摘要：目的"探討迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）對結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC） SW480細(xì)胞惡性行為的影響及機制。 方法"通過收集2019年1月至2020年12月在如皋市人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的初診未經(jīng)治療的CRC患者的腫瘤組織以及正常人的結(jié)腸組織，用免疫組化和Western blotting方法檢測β-catenin的表達，分析與臨床分期、預(yù)后和免疫浸潤的關(guān)系。CCK-8檢測10、15、20 μmol/L的RA對SW480細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況；Transwell和劃痕實驗分別檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力變化；Western blotting檢測凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及Wnt/β-catenin通路的相關(guān)蛋白表達情況。CRC SW480細(xì)胞系懸液皮下接種制作移植瘤小鼠模型，150 mL/kg RA溶液灌胃，觀察RA對移植瘤生長的影響，ELISA檢測了血清炎癥因子變化。 結(jié)果"正常結(jié)腸組織中"β-catenin的"表達很低，而CRC組織中β-catenin的表達明顯增高。在CRC患者β-catenin高表達組中，腫瘤大于5 cm的患者數(shù)顯著高于低表達組，而患者總生存期卻顯著小于低表達組（Plt;0.05）。各濃度RA組細(xì)胞增殖顯著抑制，且呈濃度依賴性降低（Plt;0.05）。移植瘤小鼠模型中，RA處理組凋亡蛋白Bax和Bad表達較對照組顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著減少（Plt;0.05）。同時可見SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著被抑制（"Plt;0.05"），"E-cadherin蛋"白表達顯著增加，Snail、N-cadherin和Vimentin表達顯著減少（Plt;0.05），而且Axin和GSK-3β表達增加，"β-catenin表"達減少（Plt;0.05）。結(jié)論"RA可能通過干預(yù)Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)的EMT抑制SW480的生物學(xué)活性。

關(guān)鍵詞：迷迭香酸 （RA）；結(jié)直腸癌（CRC）；Wnt/β-catenin通路；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）

中圖分類號：R735.3""""文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202405005

Inhibition of EMT in colorectal cancer by rosemarinic acid

explored based on the Wnt/β-catenin pathway

ZHOU Feng""1"， SHA Desheng""1"， LU Yuanyuan""2"， CHEN Wei""3

（1. Department of General Surgery， People’s Hospital of Rugao， Rugao 226500; 2. Department of

Gastroenterology， Xijing Hospital of Digestive Diseases， Air Force Medical University， Xi’an 710032;

3. Department of Medical Oncology， People’s Hospital of Rugao， Rugao 226500， China）

ABSTRACT： Objective"To investigate the role and action mechanism of rosemarinic acid （RA） on the malignant behavior of colorectal cancer （CRC） SW480 cells. Methods"We collected tumor tissues from patients with primary untreated CRC who underwent surgery in People’s Hospital of Rugao from January 2019 to December 2020， as well as colon tissues from normal individuals. The expression of β-catenin was detected by immunohistochemistry and Western blotting to analyze its relationship with the clinical stage， prognosis， and immune infiltration. CCK-8 was used to detect the effects of 10， 15 and 20 μmol/L of RA on the proliferation of SW480 cells; flow cytometry detected apoptosis; Transwell and scratch assay detected changes in the invasion and migration ability of the cells， respectively. Western blotting detected the expressions of proteins related to "apoptosis， epithelial-mesenchymal transition （EMT）， and Wnt/β-catenin pathway. A mouse model of CRC transplant tumor was established， and the effect of RA on the growth of transplant tumor was investigated by gavage administration. The levels of inflammatory factors were detected by ELISA. Results"The expression of β-catenin was low in normal colon tissues and significantly higher in CRC tissues. In the CRC patients with high expression of β-catenin， the number of patients with tumors larger than 5 cm was significantly higher than that in the low expression group， whereas the overall survival of the patients was significantly smaller than that in the low expression group （"Plt;0.05"）. Cell proliferation was significantly inhibited and decreased in a concentration-dependent manner in the RA group at all concentrations （Plt;0.05）. In animal experiments， the expression of apoptotic proteins Bax and Bad was significantly increased and the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly decreased in the "RA-treated""group compared with the control group （Plt;0.05）. It was also found that the invasive and migratory ability of SW480 cells was significantly inhibited （Plt;0.05）， the expression of E-cadherin protein was significantly increased， the expression of Snail， N-cadherin and Vimentin was significantly reduced （"Plt;0.05"）， the expression of Axin and GSK-3β was increased， and the expression of β-catenin was reduced （"Plt;0.05"）. Conclusion"RA may inhibit the biological activity of SW480 by interfering with Wnt/β-catenin pathway-mediated EMT.

