粒感染H9c2細胞，TUNEL染色、流式細胞術檢測和DNA ladder分析結果均表明SARS-CoV-2 S蛋白與細胞表面受體結合誘導H9c2細胞凋亡，并且以晚期細胞凋亡為主。這與上述研究結果相符，但SARS-CoV-2 S入侵H9c2細胞受體途徑尚不明確。

CoIP實驗結果證實在H9c2細胞轉染pEncmv-SARS-CoV-2 S-3xflag重組載體質粒48 h后，H9c2細胞表面受體CD147與SARS-CoV-2 S蛋白之間存在相互作用，CypA/CD147是SARS-CoV-2入侵"H9c2細"胞受體途徑之一。在人源化CD147轉基因小鼠模型中，WU等""［15］"通過表面等離子共振成像（surface plasmon resonance imaging， SPR）實驗發(fā)現(xiàn)，CD147與 SARS-CoV-2 S蛋白受體結合區(qū)域（receptor binding domain，RBD）相互作用。與本研究不同的是該研究證實CD147 促進SARS-CoV-2誘導的肺纖維化。

線粒體通路、內(nèi)質網(wǎng)通路和死亡受體通路是細胞凋亡的3條經(jīng)典信號傳導通路，在凋亡發(fā)生過程中通路之間相互聯(lián)系，共同參與調(diào)節(jié)細胞凋亡""［34］"。本研究通過檢測細胞凋亡信號傳導通路相關蛋白（TRF1、DR3、DR4、DR5、FAS、Caspase12、Noxa、Bim）表達，驗證SARS-CoV-2 S蛋白靶向CypA/CD147受體途徑誘導H9c2細胞凋亡信號通路，Western blotting結果表明Caspase12、DR3表達顯著升高（Plt;0.001），F(xiàn)AS表達升高（"Plt;0.01"）。Caspase12位于內(nèi)質網(wǎng)膜，是內(nèi)質網(wǎng)應激（endocytoplasmic reticulum stress，ERS）誘導凋亡所必須的，并且Caspase12僅在ERS通路中被活化，ERS誘導Caspase12表達同時也導致胞質的Caspase 7轉移到內(nèi)質網(wǎng)表面，Caspase 7激活Caspase12，Caspase12可進一步剪切Caspase 3引發(fā)細胞凋亡""［35］"。在"hiPSC-CMs中SARS-CoV-2 S衣"殼蛋白免疫染色表明，S蛋白染色定位于核周區(qū)域靠近內(nèi)質網(wǎng)""［26］"，這種核周病毒成分的分布不僅在其他冠狀病毒感染相關研究中有所報道，而且在感染柯薩奇病毒B3（"coxsackievirus""B3，CVB3）的hiPSC-CMs也有類似發(fā)現(xiàn)""［36］"。因此，Caspase12表達顯著升高表明SARS-CoV-2 S通過CypA/CD147受體途徑激活了內(nèi)質網(wǎng)通路。死亡受體是一類跨膜糖蛋白，胞外死亡信號通過DR3、DR4、DR5和FAS等死亡受體完成跨膜傳導，DR3、FAS和對應的配體Apo3L、FasL結合，通過TRADD、FADD和Caspase 8誘導細胞凋亡""［37］"。DR3、FAS不同程度的升高表明SARS-CoV-2 S通過CypA/CD147受體不僅激活了內(nèi)質網(wǎng)通路而且激活死亡受體通路。由此可見，SARS-CoV-2 S蛋白靶向CypA/CD147受體途徑通過內(nèi)源性和外源性途徑誘導心肌細胞凋亡。

本研究尚存在一定局限性。首先，心肌細胞系僅選用H9c2細胞，若能增加例如AC16、HL-1、hiPSC-CMs等細胞系的驗證可能更有助于機制的探討。其次，本研究中SARS-CoV-2 S蛋白和CD147的相互作用通過CoIP實驗驗證，然而兩者之間的互作存在多元性，僅憑CoIP實驗并不能完全闡明它們之間的互作關系。再次，雖然CypA/CD147信號通路參與CVD發(fā)生、發(fā)展過程已有大量研究證據(jù)佐證，但CD147并非CypA唯一受體，將CypA/CD147認定為SARS-CoV-2入侵心肌細胞受體途徑過于牽強，有待后續(xù)更深入地研究甄別。

總之，本研究揭示了SARS-CoV-2靶向CypA/CD147受體途徑誘導心肌細胞凋亡的可能機制（"圖4"）。一方面，SARS-CoV-2 S蛋白靶向CypA/CD147受體入侵宿主細胞，啟動ERS反應激活Caspase12，通過Caspase 3引發(fā)內(nèi)源性細胞凋亡。另一方面，體液中游離的SARS-CoV-2 S蛋白激活心肌細胞表面DR3、FAS死亡受體，誘導心肌細胞外源性細胞凋亡。本研究結果佐證了SARS-CoV-2入侵宿主細胞的多樣性和誘發(fā)細胞凋亡的復雜性，同時為COVID-19并發(fā)心肌損傷、心肌炎以及長新冠對心血管系統(tǒng)危害的診療提供了有希望的靶點。

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（編輯"陳"波）