王邦娟 陳楊 黃璐璐 劉理慧 劉振利 程古月

摘要：隨著廣譜高效喹諾酮類藥物的過度應用，革蘭陰性菌對喹諾酮類藥物的耐藥率逐年上升，已嚴重威脅到人類健康。革蘭陰性菌對喹諾酮類藥物的抗性是通過耐藥基因突變或者獲得外源抗性基因?qū)崿F(xiàn)的。耐藥性的維持通常會對細菌造成一定的適應性代價，表現(xiàn)為細菌生長速率、毒性和傳播的減弱，但耐藥菌可通過補償突變緩解適應性代價，甚至增強耐藥菌適應性，嚴重阻遏臨床療效。而且耐藥菌株的適應性增強，導致細菌即使在缺乏抗菌劑使用的條件下，其耐藥率也增加，導致無法通過減少抗菌劑的使用減弱菌株耐藥率。所以本文分別對革蘭陰性菌的染色體和PMQR基因介導的耐喹諾酮藥物的機制對其適應性變化的影響進行綜述，并對耐藥菌適應性的研究方法進行總結(jié)，以期為耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的新型治療方案、相關的腸道致病菌抑制劑的開發(fā)和未來與之相關的研究提供一定參考。

關鍵詞：革蘭陰性菌；喹諾酮；耐藥性；適應性；適應性代價；補償突變；適應性測量

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Study on the adaptability of quinolone-resistant Gram-negative bacteria

Wang Bangjuan1， Chen Yang1， Huang Lulu1， Liu Lihui1， Liu Zhenli1，2， and Cheng Guyue1，2

（1 MOA Laboratory for Risk Assessment of Quality and Safety of Livestock and Poultry Products Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070; 2 National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residues （HZAU） and MOA Key Laboratory for the Detection of Veterinary Drug Residues in Foods， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

Abstract ? ?With the excessive use of broad-spectrum high-efficiency quinolones， the resistance rate of gram-negative bacteria to quinolones has been increasing year by year， which has seriously threatened human health. Resistance to quinolones in gram-negative bacteria is achieved through mutations in resistance genes or acquisition of exogenous resistance genes. The maintenance of drug resistance usually causes a certain adaptive cost to bacteria， manifested as weakening of bacterial growth rate， toxicity and transmission， but drug-resistant bacteria can alleviate the adaptive cost by compensating mutations， and even enhance the adaptability of drug-resistant bacteria， seriously dampening the clinical effect. Moreover， the adaptability of resistant strains is enhanced， resulting in an increase in the resistance rate of bacteria even in the absence of antimicrobial use， resulting in the inability to attenuate the resistance rate of strains by reducing the use of antimicrobials. Therefore， in this paper， the effects of chromosome of gram-negative bacteria and PMQR gene-mediated mechanism of quinolone-resistant drugs on their adaptive changes are reviewed， and the research methods of adaptability of drug-resistant bacteria are summarized in order to provide some reference for new treatment regimens of quinolone-resistant Gram-negative bacteria， the development of related enteropathogen inhibitors and future related research.

Key words ? ?Gram-negative bacteria; Quinolone; Drug resistance; Adaptability; Adaptive cost; Compensatory mutation; Adaptability measurement

喹諾酮類（氟喹諾酮類）藥物因其抗菌譜廣、活性強、安全性高、價格低廉等優(yōu)點，被廣泛用于革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和支原體感染的預防和治療[1-3]。

喹諾酮類藥物通過抑制gyrA和gyrB編碼的DNA回旋酶和/或parC、parE編碼的DNA拓撲異構酶Ⅳ的活性，阻礙DNA合成來實現(xiàn)抑制細菌的生長[4]。