KEY WORDS： rosemarinic acid （RA）; colorectal cancer （CRC）; Wnt/β-catenin pathway; epithelial-mesenchymal transition （EMT）

全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）的發(fā)病率和死亡率分別居癌癥的第3位和第2位，每年癌癥患者中有10%診斷為CRC。CRC由結(jié)腸和直腸上皮細(xì)胞的惡性病變發(fā)展而來，主要經(jīng)歷了4個階段：啟動、促進、發(fā)展和轉(zhuǎn)移""［1］"。4個階段中的遺傳成分改變和信號通路異常是CRC發(fā)生的先決條件，信號通路間異常進一步促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移也是CRC造成死亡的主要原因""［2］"。癌細(xì)胞通過淋巴系統(tǒng)和血液跨組織傳播，其強大的傳播能力為CRC的復(fù)發(fā)提供了基礎(chǔ)""［3］"。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是一個動態(tài)且可逆的過程，上皮細(xì)胞在此過程中經(jīng)歷多種變化，最終獲得間充質(zhì)細(xì)胞的表型，使細(xì)胞具備了遷移、侵襲、在遠(yuǎn)端組織定植和抗凋亡的能力，這對于CRC的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要""［4］"。EMT的特點是E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達減少和波形蛋白（Vimentin）表達增加，這與直腸癌細(xì)胞的凋亡抗性、侵襲性增加和患者的不良預(yù)后相關(guān)""［5］"。具體來說，由于Vimentin在間充質(zhì)細(xì)胞而不是上皮細(xì)胞中表達，Vimentin表達上調(diào)則表明EMT已經(jīng)發(fā)生。先前的研究證明，EMT受Wnt和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）信號通路的調(diào)節(jié)。Wnt結(jié)合卷曲蛋白受體后，磷酸化蛋白抑制糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3β），阻止β-catenin的降解。β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)積累，與細(xì)胞因子作用，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。這導(dǎo)致癌細(xì)胞EMT，增加腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移""［6］"。通過抑制Wnt/β-catenin通路能減少癌細(xì)胞的EMT而發(fā)揮抗癌效果""［7］"。RNA-seq檢測發(fā)現(xiàn)CRC中表達差異基因在體外促進CRC細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，改變CRC細(xì)胞C5aR1的表達加速了EMT過程，并且改變了Wnt/β-catenin通路中關(guān)鍵蛋白的表達""［8］"。

由于化療的臨床效果常常因副作用而降低，用新藥替代腫瘤疾病的治療是必要的。目前已證明一些植物來源的天然物質(zhì)可成功預(yù)防和治療多種腫瘤。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）是一種草本植物迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）的提取物，已發(fā)現(xiàn)其具有抗感染、抗炎和抗癌功能""［9］"。RA通過激活程序性死亡、抑制磷酸化或改變細(xì)胞周期等方式導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS，顯著降低了結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率""［10-11］"。而RA在CRC中的抗癌具體機制并不明確，因此本研究探究RA對CRC發(fā)展的影響以及相關(guān)作用"機制。

1"材料與方法

1.1"主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、DMSO（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒、Snail抗體、Vimentin抗體、N-cadherin抗體、E- cadherin抗"體、GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的二抗、蛋白Marker、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；β-catenin抗體（Santa Cruz Biotechnology）；ECL試劑、PVDF膜（Millipore）。RA（成都至純本草生物科技有限公司），RA使用DMSO溶解制成100、150、200 μmol/L溶液""［12-13］"；Wnt通路激活劑BML-284（北京百奧萊博科技有限公司）；體質(zhì)量20～25 g的SPF級BALB/c雄性小鼠（北京維通利華）。

1.2"臨床樣本收集

收集10例CRC患者手術(shù)切除的腫瘤組織，所有患者標(biāo)本均為2019年1月至2020年12月在如皋市人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的初診未經(jīng)治療的CRC患者，年齡40～70歲，男女比例為1∶1。對患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、總生存期和無病生存期等信息進行統(tǒng)計，將患者進行臨床分期（Ⅰ-Ⅲ）。對照組的結(jié)腸組織取自通過結(jié)腸鏡檢查確認(rèn)為無病變的正常黏膜組織，以確保與CRC患者的組織樣本具有可比性。本研究由如皋市人民醫(yī)院倫理委員會審查并批準(zhǔn)，所有患者都已經(jīng)簽署知情同意書。所有樣本一部分組織用100 mL/L中性緩沖甲醛固定，常規(guī)制作4 μm厚石蠟切片；其余樣本于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆脵z測。

1.3"免疫組化檢測

免疫組化采用ABC法進行。臨床組織樣本石蠟切片經(jīng)脫蠟、水洗、過氧化氫處理，在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中微波加熱15 min進行抗原修復(fù)、牛血清封閉后，分別用β-catenin（1∶200，Santa Cruz Biotechnology）和PD-L1（1∶100，Abcam）的兔多克隆抗體，4 ℃孵育過夜后用生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗（"1∶500"，ZSGB-BIO）孵育1 h，用ABC試劑（Vector Laboratories）孵育30 min，用DAB顯色，蘇木精染色劑進行復(fù)染，隨后封片，在顯微鏡下觀察。

切片由兩名病理學(xué)家進行盲法評分，采用積分法進行。β-catenin的陽性表達為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的棕色顆粒，PD-L1的陽性表達為細(xì)胞膜的棕色顆粒。"β-catenin和PD-L1的"評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無陽性細(xì)胞；1分，lt;10%陽性細(xì)胞；2分，10%～50%陽性細(xì)胞；3分，gt;50%陽性細(xì)胞。兩名病理學(xué)家的平均值作為最終評分。

1.4"細(xì)胞培養(yǎng)與分組

CRC細(xì)胞系SW480購自武漢普諾賽生命科技有限公司。CRC細(xì)胞系SW480于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，50 mL/L CO"2"培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞每2～3天傳代1次，當(dāng)細(xì)胞匯合度達到70%～80%時進行傳代。RA組用10、15、"20 μmol/L的RA溶"液處理48 h，Wnt激活組用Wnt通路激活劑BML-284處理。

1.5"Western blotting檢測

取臨床組織樣本及培養(yǎng)細(xì)胞分別用含蛋白酶抑制劑的RIPA液（Beyotime）裂解，提取相應(yīng)總蛋白，BCA法測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉，再用抗體β-catenin、Snail、Vimentin、E-cadherin、Axin、GSK-3β、GAPDH（1∶1 000）及N-cadherin（1∶500）4 ℃孵育過夜。用HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗（1∶5 000，"ZSGB-BIO"）孵育1 h，ECL試劑顯色，Gel Doc XR+系統(tǒng)（Bio-Rad）拍照。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，GAPDH為內(nèi)參歸一化。

1.6"CCK-8檢測各組培養(yǎng)SW480細(xì)胞的增殖活性

將對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞用胰酶消化，1×10""5"個細(xì)胞接種至96孔板中，加入0、50、100、150、200 μmol/L的RA，分別在培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后加入CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h后酶標(biāo)儀450 nm波長下測吸光值（A"450"），繪制曲線計算RA的半數(shù)抑制濃度（IC"50"）。

1.7"流式細(xì)胞術(shù)檢測各組SW480的細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔2×10""5"，加入PBS重懸細(xì)胞，400 μL×binding buffer緩沖液中加入4 μL Annexin V-FITC，避光孵育15 min，加入4 μL PI輕輕混勻，避光孵育5 min；流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.8"Transwell和劃痕實驗檢測各組SW480細(xì)胞侵襲能力和遷移能力

胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗滌2次，24孔板加800 μL含200 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，Transwell小室加200 μL細(xì)胞懸液，37 ℃、50 mL/L CO"2"孵育18 h。PBS洗滌Transwell小室2次，40 g/L多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌2次，顯微鏡下觀察。

對數(shù)生長期細(xì)胞接種至6孔板，恒溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿視野，使用20 μL槍頭在6孔板上垂直劃痕。沖洗懸浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基恒溫箱孵育，24 h（D"24 h"）后顯微鏡觀察，計算遷移率。

1.9"CRC移植構(gòu)建小鼠腫瘤模型及給藥處理

小鼠接種部位皮膚消毒，取0.2 mL密度為4×10""7 "/mL SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞系懸液接種于小鼠右腋窩下，室溫、濕度55%～60%條件下飼養(yǎng)小鼠4周。造模4周后，對照組小鼠灌胃給予150 mL/kg生理鹽水，RA組灌胃給予150 mL/kg RA溶液，每天2次，連續(xù)2周；Wnt激活組從造模開始的第4周起，每天灌胃給予BML-284溶液（5 mg/kg），連續(xù)2周，以激活Wnt/β-catenin通路。實驗結(jié)束后將小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死，取出移植瘤，用電子天平測重，將移植瘤部分腫瘤組織液氮保存用于HE染色及相關(guān)蛋白表達檢測及免疫組織化學(xué)染色（按1.3和1.5項進行）。