然而，隨著臨床使用喹諾酮類藥物次數(shù)和劑量的增加，革蘭陰性菌對其耐藥率逐年上升。其中耐氟喹諾酮類藥物的沙門菌已被WHO劃分為急需開發(fā)新型抗生素的重點耐藥菌之一[5-7]。細菌耐喹諾酮類藥物的現(xiàn)象是多因素的結(jié)果，主要有：①染色體突變：藥物作用靶位的改變、細胞膜通透性的改變和主動外排系統(tǒng)的過度表達；②質(zhì)粒介導喹諾酮類藥物耐藥（plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR），其中qnr、aac（6'）-Ib-cr、qepA和oqxAB為主要的PMQR基因[8]。

細菌的適應性與藥物的選擇壓力都會影響細菌耐藥性的流行與傳播[9]。細菌的適應性（fitness）一般指細菌在無抗生素的選擇壓力下，通過調(diào)節(jié)自身代謝來適應不同環(huán)境的能力[10]。而耐藥菌適應性的變化已證明存在以下幾種情況：①耐藥菌產(chǎn)適應性代價。即在無抗生素壓力下與敏感菌株相比，發(fā)生耐藥突變或者獲得外源基因的細菌自身適應性降低，表現(xiàn)為耐藥菌的傳播速度、毒力和競爭能力減弱，最終不敵敏感菌而被消滅。適應性代價也被認為是限制細菌耐藥性傳播的主要障礙，在一定程度上決定耐藥菌能否在宿主體內(nèi)或體外環(huán)境中長久存在[11]。

②耐藥菌適應性增強。一方面是因耐藥菌的補償性進化，細菌為了改善自身適應性代價所發(fā)生的適應性突變，促進其與敏感菌株競爭。具體表現(xiàn)是產(chǎn)適應性代價的耐藥菌在長期進化過程中，通過耐藥基因的突變累積來緩解其適應性，促進耐藥菌的進化而嚴重阻遏臨床療效[10，12]。另一方面是在腸桿菌科細菌進化的無數(shù)年歷史中，雖然大多數(shù)耐藥突變的出現(xiàn)均會對菌體產(chǎn)生或大或小的適應性代價，但還是存有無適應性代價和適應性增加的耐藥突變現(xiàn)象[12]。

耐藥菌株的適應性增強，導致細菌即使在缺乏抗菌劑使用的條件下，其耐藥率也增加，所以在特定條件下，通過減少抗菌劑的使用也無法達到減弱細菌耐藥率的目的。但有學者針對細菌的適應性降低可減弱耐藥菌的傳播速度和毒力，提出利用此機制有望逆轉(zhuǎn)細菌的耐藥性[13]。所以對耐藥菌適應性的研究不僅有助于更全面地理解細菌耐藥機制和流行性，還可促進人們探索并建立有效的方法來預測和控制耐藥菌的流行[10]。革蘭陰性菌耐喹諾酮藥物日益嚴峻，本文主要從兩方面進行綜述：分析革蘭陰性菌耐喹諾酮藥物的不同機制對其適應性變化的影響和總結(jié)耐藥菌適應性的研究方法，以期了解革蘭陰性菌在不同耐藥機制下的適應情況，為指導臨床合理用藥和幫助設計新型耐藥抑制劑提出有針對性的解決思路與方法，從而達到有效控制我國耐藥菌的目的。

1 染色體介導的喹諾酮耐藥機制對細菌適應性的影響

1.1 靶基因突變對耐藥菌適應性的影響

染色體介導細菌耐喹諾酮類藥物，是因細菌喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（plasmid-mediated quinolone resistance，QRDR）的主要和次要靶點（gyrA、gyrB、parC和parE）會發(fā)生至少一個氨基酸替換，引起喹諾酮類藥物對酶-DNA復合物親和力[14]降低而減弱藥效（圖1， B）。而適應性作為影響耐藥菌進化的因素[15]，已發(fā)現(xiàn)耐藥菌的染色體突變會影響其適應性和耐藥性[16]，且不同突變位點會對菌株適應性產(chǎn)生不同影響[17]。

具體來說可提高菌株適應性的染色體突變有（表1）：耐FQ的淋病奈瑟菌株中gyrA91/95（S91F和D95N）突變[18]；大腸埃希菌中gyrA A119E突變[16]；腸炎沙門菌中gyrA（D87N、D87G、D87A、S83Y、S83F）和/

或parC（S80I）存在1～3個突變時[19]可顯著增加細菌適應性。降低菌株適應性的染色體突變有（表1）：肺炎克雷伯菌中gyrB S431P、parC S80I突變[15]、淋病奈瑟菌株parC86（D86N）突變[18]、大腸埃希菌中的gyrB F458V和/或A468P和/或gyrAΔS83突變[16]均可引起相應耐藥菌株的適應性降低，導致其在缺乏抗生素的情況下，競爭力弱于敏感的野生型菌株，無法在細菌種群中持續(xù)存在[15，20]。然而發(fā)生補償突變的耐藥菌株可通過恢復適應性和毒力重獲競爭優(yōu)勢。如適應性降低的耐FQ的淋病奈瑟菌株通過多藥外排泵MtrCDE的mtrR-79補償性突變[18]、耐FQ的大腸埃希菌通過額外突變gyrA（D87Y/D87N/A119E）均可促進其適應性增強[16]。此外，在傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)，在無抗生素壓力條件下，gyrA和parC耐藥突變菌株比敏感菌株有適應優(yōu)勢，而且由于基因的協(xié)同上位性，雙突變體菌株比所有單突變體菌株的適應性高，說明抗性基因之間的協(xié)同上位性可能是增強菌株適應性、促進耐藥菌株進化和流行的一個關鍵因素[21]。

1.2 外排泵對耐藥菌適應性的影響

革蘭陰性菌的膜上有許多外排泵，這些泵作為一個三方系統(tǒng)存在，可通過高水平表達輸送不止一種類型的抗生素，成為腸桿菌科耐喹諾酮類藥物和多藥耐藥性（MDR）出現(xiàn)的重要機制之一[26-27]。目前，屬于RND超家族的AcrAB-TolC，是與喹諾酮耐藥有關且研究較為清楚的外排泵。AcrAB-TolC高水平的表達，不僅能將小分子物質(zhì)（代謝物、染料、洗滌劑、有機溶質(zhì)和膽鹽）從細菌細胞中轉(zhuǎn)運出來，還可在膽汁酸條件下，增強菌株的耐藥性和適應性[22-23]。而且在喹諾酮藥物選擇壓力下，含QRDR突變和外排泵過表達的耐藥鼠傷寒沙門菌比僅有QRDR突變的耐藥腸炎突變菌更具有適應性優(yōu)勢，說明細菌可通過結(jié)合外排泵和染色體的靶基因突變增強耐藥菌適應性[24]（表1）。此外，針對外排泵協(xié)同細菌生物膜促進細菌耐藥和增強適應性的現(xiàn)象，可通過外排泵抑制劑PAβN，阻斷相關QS信號分子跨膜通道的轉(zhuǎn)運，抑制其對菌株耐藥的促進作用[28-29]。

1.3 外膜滲透性對耐藥菌的適應性影響

細菌外膜滲透率大小主要取決于細菌菌株種類、所用的抗菌劑和生物膜的生長條件[30]，其對菌株耐藥的促進作用表現(xiàn)為孔道蛋白相關基因的缺失或突變，引起菌體外膜通透性下降，阻礙抗菌藥物的進入而實現(xiàn)。如沙門菌通過下調(diào)OmpF的表達使膜孔蛋白缺失而對恩諾沙星產(chǎn)生低水平耐藥[31]。同時，外膜滲透性的改變會影響細菌適應性[32]。如在Helix-turn-Helix（HTH）家族調(diào)節(jié)劑（包括AraC/XylS 家族）和雙組分系統(tǒng)（TCS）的調(diào)節(jié)下，通過外排轉(zhuǎn)運蛋白表達增加和/或孔蛋白表達減少，促使外膜滲透性降低，延遲抗生素的攝入而促使革蘭陰性菌耐藥性、適應性和毒力增強，有效說明外膜滲透性在細菌適應環(huán)境壓力中起作用[25]（表1）。