1.10"ELISA檢測IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ等炎癥因子的水平

各組培養(yǎng)細(xì)胞取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，各組小鼠取血清，隨后按照相應(yīng)的ELISA試劑盒（均購自Ramp;D Systems公司）說明書操作進行檢測。

1.11"數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

用SPSS 25.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用Graphpad 8.0軟件進行圖片處理。計量資料采用Shapiro-Wilk（S-W）進行正態(tài)性假設(shè)檢驗，符合正態(tài)的計量資料以±s表示，采用t檢驗進行組間比較；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位距）表示，采用Mann-Whitney U檢驗進行組間比較。計數(shù)資料以n（%）表示，采用卡方檢驗。多組間比較采用單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2"結(jié)""果

2.1"臨床樣本中β-catenin的表達情況

免疫組化結(jié)果顯示，正常結(jié)腸組織中β-catenin的表達均較低；而CRC患者腫瘤組織中β-catenin的表達較高；Western blotting結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致（圖1），顯示腫瘤組織中β-catenin的蛋白表達顯著高于正常結(jié)腸組織。β-catenin高表達組患者的腫瘤分化程度較低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，TNM分期較高，總生存期和無病生存期較短（表1）。β-catenin的高表達組患者的腫瘤大小和總生存期與低表達組患者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.2"RA抑制了SW480細(xì)胞的增殖并促進其凋亡

用0、50、100、150、200 μmol/L的RA處理細(xì)胞，RA濃度越高細(xì)胞活性越低，即對SW480的抑制作用具有濃度依賴性（Plt;0.05，圖2A）；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率同樣隨RA濃度增加而增加（Plt;0.05，圖2B），故選擇150 μmol/L的RA進行后續(xù)實驗。進一步Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白Bax和Bad表達顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著減少（Plt;0.05，圖2C）。

2.3"RA可抑制CRC細(xì)胞的EMT進程

Transwell和劃痕實驗結(jié)果顯示，RA處理組SW480細(xì)胞侵襲能力和遷移率顯著低于對照組（"Plt;0.05"）；Western blotting檢測EMT相關(guān)蛋白表達的結(jié)果顯示，RA處理組E-cadherin表達顯著上調(diào)，N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表達顯著下調(diào)（Plt;0.05，圖3）。提示RA處理通過干擾SW480的EMT進程抑制其惡性行為。

2.4"RA通過Wnt/β-catenin通路影響EMT

進一步探究RA抑制SW480 EMT進程的分子機制，應(yīng)用Western blotting檢測Wnt通路蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA處理使SW480細(xì)胞的Axin和GSK-3β表達顯著上調(diào)，相應(yīng)β-catenin表達降低（"Plt;0.05"，圖4A），提示RA抑制SW480細(xì)胞的Wnt通路。進一步在RA處理的同時使用Wnt/β-catenin 激活劑BML-284干預(yù)，Wnt/β-catenin激活組細(xì)胞增殖能力、存活率、侵襲和遷移能力顯著恢復(fù)，高于RA處理組（Plt;0.05，圖4B-4F）；而Western blotting檢測Wnt/β-catenin通路和EMT進程的重要蛋白，Wnt/β-catenin激活組中Axin、GSK-3β和"E-cadherin"蛋白的表達顯著低于對照組和RA處理組，但β-catenin、N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表達顯著上調(diào)（Plt;0.05，圖4A、4B）。以上結(jié)果證明RA通過干預(yù)Wnt/β-catenin通路抑制SW480細(xì)胞的EMT進程。

2.5"RA抑制CRC移植瘤生長情況

同一時點的RA給藥組小鼠體質(zhì)量顯著低于對照組（Plt;0.05），Wnt激活組的小鼠在第14天、第21天和第28天體質(zhì)量顯著高于RA給藥組小鼠（Plt;"0.05"，圖5A）。RA給藥組的移植瘤組織Ki67陽性率顯著低于對照組（Plt;0.05，圖5B）；與RA給藥組相比，Wnt激活組中移植瘤組織中Ki67陽性率有所上升。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)移植瘤組織中"E-cadherin蛋"白表達顯著上調(diào)，而N-cadherin、"Vimentin"、Snail蛋白表達明顯減少（Plt;0.05）；與RA給藥組相比，Wnt激活組中Axin和GSK-3β蛋白表達降低，而β-catenin表達增加（Plt;0.05）；同時，RA給藥組Axin和GSK-3β蛋白表達顯著增加，但"β-catenin表"達顯著減少（Plt;0.05，圖5C、5D）。上述結(jié)果證明RA通過抑制EMT和Wnt通路減緩體內(nèi)移植瘤生長。