2 質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥與細菌適應性之間的關系

PMQR機制主要有：編碼DNA結(jié)合蛋白對靶點產(chǎn)生保護的qnr基因、引起氟喹諾酮失活的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶變體aac（6'）-Ib-cr和排泄疏水性氟喹諾酮類藥物的QepA 和 OqxAB 等主動外排泵（由 qep、oqxA 和 oqxB 基因編碼）[33]（圖1， C），而CRISPR基因編輯技術有助于解決臨床菌株的抗性基因?qū)毦退幮缘拇龠M作用（圖1， D）。PMQR基因雖然只引起低水平的喹諾酮耐藥，但PMQR基因之間的相互累加效應或與染色體突變位點的共同作用可促進菌株達到臨床耐藥水平[34-35]，并在一定條件下降低或增強宿主菌的適應性，影響包括喹諾酮類藥物在內(nèi)的許多抗菌藥物的有效性。此外，Oladeinde等[36]發(fā)現(xiàn)沙門菌暴露在酸性pH條件下可促進耐藥質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移和菌株適應性增強，為今后從環(huán)境入手改變細菌適應性來控制喹諾酮耐藥性的發(fā)展提供新的角度。

2.1 PMQR基因?qū)δ退幘m應性的影響

PMQR耐藥機制常見的組合是aac（6'）-Ib-cr-oqxAB和qnrB-aac（6'）-Ib-cr-oqxAB[35]，在PMQR 決定簇中acc（6'）-Ib-cr基因的流行率較高，其次是qnrB、oqxAB和qnrS[37]。目前qnr基因介導腸桿菌科適應性研究主要集中在qnrA、qnrB和qnrS基因（表2）。蘭芳俊等[38]通過重組質(zhì)粒方式發(fā)現(xiàn)qnrA、qnrB和qnrS的存在會促使耐藥菌的生長速率和最大細胞密度增強，而這三種qnr基因增強耐藥菌適應性的效果卻無明顯差別，這也在Kaplan等[39-40]的研究中得到證實（表2）。然而，攜帶qnr基因的質(zhì)粒大小不一，那質(zhì)粒的大小不同又是否會影響菌體適應性呢？對于這個問題，Kaplan與San[40-41]已證明質(zhì)粒大小不會影響耐藥菌的適應性（表2）。此外，在沒有喹諾酮類藥物的情況下，具有和不具有 aac（6'）-Ib-cr 基因的菌株之間的倍增時間和最大生長速率沒有顯著差異，但在環(huán)丙沙星暴露下，攜帶aac（6'）-Ib-cr基因的菌株具有明顯的適應性優(yōu)勢[42]。外排泵qepA和oqxAB的過度表達，可在無藥物選擇壓力下，降低菌株適應性[16]，

但從臨床大腸埃希菌分離株獲得的qepA1基因可與無活性I類整合子融合創(chuàng)造的新調(diào)節(jié)單元，不僅使qepA1的表達受環(huán)丙沙星的控制，還可減輕qepA1產(chǎn)生的適應性代價[43]。

2.2 PMQR基因與染色體突變組合對耐藥菌適應性的影響

PMQR基因也常結(jié)合染色體突變進一步影響耐藥菌的適應性。Machuca等[17]通過將qnr基因轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌，發(fā)現(xiàn)qnr基因與染色體自發(fā)突變構成的一到四個抗性突變組合均可增強菌株適應性（表2）。而將外排泵基因qepA2轉(zhuǎn)入到含不同染色體突變的大腸埃希菌中，發(fā)現(xiàn)qepA2基因與gyrA（Ser83Leu和/

或Asp87Asn）和/或parC（Ser80Arg）突變菌株結(jié)合會產(chǎn)適應性代價，但通過marR基因的缺失可得到補償，并促使耐藥菌的適應性和MPC均增加[13]（表2）。同樣，在含gyrB F458V和/或A468P和/或gyrAΔS83突變的OqxAB陽性菌株中發(fā)現(xiàn)，雖然適應性減弱，但當額外突變gyrA D87Y出現(xiàn)時適應性和耐FQ均增強[16]（表2）。此外，無論體內(nèi)體外，當aac（6'）-Ib-cr結(jié)合染色體上的4或5個突變位點時不僅促進細菌耐環(huán)丙沙星，還可增強細菌適應性[42]（表2），進一步說明PMQR基因與染色體突變的一些特定組合會對耐藥菌適應性產(chǎn)生重要影響。

2.3 PMQR基因與多重耐藥性（MDR）

PMQR決定簇常存于腸桿菌科細菌的多藥耐藥質(zhì)粒中，與其他耐藥基因關聯(lián)促進菌株多重耐藥性（MDR）的產(chǎn)生。已發(fā)現(xiàn)acc（6'）-Ib-cr、QRDR突變和qnr基因在多重耐藥肺炎克雷伯菌中的共存頻率很高[44]，而且aac（6'）-Ib-cr與blaCTX-M-15、qnr與 SHV或blaCTX-M-9的密切聯(lián)系均會促進菌株的MDR，而且aac（6'）-Ib-cr和blaCTX-M-27基因的共存會促進菌株適應性和生物被膜形成能力增強，對健康和經(jīng)濟造成相當大的負擔[45-48]。此外，耐氟喹諾酮類藥物的多重耐藥菌的適應性變化可能是ST特異性的[20]，但對于PMQR基因?qū)Χ嗨幠退幘唧w的適應性影響的研究還是相對較少，相信這將是未來的一個重要研究方向，并對解決耐喹諾酮類藥物的現(xiàn)狀提供新的視角。

3 適應性的研究方法

耐藥菌的相對適合性，是決定其在種群和其他環(huán)境中進化成功的關鍵參數(shù)?，F(xiàn)如今隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展，對細菌適應性的測量主要是從兩方面進行，一方面是從細菌的適應性代價入手，另一方面是從細菌的補償性突變進行。

3.1 適應性代價的測量

細菌適應性代價的衡量主要有兩種方法：①實驗性方法；②構建數(shù)學模型，具體是在流行病學大數(shù)據(jù)的基礎上，將抗生素的使用量和耐藥菌株頻率的變化構建一個函數(shù)關系來實現(xiàn)對適應性代價的判斷[50]。對于前者又分為兩種：a：生長曲線，通過比較耐藥突變型菌株和缺乏該突變的野生型菌株之間的生長速度差異來評價適應性（圖2a）；b：在體外（圖2b）或小鼠胃腸道定植模型中進行的體內(nèi)（圖2c）競爭性實驗。將耐藥突變菌株與野生型菌株共培養(yǎng)，通過監(jiān)測野生型菌株和耐藥突變菌株隨時間推移的菌數(shù)變化來衡量適應性，菌株計數(shù)高的則代表適應性強[50]。對于攜帶耐藥質(zhì)粒細菌的適應性代價測量公式[51]為1-WB/P，WB/P=ln（Nf，B/P/Ni，B/P） / ln（Nf，B/Ni，B），其中WB/P表示質(zhì)粒攜帶菌的相對適應性，Ni，B/P和Nf，B/P 表示競爭前后質(zhì)粒攜帶菌的密度，Ni，B和Nf，B表示競爭前后野生型菌的密度。然而，體外測量的結(jié)果可能無法完全反映臨床環(huán)境中的情況，基于此楊焰學者已提出可結(jié)合臨床研究和流行病學的綜合數(shù)據(jù)來評價細菌的適應性代價，并且對于小的適應性效應，可通過數(shù)學模型和計算機預測相結(jié)合的競爭分析方法來測量。

3.2 適應性補償突變的分析

耐藥菌可通過代償突變快速適應和進化，導致轉(zhuǎn)移速率、毒力、生存能力增強。目前已發(fā)現(xiàn)存在兩種補償突變：染色體突變和質(zhì)粒突變。染色體突變是通過細菌分裂垂直遺傳，但質(zhì)粒突變既可垂直也可水平遺傳，而且能降低質(zhì)粒到達新宿主細胞的初始成本。因此對細菌進行適應性補償突變分析時，不僅要先判斷適應性補償突變是否發(fā)生，還要分析補償突變是來源質(zhì)粒/染色體或兩者。