3"討""論

CRC是世界范圍內(nèi)的一個重大公共衛(wèi)生問題，其診斷技術(shù)和治療方法在過去30年中取得了重大進步。然而，晚期癌癥的持續(xù)發(fā)展、治療抵抗性的出現(xiàn)以及癌癥的復(fù)發(fā)，仍舊是當(dāng)前CRC治療中最為緊迫的問題""［14］"。手術(shù)和化療是目前CRC的主要治療選擇。雖然手術(shù)切除對于早期CRC患者取得了很好療效，但對于晚期CRC患者，尤其是T4期CRC患者，手術(shù)無法完全切除病灶，因此復(fù)發(fā)率較高，手術(shù)后化療通常包括晚期CRC的輔助治療。然而，耐藥性的出現(xiàn)限制了其療效，因此探索新型有效的CRC靶向治療方法受到高度重視""［15］"。本研究通過免疫組化和Western blotting等方法檢測了CRC患者臨床樣本中β-catenin表達，發(fā)現(xiàn)正常結(jié)腸組織中β-catenin的表達很低，而腫瘤組織中β-catenin的表達明顯增高。因此，β-catenin可能是CRC的重要生物標(biāo)志物，也可能是潛在的治療靶點。

近年來，天然藥草中具有高效、低成本和低毒性等優(yōu)點的化合物在抑制疾病發(fā)展的研究中備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，某些膳食補充劑、草本植物和茶類產(chǎn)品具有預(yù)防及治療腫瘤的潛力，而且，某些食物或植物來源的天然成分已被認(rèn)為是有前景的抗癌藥物和化療敏感化劑""［16］"。RA是一種常見于唇形科植物中的黃酮類化合物，因其營養(yǎng)特性而被用于改善健康狀態(tài)，并被認(rèn)為具有有效的抗氧化活性""［17］"。大量證據(jù)表明RA對癌細(xì)胞具有抗增殖和促凋亡作用，在小鼠DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌實驗中，RA通過降低TLR4/NF-κB/STAT3通路的活性，有效緩解了由DSS引發(fā)的結(jié)腸癌相關(guān)炎癥，并降低了抗凋亡因子的表達""［18］"。RA和抗MUC1抗體結(jié)合增強了促凋亡蛋白Bax和Bad的表達，同時減少抗凋亡標(biāo)記物Bcl-2的mRNA表達""［19］"。本研究也顯示RA處理使CRC細(xì)胞凋亡率增高，促凋亡蛋白Bax和Bad增多，抗凋亡蛋白Bcl-2減少。

癌細(xì)胞EMT進程是一個高度保守的程序，近年來EMT被認(rèn)為是多種癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟，EMT使癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，其移動性和侵襲性明顯增加。TGF-β、Wnt/β-catenin和Notch等多種信號通路介導(dǎo)上皮標(biāo)記物E-cadherin的減少以及間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin和Vimentin表達的增加""［20］"。Snail是一種轉(zhuǎn)錄因子，其主要作用是下調(diào)上皮標(biāo)志物和上調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物在中胚層和神經(jīng)嵴發(fā)育過程中調(diào)節(jié)EMT，直接與E-cadherin啟動子相互作用""［21］"。癌癥細(xì)胞中的Wnt/β-catenin通路通常異常激活，與多種類型腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Wnt通路的β-catenin的穩(wěn)定性至關(guān)重要，由Axin和GSK-3β復(fù)合物控制，而復(fù)合物的降解釋放β-catenin并發(fā)生核轉(zhuǎn)移以提高細(xì)胞增殖能力""［22］"。本研究發(fā)現(xiàn)CRC細(xì)胞的N-cadherin、Vimentin和Snail的表達增加，證明CRC細(xì)胞通過EMT獲得更強的遷移和侵襲能力，而RA的應(yīng)用顯著抑制了這些細(xì)胞的惡性特性。進一步的通路研究證明RA通過抑制Wnt/"β-catenin減"緩了CRC細(xì)胞EMT進程。

綜上所述，RA抑制CRC細(xì)胞系SW480的惡性行為，可能是參與Wnt/β-catenin通路活性的調(diào)節(jié)，進而誘導(dǎo)CRC細(xì)胞的凋亡。本研究在一定程度上為CRC的藥物研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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（編輯"國"榮）