DelaFuente[51]等已描述了一個進化實驗判斷是否存在適應性代償突變。具體是將攜帶進化質(zhì)粒的進化菌株（Be/Pe）和攜帶原始質(zhì)粒的野生型菌株（B/P）在LB培養(yǎng)基中繁殖10 d后，第一步測量Be/Pe相對于B/P的相對適合度：若WBe/Pe/B＞W(wǎng)B/P/B，則說明由質(zhì)粒產(chǎn)生的成本可能被補償或菌株對實驗條件產(chǎn)生了普遍適應，后者與適應性補償無關。因此第二步判斷是否存在適應性代價補償：通過將Be/Pe中的質(zhì)粒去除，將Be/Pe菌株與無質(zhì)粒的對應物Be進行競爭實驗后，計算Be/Pe菌株的適應性代價：1-WBe/Pe/Be，如果最終Be/Pe的適應性代價小于B/P菌株的，則說明菌株發(fā)生適應性補償突變。一旦適應性補償而且得到確認，就可調(diào)查其來源。DelaFuente等[51]是構建兩株菌株（將進化質(zhì)粒（Pe）結(jié)合到野生型細菌（B）得到新菌株B/Pe和將原始質(zhì)粒（P）結(jié)合到進化的無質(zhì)粒細菌（Be）得到新菌株Be/P）進行競爭實驗，通過判斷不同菌株的適應性代價大小判斷補償?shù)钠鹪础Ｆ渲蠦/Pe的適應性代價為：1-WB/Pe/B、Be/P的適應性代價為：1-WBe/P/Be，若前者小于后者則說明適應性代價的補償突變來源于質(zhì)粒，反之則來源于細菌染色體，但要注意也可能是二者同時產(chǎn)生[51]。此外，一旦對補償?shù)钠鹪催M行了表型研究，下一步就可通過基因組測序和轉(zhuǎn)錄組學分析從分子層面進一步確定補償突變和相關適應性代價的來源。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，目前國內(nèi)外不少學者對耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的適應性變化進行分析，發(fā)現(xiàn)在革蘭陰性菌耐喹諾酮類藥物肆虐的今天，與耐藥菌適應性相關的適應性代價和補償性進化的變化，主要取決于與染色體和/或可移動元件攜帶的與喹諾酮類藥物相關的特定耐藥基因的變化。本綜述發(fā)現(xiàn)耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的不同耐藥機制造成耐藥形式更加復雜的情況下，對耐藥菌適應性變化的影響主要表現(xiàn)為：增強或減弱。同時，針對細菌適應性的降低可減弱耐藥菌的傳播速度和毒力，已有學者說明利用此機制有望逆轉(zhuǎn)細菌的耐藥性[13]，所以本綜述的分析不僅有助于補充細菌耐藥監(jiān)測和細菌適應性有關的喹諾酮耐藥機制研究，還促進我們依據(jù)適應性降低有關的耐藥機制來設計新型喹諾酮類藥物。

此外，上述分析也為以后學者的研究提供以下借鑒：①耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的適應性代價和補償與耐藥菌或抗生素的種類有無直接關系，假如存在，其作用的機理如何？②細菌耐喹諾酮類藥物的機制和傳播受地理區(qū)域差異的影響[52]，那耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的適應性變化是否也受特定區(qū)域的影響？③耐喹諾酮類藥物基因的普遍存在與臨床日益嚴重的MDR存在一定聯(lián)系，但目前PMQR基因?qū)Χ嘀啬退幐锾m陰性菌適應性影響的研究相對較少。我們堅信隨著科學技術尤其是與分子生物學相關技術的不斷進步，這些疑問在被解決的同時，一定會探索出更高效的策略去阻遏或控制與喹諾酮類藥物相關的耐藥菌的發(fā)展。

參 考 文 獻

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